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DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T3479—2018蘋果苗木傳帶病蟲害檢測與防控技術規(guī)范Technicalspecificationfordetectionandcontrolofnurseryappletree-transmittedpests2018-12-29發(fā)布 2019-01-29實施山東省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB37/T3479DB37/T3479—2018II前??言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實施。本標準由山東省農(nóng)業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：青島農(nóng)業(yè)大學。本標準主要起草人：李保華、王彩霞、董向麗、張振芳、練森、原永兵、劉成連、周濤、曹洪建、任洪春。DB37/T3479DB37/T3479—2018PAGEPAGE7蘋果苗木傳帶病蟲害檢測與防控技術規(guī)范范圍準，及病毒檢測、病蟲害防控和苗傳病蟲害檢測的技術。本標準適用于山東省蘋果苗木繁育期間，隨苗木傳帶病蟲害的防控。規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T2281蘋果病毒檢測技術規(guī)范術語和定義規(guī)范性引用文件確立的以及下列術語和定義適用于本標準。3.1苗傳病蟲害(SeedlingTransmittedPests)輪紋病、蘋果綿蚜、根癌病等。3.2病毒與類病毒（AppleVirusandViroid）造成樹體生長發(fā)育不良和嚴重危害的病毒與類病毒，包括銹果類病毒(ASSVd)、壞死花葉病毒(ApNMV)、凹果類病毒(ADFVd)、褪綠葉斑病毒(ACLSV)、莖溝病毒(ASGV)和莖痘病毒(ASPV)六種。3.3非潛隱病毒（Non-LatentVirus）在常規(guī)栽培品種上，能造成明顯癥狀和嚴重危害的病毒或類病毒，主要為銹果類病毒(ASSVd)、壞死花葉病毒(ApNMV)和凹果類病毒(ADFVd)三種。3.4潛隱病毒（LatentVirus）(ACLSV)、莖溝病毒(ASGV)和莖痘病毒(ASPV)三種。3.5無病毒材料（Virus-FreeMaterial）2年～3的繁殖材料或苗木。3.6非脫毒材料（NonVirus-FreeMaterial）指沒有經(jīng)過脫毒處理，不潛帶有非潛隱病毒，但帶有不超過一種潛隱病毒的繁殖材料或苗木。3.7外源病蟲害（ExternalSourcePests）從育苗圃或采穗圃外隨氣流、雨水、昆蟲傳入，或主動遷入，并在苗木上侵染定殖的各種病蟲害。3.8本源病蟲害（LocalSourcePests）或采穗圃內(nèi)定殖的病蟲害。苗圃地選擇選擇沒有交叉感染病蟲害或病蟲害交叉感染率低的環(huán)境，沒有病菌或病菌少的地塊培育蘋果苗木，保持育苗圃清潔衛(wèi)生。苗圃位置與地塊以上，且近5年沒有栽植林木及苗木。育苗圃宜選擇開闊通風、灌溉與排水條件良好、土壤肥沃地塊作育苗地。周圍5km范圍內(nèi)不能有檜柏等刺柏科植物。及時銷毀廢棄的苗木、接穗、病蟲栽體、病殘體等，始終保持育苗圃清潔衛(wèi)生。育苗材料擴繁之前檢測或檢查所有繁育材料，發(fā)現(xiàn)帶有苗木傳帶病蟲害的材料，及時清除。種子從健康、無毒的母本樹上采集。采種前對采種母本樹進行病毒檢測，發(fā)現(xiàn)帶毒母株及時清除。采穗圃原種和一級母本樹應每年檢測一次，非脫毒材料每2年～3年檢測一次，及時清除不符合標準的材料。材料獲取脫毒材料；或篩選含容易脫除病毒的植株，進行脫毒處理，獲得無毒材料或非脫毒材料。病毒檢測樣品采樣時期4月～5月份，蘋果萌芽至新梢生長期是采集病毒檢測樣品的最佳時期。單株樣品采集單株樣品檢測主要用于篩選無毒或非脫毒材料。生長期從旺盛生長的新梢頂端摘取2cm～3cm的嫩芽或嫩梢，每株3個～4個。休眠期剪取20cm～30cm長的枝條，每株1個～2個，或直接剝?nèi)?.5cm長的皮層5塊～6混合樣品采集1個2cm～3cm長的嫩芽，休眠季節(jié)每株剪取1個20cm～30cm以取樣單元為單位密封于塑料袋中，標記取樣單元、取樣時間、地點、采集人等信息。保存與運輸用0℃～4(280檢測順序再檢測非潛隱病毒，逐步篩選出無毒材料。篩選非脫毒材料時，首先檢測非潛隱病毒，淘汰帶毒材料后，再檢測非潛隱病毒。檢測策略與方法檢測單株樣品時，可將多個樣品混合檢測，發(fā)現(xiàn)樣品帶毒時，再逐個檢測，最終找出帶病毒植株。檢測混合樣品時，可分成多個樣品檢測。RT-PCR檢測技術按附錄A的方法進行，免疫學檢測和生物學檢測按NY/T2281的規(guī)定進行。病蟲害防控蘋果苗木繁育期，重點防控腐爛病、輪紋病、蘋果綿蚜和根部病害。剪口處理保的油漆作為基質(zhì)，混入有效成份為0.3%～0.5嫁接后處理冬春季室內(nèi)嫁接的苗木，嫁接后立即噴淋有效成份含量為0.03%～0.05%的吡唑醚菌酯或0.3%～0.5%甲基硫菌靈藥液。根部處理苗木栽植前，用根部處理劑或1%的硫酸銅溶液等對細菌高效的殺菌劑浸泡根部5min～10min后，立即栽植。本源病蟲害3%～2%多量式波爾多液或95%機油乳劑80倍～100倍藥液等。生長季節(jié)，外源病蟲害周邊5km類、褐斑病、白粉病、銹病、炭疽葉枯病等。蘋果綿蚜于5月、6月份和9月、10月份綿蚜遷飛期，用誘蟲板監(jiān)測遷飛成蟲，發(fā)現(xiàn)有綿蚜遷入時，及時噴撒殺蟲劑。若綿蚜已在苗圃內(nèi)定殖，用藥劑灌根或樹上噴藥徹底鏟除。輪紋病和腐爛病雨水少的季節(jié)或年份，結合其他病害防治噴施殺菌劑；遇雨量大于10mm，持續(xù)時間長于24h雨，雨后及時噴施內(nèi)吸性殺菌劑。多雨季節(jié)或連續(xù)陰雨期，每7d～10d劑和保護性殺菌劑交替使用。出圃苗木檢測與處理苗木分檢與處理起苗后剔除染有病蟲和生長不良的苗木，用苗木處理劑處理苗木，或用有效成份為0.03%～0.05吡唑醚菌酯或0.3～0.50.05%～0.10.3～0.5h～48h。苗木質(zhì)量檢測隨機選取20株～50株苗木，每3株～5株一組栽植于直徑40cm～50cm、深度40cm～50cm的花盆中，澆足水后，移入溫度為20℃～30附 錄 A（資料性附錄）反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測原理RT-PCR是將RNA和cDNAcDNA30～40的凝膠上觀察到特異性條帶。試劑Trizol試劑：由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，苯酚飽和液（38%）--380ml/L，硫氰酸胍鹽（0.8M）--118.16g/L，硫氰酸銨（0.4M）--76.12g/L，醋酸鈉（0.1M，pH5）--33.4ml/L，甘油50ml，加水補充至1L。無RNA180℃烘烤60.01體積/體積加入，處理過夜后高壓滅菌而得到。75RNA酶滅菌水和無水乙醇配置。氯仿，異戊醇，異丙醇、無水乙醇，反轉錄酶，DNA聚合酶，DNA分子量標準，瓊脂糖。儀器設備2.5μl～1000μlRNA酶0.2ml～1.5ml離心管和10μl～1000μl槍頭，PCR擴增儀，紫外分光光度計，凝膠成像體系，電泳槽和電泳儀。操作步驟總RNA的提取按照Trizol法提取總RNA提取試劑盒提取總50mg～100mg蘋果組織置于1.5ml離心管中，用液氮研磨成粉末，加入1mlTrizol試劑，注意樣品總體積不能超過所用Trizol10研磨液室溫放置5min，然后每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15s，4℃下，12000r/min離心10min；取上層水相于一新的離心管，加入等體積異丙醇，室溫放置10min，12000r/min離心10min；棄去上清液，加入1ml的707500r/min5min；5min～10RNA的溶解度。將RNA溶于DEPC55℃～6010RNARNA可進行mRNA分離，或貯存于7070核酸檢測利用紫外分光光度計檢測提取的總RNAO26/28>1.8D26≈40μg/mlRA，RNA（μgm）=測得OD值×40。cDNA合成以5μg總RNA為模板，以六堿基隨機引物為引物，參照M-MLV反轉錄酶產(chǎn)品說明書反轉錄成cDNA一般為20μl的反轉錄體系：10μmol/l隨機引物1.0μl，10mmol/l的dNTPs1.0μl，RNA酶抑制劑0.5U/μlM-MLV酶0.5處理無菌水補足至20μl4213min，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增檢測所用引物見表A.1，PCR反應體系為25μl：反轉錄產(chǎn)物cDNA1.0μl，10×Buffer2.5μl，10mmol/ldNTPs0.5μmol/l正向引物和20μmol/l反向引物各0.5U/μl的TaqDNA聚合酶0.25μl，加滅菌雙蒸水至25μl。PCR反應條件為：953min；9530s，對應引物退火溫度（表A.1）復性30s，7230s，35個循環(huán)；最后725min。表A.1用于蘋果病毒或類病毒RT-PCR病毒名稱序列（5′～3′）目標片段/bp退火溫度/℃蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)F:GAGARTTTCAGTTTGCTMGAR:AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT79453蘋果莖溝病毒(ASGV)F:GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCCR:CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC50059蘋果莖痘病毒(ASPV)F:TGCCTCAAAGTACACCCCTCAGTR:CGCCAAGAAATGCACAGC31658蘋果壞死花葉病毒(ApNMV)F:ATGGTGTGCAATCGCTGTCAR:CATCGACCATAAGGATATCA64050蘋果銹果類病毒(ASSVd)F:CCGGTG