核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所楊銀輝核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病1核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)2核酸等溫擴(kuò)增的優(yōu)勢核酸等溫擴(kuò)增的優(yōu)勢3核酸等溫擴(kuò)增的種類核酸等溫擴(kuò)增的種類4環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）5LAMP引物設(shè)計原則LAMP引物設(shè)計原則6LAMP擴(kuò)增引物設(shè)計LAMP擴(kuò)增引物設(shè)計7LAMP擴(kuò)增過程LAMP擴(kuò)增過程8核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件9環(huán)引物在莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)處識別并不斷延伸，使雙鏈過早打開，有利于復(fù)雜莖環(huán)結(jié)構(gòu)的成環(huán)和外引物置換作用。這一定程度上加速了整個LAMP擴(kuò)增循環(huán)階段的反應(yīng)。環(huán)引物在莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)處識別并不斷延伸，使雙鏈過早打開，有10LAMP的操作過程LAMP的操作過程11檢測方法檢測方法12LAMP技術(shù)在病原體檢測中的應(yīng)用LAMP技術(shù)在病原體檢測中的應(yīng)用13核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件14LAMP技術(shù)小結(jié)LAMP技術(shù)小結(jié)15LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)16存在缺陷所識別的靶位序列長度不得過大，一般在300bp以內(nèi)。因此，無法進(jìn)行長片段DNA的擴(kuò)增；

LAMP技術(shù)具備高靈敏度，對操作要求嚴(yán)格分區(qū)，否則極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；

LAMP的反應(yīng)結(jié)果只有兩種即擴(kuò)增與不擴(kuò)增，故在產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增時是難以進(jìn)行后續(xù)鑒定的；產(chǎn)物相當(dāng)復(fù)雜，無法進(jìn)行后續(xù)的回收、鑒定、克隆等基因工程操作。存在缺陷所識別的靶位序列長度不得過大，一般在300bp以17核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件18核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件19核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件20核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件21核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件22NASBA的優(yōu)缺點(diǎn)NASBA是種RNA擴(kuò)增法，因此其主要應(yīng)用是對RNA病毒的檢測。整個反應(yīng)能在42℃條件下進(jìn)行，經(jīng)過兩個小時的擴(kuò)增可將模板RNA放大至109~1010倍。靈敏度高、特異性強(qiáng)、保真度高。反應(yīng)成分復(fù)雜、需要三種酶導(dǎo)致成本偏高、須重復(fù)加入逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶。NASBA的優(yōu)缺點(diǎn)NASBA是種RNA擴(kuò)增法，因此其主23滾環(huán)放大(rolling

circleamplification,RCA)技術(shù)基于滾環(huán)只有在單鏈閉合狀態(tài)并有相應(yīng)引物存在下才能同溫滾動復(fù)制的原理?；谶B接酶連接、引物延伸與鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的一種等溫核酸擴(kuò)增方法。在恒溫的條件下,可以產(chǎn)生大量的與環(huán)型探針互補(bǔ)的重復(fù)序列。RCA反應(yīng)體系組成：

噬菌體φ29DNA聚合酶、單鏈環(huán)狀DNA模板和引物（一條或一對也可多條）。

噬菌體φ29DNA聚合酶具備很強(qiáng)的鏈置換活性，無需模板分離，酶性穩(wěn)定，可連續(xù)數(shù)小時高效催化合成DNA。滾環(huán)放大(rolling

circleamplificat24RCA的擴(kuò)增原理RCA的擴(kuò)增原理25SAT技術(shù)實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（SimultaneousAmplificationandTesting，簡稱SAT）是將新一代的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸（RNA）的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴(kuò)增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴(kuò)增循環(huán)情況。SAT技術(shù)實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（Simultaneo26SAT技術(shù)的原理SAT技術(shù)（SimultaneousAmplificationandTesting）是基于TMA（Transcriptionmediatedamplification）恒溫擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展起來的一項最新核酸檢測技術(shù)，是國內(nèi)企業(yè)自主研發(fā)的專利技術(shù)SAT技術(shù)的原理SAT技術(shù)（SimultaneousAmp27SAT技術(shù)的優(yōu)勢針對靶標(biāo)核酸特異設(shè)計的引物和分子信標(biāo)，實現(xiàn)特異性的擴(kuò)增和檢測，有效防止假陰性結(jié)果。

SAT檢測的靶標(biāo)核酸是RNA，而RNA在病原體外的環(huán)境中易降解，檢測結(jié)果可作為區(qū)分死菌、活菌的依據(jù)，因此更利于用藥之后療效的監(jiān)測和判愈。

SAT技術(shù)的高靈敏度、高特異性則可以最大程度地確保檢測結(jié)果的高度準(zhǔn)確，高度可靠，有效避免假陽性、假陰性結(jié)果。SAT技術(shù)的優(yōu)勢針對靶標(biāo)核酸特異設(shè)計的引物和分子信標(biāo)，實現(xiàn)特28IMSA擴(kuò)增IMSA擴(kuò)增29IMSA擴(kuò)增的原理IMSA擴(kuò)增的原理30IMSA擴(kuò)增的原理IMSA擴(kuò)增的原理31核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件32核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件33核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件34IMSA擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)IMSA不僅擁有LAMP檢測技術(shù)類似的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)，在引物設(shè)計和擴(kuò)增原理上還具有其獨(dú)有的特點(diǎn)，使得其具備比LAMP更高檢測靈敏度的潛力。該技術(shù)一定程度上能打破日本LAMP專利在我國的應(yīng)用限制，使其更好地服務(wù)于我國的傳染病防控、食品安全檢測和環(huán)境物種保護(hù)等各個領(lǐng)域。IMSA擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)IMSA不僅擁有LAMP檢測技術(shù)類似35RPA技術(shù)RPA技術(shù)36RPA（recombinasepolymeraseamplification）技術(shù)，2006年由劍橋大學(xué)的OlafPiepenburg等人建立。該技術(shù)利用一種重組酶使單鏈引物與雙鏈DNA模板中互補(bǔ)片段結(jié)合，啟動DNA復(fù)制；不需要DNA解鏈過程。其具有便攜，免去PCR儀等大型實驗室設(shè)備的使用；快速，20分鐘內(nèi)得到檢測結(jié)果；靈敏度高，幾個拷貝即可檢出；便于保藏，采用凍干粉末狀酶等優(yōu)點(diǎn)。近年來，各國學(xué)者陸續(xù)利用RPA技術(shù)，對于DNA病毒、細(xì)菌等進(jìn)行核酸檢測。

RPA技術(shù)簡介RPA（recombinasepolymeraseamp37RPA的原理RPA的原理38tetrahydrofuranabasic–sitemimic(THF)四氫呋喃非堿基位點(diǎn)類似物tetrahydrofuranabasic–sitemi39核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件40BasicRPAexoRPAlateral-flow

strip結(jié)果觀察：BasicRPAexoRPAlateral-flows41引物、探針設(shè)計引物、探針設(shè)計42核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件43RPA技術(shù)的缺點(diǎn)嚴(yán)格專利保護(hù)反應(yīng)成分復(fù)雜對臨床標(biāo)本的檢測效果較差RPA技術(shù)的缺點(diǎn)嚴(yán)格專利保護(hù)44核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所楊銀輝核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病45核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)46核酸等溫擴(kuò)增的優(yōu)勢核酸等溫擴(kuò)增的優(yōu)勢47核酸等溫擴(kuò)增的種類核酸等溫擴(kuò)增的種類48環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）49LAMP引物設(shè)計原則LAMP引物設(shè)計原則50LAMP擴(kuò)增引物設(shè)計LAMP擴(kuò)增引物設(shè)計51LAMP擴(kuò)增過程LAMP擴(kuò)增過程52核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件53環(huán)引物在莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)處識別并不斷延伸，使雙鏈過早打開，有利于復(fù)雜莖環(huán)結(jié)構(gòu)的成環(huán)和外引物置換作用。這一定程度上加速了整個LAMP擴(kuò)增循環(huán)階段的反應(yīng)。環(huán)引物在莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)處識別并不斷延伸，使雙鏈過早打開，有54LAMP的操作過程LAMP的操作過程55檢測方法檢測方法56LAMP技術(shù)在病原體檢測中的應(yīng)用LAMP技術(shù)在病原體檢測中的應(yīng)用57核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件58LAMP技術(shù)小結(jié)LAMP技術(shù)小結(jié)59LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)60存在缺陷所識別的靶位序列長度不得過大，一般在300bp以內(nèi)。因此，無法進(jìn)行長片段DNA的擴(kuò)增；

LAMP技術(shù)具備高靈敏度，對操作要求嚴(yán)格分區(qū)，否則極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；

LAMP的反應(yīng)結(jié)果只有兩種即擴(kuò)增與不擴(kuò)增，故在產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增時是難以進(jìn)行后續(xù)鑒定的；產(chǎn)物相當(dāng)復(fù)雜，無法進(jìn)行后續(xù)的回收、鑒定、克隆等基因工程操作。存在缺陷所識別的靶位序列長度不得過大，一般在300bp以61核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件62核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件63核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件64核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件65核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件66NASBA的優(yōu)缺點(diǎn)NASBA是種RNA擴(kuò)增法，因此其主要應(yīng)用是對RNA病毒的檢測。整個反應(yīng)能在42℃條件下進(jìn)行，經(jīng)過兩個小時的擴(kuò)增可將模板RNA放大至109~1010倍。靈敏度高、特異性強(qiáng)、保真度高。反應(yīng)成分復(fù)雜、需要三種酶導(dǎo)致成本偏高、須重復(fù)加入逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶。NASBA的優(yōu)缺點(diǎn)NASBA是種RNA擴(kuò)增法，因此其主67滾環(huán)放大(rolling

circleamplification,RCA)技術(shù)基于滾環(huán)只有在單鏈閉合狀態(tài)并有相應(yīng)引物存在下才能同溫滾動復(fù)制的原理?；谶B接酶連接、引物延伸與鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的一種等溫核酸擴(kuò)增方法。在恒溫的條件下,可以產(chǎn)生大量的與環(huán)型探針互補(bǔ)的重復(fù)序列。RCA反應(yīng)體系組成：

噬菌體φ29DNA聚合酶、單鏈環(huán)狀DNA模板和引物（一條或一對也可多條）。

噬菌體φ29DNA聚合酶具備很強(qiáng)的鏈置換活性，無需模板分離，酶性穩(wěn)定，可連續(xù)數(shù)小時高效催化合成DNA。滾環(huán)放大(rolling

circleamplificat68RCA的擴(kuò)增原理RCA的擴(kuò)增原理69SAT技術(shù)實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（SimultaneousAmplificationandTesting，簡稱SAT）是將新一代的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸（RNA）的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴(kuò)增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴(kuò)增循環(huán)情況。SAT技術(shù)實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（Simultaneo70SAT技術(shù)的原理SAT技術(shù)（SimultaneousAmplificationandTesting）是基于TMA（Transcriptionmediatedamplification）恒溫擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展起來的一項最新核酸檢測技術(shù)，是國內(nèi)企業(yè)自主研發(fā)的專利技術(shù)SAT技術(shù)的原理SAT技術(shù)（SimultaneousAmp71SAT技術(shù)的優(yōu)勢針對靶標(biāo)核酸特異設(shè)計的引物和分子信標(biāo)，實現(xiàn)特異性的擴(kuò)增和檢測，有效防止假陰性結(jié)果。

SAT檢測的靶標(biāo)核酸是RNA，而RNA在病原體外的環(huán)境中易降解，檢測結(jié)果可作為區(qū)分死菌、活菌的依據(jù)，因此更利于用藥之后療效的監(jiān)測和判愈。

SAT技術(shù)的高靈敏度、高特異性則可以最大程度地確保檢測結(jié)果的高度準(zhǔn)確，高度可靠，有效避免假陽性、假陰性結(jié)果。SAT技術(shù)的優(yōu)勢針對靶標(biāo)核酸特異設(shè)計的引物和分子信標(biāo)，實現(xiàn)特72IMSA擴(kuò)增IMSA擴(kuò)增73IMSA擴(kuò)增的原理IMSA擴(kuò)增的原理74IMSA擴(kuò)增的原理IMSA擴(kuò)增的原理75核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件76核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件77核酸等溫擴(kuò)增楊銀輝課件78IMSA擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)IMSA不僅擁有LAMP檢測技術(shù)類似的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)，在引物設(shè)計和擴(kuò)增原理上還具有其獨(dú)有的特點(diǎn)，使得其具備比LAMP更高檢測靈敏度的潛力。該技術(shù)一定程度上能打破日本LAMP專利在我國的應(yīng)用限制，使其更好地服務(wù)于我國的傳染病防控、食品安全檢測和環(huán)境物種保護(hù)等各個領(lǐng)域。IMSA擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)IMSA不僅擁有LAMP檢測技術(shù)類似79RPA技術(shù)RPA技術(shù)80RPA（recombinasepolymeraseamplification）技術(shù)，2006年由劍橋大學(xué)的OlafPiepenburg等人建立。該技術(shù)利用一種重組酶使單鏈引物與雙鏈DNA模板中互補(bǔ)片段結(jié)合，啟動DNA復(fù)制；不需要DNA解鏈過程。其具有便攜，免去PCR儀等大型實驗室設(shè)備的使用；快速，20分鐘內(nèi)得到檢測結(jié)果；靈敏度高，幾個拷貝即可檢出；便于保藏，采用凍干粉末狀酶等優(yōu)點(diǎn)。近年來，各國學(xué)者陸續(xù)利用RPA技術(shù)，對于DNA病毒、細(xì)菌等進(jìn)行核酸檢測。

RPA技術(shù)簡介RPA（recombinasepolymera