輔

助

生

殖

技

術(shù)人工授精、試管嬰兒、克隆技術(shù)輔助生殖技術(shù)不孕不育—輔助生殖研究發(fā)展史第一節(jié)人工授精第二節(jié)體外受精+胚胎移植第一代試管嬰兒第二代試管嬰兒第三代試管嬰兒第四代試管嬰兒第三節(jié)生殖工程引發(fā)的倫理問題

為什么要進行輔助生殖？

當新生命的起點——受精卵形成后，受精卵一邊向子宮移動，一邊開始卵裂，最終到達子宮內(nèi)壁的某處并植入子宮內(nèi)膜，即著床。共經(jīng)歷270天左右的孕育，胎兒分娩出世——一個新生命就這樣誕生了。

影響精、卵結(jié)合的因素很多，比如排卵后，卵子僅在6~24小時內(nèi)保持有受精能力；精子進入女性生殖道內(nèi)，一般也僅在1~2天內(nèi)維持有受精能力；男性每次射出精液量應(yīng)是3~4毫升，而每毫升中精子數(shù)應(yīng)在2000萬~1億，如果精子過少，受精機會顯著下降；精子中必須要有60%以上形態(tài)正常，并且有運動能力；精子還必須在陰道、子宮、輸卵管內(nèi)獲得能量，方能到達輸卵管上端與卵子受精，等等。不孕癥婚后兩年、有正常的性生活，未采取任何避孕措施而未曾受孕者。調(diào)查顯示：生育力正常的夫婦不避孕1年內(nèi)妊娠率為80%~90%；2年的妊娠率為93%~95%。治療方法之一：輔助生殖技術(shù)據(jù)統(tǒng)計，造成不孕癥有30%是男方原因，30%是女方原因，還有40%的原因在男女雙方。

不孕癥是一種常見病。在不同國家和不同年代差別很大。1988年美國國家中心統(tǒng)計15~44歲育齡夫婦中，不孕癥發(fā)病率為8.4%；到20世紀90年代就上升到10%左右。中國內(nèi)地2.3億育齡夫婦中約有5%~8%存在不能生育問題，而且每年還以40萬對左右速度增加，并有上升趨勢。在中國臺灣約有14%夫婦由于種種疾病不能生育，或在懷孕上存在不可克服的困難。

輔助生殖發(fā)展簡史

200年前，JohnHunter用注射器將一位尿道下裂的丈夫的精液注入妻子的陰道內(nèi)懷孕。1953年，第一例冷凍精子人工授精成功，但人工授精技術(shù)一直到70年代才廣泛應(yīng)用于臨床1983年，我國首個利用冷凍精子人工授精嬰兒出生。1978年，世界第一例試管嬰兒LouisBrown在英國劍橋大學誕生，開創(chuàng)體外授精治療不孕新的里程碑。1988年，我國第一例試管嬰兒出生第一節(jié)人工授精人工授精：收集丈夫或自愿獻精者的精液，由醫(yī)師注入女性生殖道以達到受孕目的的一種技術(shù)。解決男性不育的主要方法必須具備的三個條件：足夠數(shù)量和活力的精子正常的排卵至少一條輸卵管通暢和功能正常一、分類

依據(jù)精液來源分為：夫精人工授精（AIH）：使用丈夫精子供精人工授精（AID）：自愿獻精者的精子依據(jù)操作方法：子宮人工授精：宮腔內(nèi)授精、宮頸內(nèi)授精、陰道內(nèi)授精輸卵管內(nèi)精液灌注：是人工授精的一種新方法二、接受人工授精婦女的條件有規(guī)則的月經(jīng)周期有正常排卵輸卵管必須通暢生殖器官無嚴重疾患三、供精人工授精（AID）供精者的選擇挑選體力和智力俱佳的已婚青壯年男性仔細檢查精液質(zhì)量，排除一切遺傳病和性傳播性疾病供方與受方不相識兼顧供者血型、身高、膚色及頭發(fā)顏色是否與患者丈夫一致四、人工授精治療程序（一）精液的采集和處理逆行射精者：采精前每4小時服碳酸氫鈉1克，使尿液pH值達到7.2~7.7，排空尿液，沖洗膀胱，誘導(dǎo)排精，取膀胱內(nèi)容物，離心濃縮至1ml立即進行人工授精精液量及精子少的患者：多采集幾次濃縮后進行人工授精精液不液化：授精前加糜蛋白酶或胰蛋白酶使之液化精子活力差：加入咖啡因，終濃度為7.2mmol/L,提高精子活力，提高精子受精能力。曾捐精200余次的鮑比·蓋拉多特

2008年首位懷孕變性人托馬斯-比提孕前照片2008年6月２９日生下了一名漂亮女嬰。蘇珊

2008年１１月1４日再度懷孕有的家庭中，丈夫的生殖能力正常，但妻子因輸卵管阻塞而不孕，這樣的問題該怎樣解決呢？現(xiàn)實中的問題

1978年7月25日深夜時分，英國曼徹斯特郊外的奧德姆總醫(yī)院里，一個女嬰的啼哭聲劃破夜空，震撼了世界……她就是世界上第一例試管嬰兒——路易斯.布朗。試管嬰兒是近２０余年逐步發(fā)展起來的以體外受精－胚胎移植為中心的一系列技術(shù)方法及理論，使人們能更深入地了解受精及人體胚胎的發(fā)育機制，并為不孕、不育癥以及預(yù)防遺傳病提供新的途徑。一、第一代試管嬰兒技術(shù)即常規(guī)的體外授精-胚胎移植(IVF-ET)

主要解決女性因素的不育。主要應(yīng)用于：①雙側(cè)輸卵管缺如或完全阻塞，估計治療效果差或經(jīng)治療無效者；②行宮腔內(nèi)人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④需要贈卵，并有受孕的其它基本條件者。此項技術(shù)于1976年創(chuàng)立于英國，世界和中國的第一例試管嬰兒分別于1978年和1988年誕生。三、第三代試管嬰兒技術(shù)

即胚胎移植前的遺傳學診斷技術(shù)(PGD)顯微注射技術(shù)雖然提高了試管嬰兒技術(shù)的成功率，但也加大了胎兒畸形的風險。在前兩代技術(shù)的基礎(chǔ)上，對植入前的胚胎進行篩選，選擇健康、正常、無遺傳性疾病(優(yōu)生)的胚胎植入子宮內(nèi)。這一技術(shù)和顯微注射技術(shù)的聯(lián)合運用，被稱為第三代試管嬰兒技術(shù)。主要適應(yīng)用于：遺傳性疾病、遺傳高危夫婦。

世界和中國的第一例第三代試管嬰兒分別于1990和1999年誕生。四、第四代試管嬰兒技術(shù)，

即核移植技術(shù)

通俗地講，就是克隆人。但存在兩個問題：操作時帶入外源DNA、受體細胞線粒體遺傳。另外，需要指出的是隆人已經(jīng)不是傳統(tǒng)意義上的試管嬰兒，它只是男方或女方某一方的復(fù)制品，而不是精子和卵子結(jié)合的產(chǎn)物。

隨著國外克隆羊(多利)的誕生，2002年2月中國誕生了克隆?！，F(xiàn)在，克隆人已經(jīng)不存在技術(shù)問題，存在的只是倫理道德問題。美國科學家于2001年10月首次成功克隆出早期人類胚胎，立即招來了許多抨擊。國際社會討論通過一項“關(guān)于禁止克隆人的國際公約”，公約將規(guī)定除非由于醫(yī)治某種疾病(不孕癥除外)，否則不能進行克隆人研究一、常規(guī)試管嬰兒培養(yǎng)技術(shù)——第一代試管嬰兒

體外授精-胚胎移植術(shù)：體外讓卵子與精子結(jié)合形成受精卵，在體外繼續(xù)培養(yǎng)8細胞左右，再將胚胎重新移植到母親子宮中，繼續(xù)發(fā)育生長直至足月分娩。主要解決女性因素的不育（一）主要適應(yīng)癥和禁忌癥適應(yīng)癥：①輸卵管病變所致不孕：雙側(cè)輸卵管缺如或完全阻塞；②行宮腔內(nèi)人工授精3-6次未受孕者；③不明原因不孕者；④子宮內(nèi)膜異位癥不孕；適應(yīng)癥：⑤無排卵或黃素化卵泡未破裂綜合征；⑥子宮頸病變，阻礙精子進入；⑦一方生殖細胞缺如；⑧子宮發(fā)育異?；蛉比?；

⑨選擇性生育。禁忌癥：①年齡：40歲以上不適于IVF；②過度肥胖者；③高催乳素血癥造成的不孕；④嚴重的盆腔粘連者。

（二）卵子的收集1、獲得可受精卵的方法①自然周期法：②藥物誘發(fā)超數(shù)排卵法：③誘發(fā)排卵常用藥物及其作用機制克羅米酚、人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）、FSH2、采卵的方法①腹腔鏡手術(shù)取卵②超聲波導(dǎo)向采卵3、卵子成熟度的判定從理論上講，成熟的卵母細胞在排卵前已完成第一次成熟分裂，第一極體的排出是卵成熟的標志。經(jīng)驗性評估卵母細胞成熟度的方法①根據(jù)卵丘細胞的伸展度②依據(jù)卵泡的大?、鄹鶕?jù)卵丘細胞內(nèi)脂肪顆粒多少④根據(jù)卵-放射冠-卵丘復(fù)合體的特點成熟型：直徑3~5mm或更大，卵丘細胞之間距離大，放射冠分散，透明帶可見。未成熟型：直徑1~1.5mm，緊密放射冠，看不清透明帶成熟的卵母細胞未成熟卵母細胞（三）精子的準備1、精液的采集與人工授精相同2、精液分析形態(tài)、細菌、免疫、細胞遺傳學關(guān)于精子受精能力的評價：①保持直線性向前運動能力的精子受精能力強②正常精子多而畸形精子少，受精能力強穿卵實驗陽性，受精能力強3、精液的加工處理目的：洗滌精子、去除精漿、增強精子活力、精子獲能穿卵實驗陽性（四）體外授精及體外培養(yǎng)1、孵育卵細胞：使卵母細胞在體外進一步成熟2、檢查精子活力，調(diào)節(jié)精子濃度3、體外授精：向孵育好的卵細胞中加入適量精子5~10萬4、換液培養(yǎng)：人工受精后14~16h觀察，如出現(xiàn)雌、雄原核，卵周隙有第二極體，表明受精成功，隨后將受精卵轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，使其卵裂并發(fā)育，以便適時施行胚胎移植。（五）胚胎移植(ET)與妊娠監(jiān)護

ET是試管嬰兒試驗中的最后一步，也是最重要一關(guān)1、胚胎的移植：2~16細胞（卵裂球）時移植；2~4胚胎/次2、妊娠監(jiān)護：放射免疫方法檢測血、尿中

hCG（促絨毛膜性腺激素）6天：血中hCG升高，8天：尿中hCG升高3周：超聲檢查胚囊位置，5周：胚胎大小和胎心波動3、影響ET的因素：①移植時，母體子宮內(nèi)膜與胚泡發(fā)育不同步；②穿刺取卵時黃體受損，使黃體功能不足；③移植過程中，胚泡損傷或子宮內(nèi)膜損傷（六）“試管嬰兒”的成功率

1、成功率：體外受精率：85%~90%卵裂率（體外培養(yǎng)成功率）：80%胚胎移植后妊娠率：20%~25%2、畸形發(fā)生率：1987~1991年總計出生6248例試管嬰兒，有某種畸形的新生兒187例，占總數(shù)的2.8%。這與自然妊娠分娩的新生兒畸形發(fā)生率相當。

如果妻子的生育能力正常，但因丈夫產(chǎn)生的精子少或精子活力差而造成的不孕，應(yīng)該采用什么輔助生殖技術(shù)呢？二、胞漿內(nèi)單精注射——第二代試管嬰兒

主要目標：幫助精子穿過透明帶

單精胞漿注射(顯微授精技術(shù))透明帶鉆孔技術(shù)（PZD）

透明帶下授精（SUZI）

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）針對男性少、弱、畸精癥或阻塞性無精癥（一）顯微授精技術(shù)發(fā)展簡史1962年Hiramoto首次將海膽精子直接注入海膽卵中1966年Graham將青蛙精子注入未受精的蛙卵中，PN形成1988年第一個通過精子微注射受精的子代動物（小鼠）誕生1988年lanzendorf等人報道人精子直接注入卵胞漿PN形成1992年P(guān)alermo等人報道卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）嬰兒誕生1996年我國首例ICSI在中山醫(yī)科大學獲得成功（莊廣倫－李蓉）（二）胞漿內(nèi)單精注射

IntracytoplasmicSpermInjection

(ICSI)定義：指用顯微操作術(shù)將單個精子注入卵胞漿的過程適應(yīng)癥：①嚴重精子質(zhì)量異常②既往常規(guī)IVF失敗患者③嚴重的抗精子抗體患者④無精子癥患者⑤未成熟卵以及冷凍保存的卵母細胞⑥常規(guī)IVF失敗未受精卵母細胞ICSI操作程序促排卵和卵子的采集卵子體外培養(yǎng)精子的采集及處理顯微注射①精子制動②卵胞漿內(nèi)精子注入③放開卵母細胞，培養(yǎng)16~24h4~8-細胞或囊胚后，移植母體子宮中影響ICSI成功的主要因素ICSI成功與否主要看受精、卵裂及妊娠率，除技術(shù)因素外，徑自、卵子狀態(tài)及卵子激活等都直接影響其成功。①顯微操作技術(shù)對ICSI的影響體外操作過程不超過5分鐘注射針內(nèi)徑5~8微米之間固定針外徑120微米，內(nèi)徑15~40微米②精子狀態(tài)對ICSI的影響影響ICSI成功的主要因素

③卵子對ICSI的影響卵子狀態(tài)卵母細胞成熟程度女性年齡影響卵子質(zhì)量卵子激活以放出第二極體、形成雌雄原核為標志并最終啟動卵子代謝的一系列變化

形態(tài)檢查

B超間接診斷方法檢查母體生化指標直接診斷方法胎兒細胞三、產(chǎn)前診斷著床前遺傳病診斷技術(shù)（PGD）PGD：指對植入前的胚進行診斷，排除遺傳病的一項新技術(shù).當子代處于可遺傳的遺傳異常危險中時，可應(yīng)用PGD對胚進行篩選，應(yīng)用此項技術(shù)誕生的嬰兒被稱為第三代試管嬰兒優(yōu)點：防止產(chǎn)前診斷終止妊娠給患者帶來的身心痛苦PGD發(fā)展簡史1966年Edwards提出PGD的思想1987年Verlinsky提出4-細胞胚胎遺傳學診斷模型1988年Li對單個精子和體細胞進行可遺傳學分析1989年P(guān)CR技術(shù)首先引入PGD，成功鑒定人類性別1990年對X-連鎖隱性遺傳病的夫婦進行PGD誕生第一例經(jīng)PGD后的健康女嬰1992年對單個基因相關(guān)遺傳病進行PGD，獲成功1994年對染色體病和年齡相關(guān)的染色體非整倍性檢測1996年染色體平行易位攜帶者進行PGD，接受治療后，誕生正常三胞胎PGD常適用于不同時期受精前：第一極體做為活檢材料卵裂期：卵裂球做為活檢材料囊胚期：滋養(yǎng)外胚層細胞做為活檢材料PGD常用的檢測方法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

熒光原位雜交（FISH）

PGD適應(yīng)癥X-連鎖隱性遺傳病單基因相關(guān)遺傳病染色體病高齡婦女非整倍性檢測

理論上，只要有足夠的序列信息，能針對任何遺傳條件開展PGDPGD診斷程序診斷時期及取樣方法1、配子時期精子選擇：性染色體非整倍性50~100%卵子選擇：常染色體非整倍性80%通過檢測第一、第二極體的遺傳學分析，可推測卵子內(nèi)遺傳物質(zhì)狀況，達到診斷目的。

優(yōu)越處：不影響胚胎發(fā)育；診斷時間早，沒有錯過移植時間的危險胚胎時期

PGD多選擇在卵裂期，即體外受精3天后，6~10-細胞時期進行。實驗證明：從卵裂期胚胎中活檢取出25%細胞，并不影響其正常發(fā)育，活檢成功率可達97%。

將胚胎置于顯微操作儀上，用固定針固定胚胎，用預(yù)先裝載了酸性Tyrodes的打孔針在透明帶上消化打孔，再用取球針經(jīng)孔進入透明帶內(nèi)吸拉出單個卵裂球。

單個細胞的遺傳學分析細胞遺傳學診斷

取出的活檢細胞經(jīng)3：1甲醇/冰醋酸固定，制作染色體樣本，

FISH技術(shù)檢測分析。

例如有一位母親是血友病基因的攜帶者，她自己雖然不發(fā)病，但是，她的兩個兒子都是血友病患者，接連不幸夭折。這位悲傷的母親來到試管嬰兒中心，要求給她做試管嬰兒。醫(yī)生考慮到她的情況，決定給她做“第三代”試管嬰兒。隨后就是取卵、人工授精等等步驟。當受精卵分裂到4—8個細胞時，取出其中的一個細胞進行診斷：對于胚卵是XY型，將來能發(fā)育為男子的就淘汰了；而胚卵是XX型（即將來發(fā)育為女兒）的則進行移植。試驗成功了，一個健康的女嬰來到人間。按照遺傳學法則，這個女嬰雖然和她媽一樣，也是血友病基因的攜帶者，但不會發(fā)病，將是一個“健康”的女孩。

可見，“第三代”試管嬰兒是優(yōu)生的保證。它把婦科的產(chǎn)前診斷，提前到胚胎尚未著床時，這對于患有遺傳病或有遺傳疾病傾向的婦女、高齡孕婦是很有必要的。單個細胞的遺傳學分析分子細胞遺傳學診斷

間期多色FISH技術(shù)，可以進行多條染色體細胞遺傳學分析

染色體數(shù)目異常

X、Y、21、13、18這五條染色體數(shù)目異常占新生兒染色體數(shù)目異常的95%染色體結(jié)構(gòu)異常

全染色體涂染探針

Genebank獲取與易位重接點相關(guān)的DNA序列,標記后制備易位攜帶者特異性探針

植入前胚胎性別鑒定

Y染色體或X、Y染色體特異探針進行性別分析

四、細胞核移植技術(shù)----第四代試管嬰兒是指將發(fā)育不同時期的胚胎或成體細胞核經(jīng)顯微手術(shù)和細胞融合方法移植到去核卵母細胞中，或?qū)Ⅲw細胞核直接注入去核卵母細胞中，重新組成胚胎并使之發(fā)育成子代個體。克隆技術(shù)之所以引人關(guān)注，是因為它在醫(yī)療和畜牧業(yè)方面有深遠意義輔助生殖技術(shù)引起的倫理學問題一、代孕是否合法代孕是否合法是做試管嬰兒中倫理爭論焦點。在體外受精-胚胎移植中，接受移植的小胚胎、并生下足月嬰兒的婦女，并不一定必須是嬰