1、1延邊大學醫(yī)學院細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室張子波11延邊大學醫(yī)學院12教 材：醫(yī)學細胞生物學 主 編：楊康鵑 鄭立紅出版 社：人民軍醫(yī)出版社 22教 材：醫(yī)學細胞生物學 23參考書：1.醫(yī)學細胞生物學 主 編：胡以平 出版社：高等教育出版社，20092.醫(yī)學細胞與分子學基礎 主 編：陳仁彪 出版社：上?？茖W出版社，200333參考書：3第1章 緒 論4第1章 緒 論45細胞生物學(cell biology)： 從細胞水平（整體、亞微結構、分子）探討生命活動規(guī)律的科學。第一節(jié) 細胞生物學研究內容、發(fā)展及其分科醫(yī)學細胞生物學(medical cell biology)： 運用細胞生物學的理論和方

2、法，研究人體的細胞的形態(tài)結構和功能等生命活動規(guī)律和人類疾病發(fā)生、發(fā)展及其防治的科學。55細胞生物學(cell biology)：第一節(jié) 細胞生物6對象：細胞（cell，生命活動的基本單位）構成生物有機體代謝與功能生物有機體生長發(fā)育遺傳（遺傳全能性）細胞是基本單位一、細胞生物學研究的內容66對象：細胞（cell，生命活動的基本單位）構成生物有機體細研究水平： 細胞整體、亞微結構、分子水平利用光鏡描述細胞的結構利用電鏡或掃描探針探清細胞的亞微或分子結構 形態(tài)方面研究任務：7研究水平：利用光鏡描述細胞的結構 形態(tài)方面研究任務：78化學組成新陳代謝規(guī)律相互關系和相互作用生命活動的基本規(guī)律人類疾病產生機

3、制防治疾病的方法和技術功能方面88化學組成功能方面891.組織工程：又稱“再生醫(yī)學”，指利用生物活性物 質，通過體外培養(yǎng)或構建的方法，再造 或修復器官及組織的技術。 可再造：骨、軟骨、皮膚、腎、肝、消化道、角膜、 肌肉、乳腺2.干細胞(stem cell)：是來源于胚胎、胎兒或成體內 具有在一定條件下無限制自我更新與增殖分化能力的 一類細胞，能夠產生表現(xiàn)型與基因型和自己完全相同 的子細胞，也能產生組成機體組織、器官的已特化的 細胞，同時還能分化為祖細胞。991.組織工程：又稱“再生醫(yī)學”，指利用生物活性物93.治療性復制人類胚胎（治療性人類克隆胚胎）： 利用成年人的皮膚細胞制造胚胎材料，移植入

4、 人體，代替人體的損壞或患病部分。治療：糖尿病、帕金森病、阿爾茨海默病(老年癡呆癥）2004年8月11日英國人類受精和胚胎技術管理局給英國紐卡斯爾大學的研究人員發(fā)放了“治療性復制人類胚胎”的執(zhí)照成為歐洲首家允許治療性復制人類胚胎的國家。4.生物制藥與醫(yī)用生物學產品：應用生物體活細胞 產生從簡單分子到復雜蛋白質等一系列生物制 藥與醫(yī)用生物學產品。 例如：干擾素、白介素、胰島素等103.治療性復制人類胚胎（治療性人類克隆胚胎）：1011二、細胞生物學的發(fā)展歷史(一)細胞的發(fā)現(xiàn)和細胞學說的創(chuàng)立(四)分子生物學的發(fā)展(二)經典細胞學的發(fā)展(三)實驗細胞學的發(fā)展1111二、細胞生物學的發(fā)展歷史(一)細胞

5、的發(fā)現(xiàn)和細胞學說的創(chuàng)立12細胞學說細胞學說（cell theory） ：細胞是一切生物體構造和功能上的基本單位，整個機體是由細胞和細胞的產物所組成。1212細胞學說細胞學說（cell theory） ：細胞是一切1313131314 Watson J D Crick FHC DNA雙螺旋結構A-TG-CC-GA-TT-AC-G1414 Watson J D5 Phe苯丙Leu亮Iso異亮起始密碼甲硫氨酸Val纈Ser絲Pro脯cThr蘇Ala丙Arg精Tyr酪His組Glu谷氨酰氨終止密碼終止密碼Try色Cys半光Ser絲Arg精Asp天冬酰氨Lys賴Asp天冬氨酸G

6、lu谷Gly甘 密碼子的中英文縮寫對照表16163 5 Phe苯丙Leu亮Iso異亮起始密碼1717171718基因突變的表型效應鐮狀細胞性貧血（AR）產生機制：珠蛋白基因第一外顯子第6密碼子突變異常血紅蛋白分子（HbS）GAG GTG 谷氨酸 纈氨酸正常血紅蛋白分子（HbA）1818基因突變的表型效應異常血紅蛋白分子（HbS）GAG 19基因診斷：PCR-RFLP診斷鐮狀細胞貧血父母患兒正常兒胎兒13kb7.6kb5.4kb基因型 HbAHbS HbSHbS HbAHbA ?HbSHbS1919基因診斷：PCR-RFLP診斷鐮狀細胞貧血父母患兒正常兒2020202021線粒體乳腺細胞核未受精

7、卵細胞去核卵細胞細胞融合培養(yǎng)妊娠148天2121線粒體乳腺細胞核未受精卵細胞去核細胞融合培養(yǎng)妊娠148天22三、細胞生物學的主要分支學科 細胞形態(tài)學（形態(tài)和功能） 細胞化學（化學成分定位、分布及生理功能） 細胞生理學（生命活動規(guī)律） 細胞遺傳學（染色體的結構功能） 分子細胞學（基因組的結構和功能） 細胞社會學（細胞識別、通訊及相互作用）2222三、細胞生物學的主要分支學科 細胞形態(tài)學（形態(tài)和功能）223一、細胞形態(tài)結構研究技術 （一）細胞顯微結構研究的技術與方法第二節(jié) 細胞生物學研究方法概述光學放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)機械和支架系統(tǒng)顯微結構2323一、細胞形態(tài)結構研究技術 （一24尼康E-600顯微鏡

8、1.復式顯微鏡 ： 單筒目鏡、雙瞳目鏡 最常用2424尼康E-600顯微鏡1.復式顯微鏡 ：242.暗視野顯微鏡： 利用被檢物所反射或衍射的光線來觀察標本 觀察細菌、原生動物或提純的細胞器等顆粒物質。252.暗視野顯微鏡：2526 細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。3.熒光顯微鏡尼康E800熒光DIC顯微鏡 2626 細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒27線粒體干細胞皮膚微管2727線粒體干細胞皮膚微管274.相差顯微鏡：

9、 利用光線通過不同物質所形成的反差來觀察標本觀察活細胞的細微結構和變化。284.相差顯微鏡：28鏈球菌形態(tài)29鏈球菌形態(tài)2930萊卡倒置顯微鏡 組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。5.倒置顯微鏡3030萊卡倒置顯微鏡 組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與316.共聚焦顯微鏡 無法用眼睛直接觀察，只能用探測器收集每個像素點的信號，再通過軟件重構圖像。 分辨率比普通顯微鏡有少量提高。31316.共聚焦顯微鏡 無法用眼睛直接觀察，只能用探測器32 電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，

10、用電磁場作透鏡。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機制作。電子顯微鏡的放大倍數最高可達近百萬倍，由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成。（二）細胞超微結構研究的技術與方法常用電子顯微鏡和X射線衍射儀。3232 電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同33JEM-1011透射電子顯微鏡 在光學顯微鏡下無法看清小于0.2m的細微結構，這些結構稱為亞顯微結構或超微結構。要想看清這些結構，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯

11、微鏡，電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達0.2nm。1.透射電子顯微鏡3333JEM-1011透射電子顯微鏡 在光學顯微鏡下無內質網透射電鏡圖34內質網透射電鏡圖3435 于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結構。其工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變?yōu)楣庑盘?，再經光電倍增管和放大器轉變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為

12、立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。 2.掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）3535 于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結構。36JEOL掃描電子顯微鏡3636JEOL掃描電子顯微鏡36人類血細胞SEM照片37人類血細胞SEM照片37（1）組織分離法（2）細胞培養(yǎng)法（3）超薄切片法（4）懸滴-復染法與噴鍍法（5）冷凍蝕刻復型法（6）放射性核素電競自顯影技術3.電鏡樣品的制備38（1）組織分離法3.電鏡樣品的制備38二、細胞培養(yǎng)及相

13、關技術（一）體外細胞培養(yǎng)技術（二）細胞融合技術（三）細胞顯微操作技術39二、細胞培養(yǎng)及相關技術（一）體外細胞培養(yǎng)技術（二）細胞融合技40三、細胞及亞細胞組分的分離和純化技術 （一）細胞化學免疫熒光技術細胞化學: 在保持細胞結構的基礎上，利用某些化學物質可與細胞內某些成分發(fā)生化學反應，在局部形成有色沉淀物的原理，以示待查物質存在于細胞中的部位。例如：Feulgen法顯示DNA4040三、細胞及亞細胞組分的分離和純化技術 41免疫細胞化學（immunocytochemistry）: 根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術?？乖捍蠓肿踊蚺c大分子相結合的小分子?？贵w：由

14、漿細胞針對特定的抗原分泌的球蛋白。 如果將抗體結合上標記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。4141免疫細胞化學（immunocytochemistry）:42（二）細胞顯微分光光度測定技術 根據細胞內某些物質對光譜吸收的原理，用以測定這些物質如核酸和蛋白質等生物大分子在細胞內的含量。吸收光譜的波長： 230 700nmFeulgen染色后的DNA吸收的波長：546nm細胞顯微分光光度測定技術：定位和定量4242（二）細胞顯微分光光度測定技術4243（三）流式細胞計量術（FCM） 用氬離子激光發(fā)出的激光束為激發(fā)光，通過調節(jié)液壓，迫使懸浮的細胞排成單列

15、，按重力方向流動，當細胞通過激光束檢測區(qū)時，細胞被激光束照射而向各個方向發(fā)出散射光，若經熒光染色的細胞，就會發(fā)出一定強度的熒光，儀器的檢測系統(tǒng)，就可逐個對細胞的散射光和熒光強度進行測定，并將光信號轉變成電信號，由電子控制臺放大和顯示。4343（三）流式細胞計量術（FCM）4344測量速度：5 000個細胞/s 8個相關參數分選出細胞純度：9099%檢測的參數：細胞大小、體積、DNA、RNA、總蛋白含量、表面抗原、受體、染色體等應用：細胞動力學、免疫學、體細胞學、腫瘤的診斷和治療等。流式細胞儀特點4444測量速度：5 000個細胞/s 8個相關參數流式細胞儀4545454546464646474

16、7474748（四）放射自顯影術（五）細胞器的分離與提純技術4848（四）放射自顯影術4849四、細胞分子生物學技術（一）細胞原位分子雜交技術分子雜交的基本原理：堿基的互補配對原位雜交（in situ hybridization）： 將細胞或組織切片固定在載玻片上，保持細胞中的 DNA和RNA在原位置條件下，與標記的 DNA或RNA分子探針進行原位雜交，通過放射性自顯影或顯微鏡可探測到待查材料中被雜交的分子。直接進行基因定位、定量分析。4949四、細胞分子生物學技術分子雜交的基本原理：堿基的互補配對50原位雜交的特點:雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標本上進行。所謂原位即指標本上DNA原位變性，

17、在利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針雜交后，通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強弱來確定探針的位置，從而進行準確的基因定位。原位雜交必須在已知探針的情況下方可進行，而在未知致病基因時，則無法進行基因定位。5050原位雜交的特點:雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標本上進行51熒光原位雜交（florescence in situ hybridization, FISH） 是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標記核酸（DNA）探針，可在染色體、細胞和組織切片標本上進行DNA雜交，對檢測細胞內DNA或RNA

18、的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是將熒光染料與抗體蛋白結合進行檢測。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的分辯率。5151熒光原位雜交5152固定生物樣本并準備顯微鏡涂片預先調節(jié)顯微鏡標記探針對目標DNA進行變性進行原位雜交和雜交后洗滌免疫細胞化學染色顯微鏡觀察熒光原位雜交（FISH）實驗程序（是一種多步驟的實驗方法）5252熒光原位雜交（FISH）實驗程序5253現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多色FISH技術近年來發(fā)展迅速，已成為基因定位作圖和醫(yī)學診斷的重要手段。1992年運用這種策略已能在中期染色體和間期細胞同時檢測7個探針?？?/p>

19、學家們的目標是實現(xiàn)24種不同顏色來觀察22條常染色體和X、Y染色體。5353現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交，顯示出不同的54912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技術檢測染色體易位5454912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技5555555556DNA探針技術1.是以已知DNA片段作為探針與待測樣品DNA或其片段進行核酸分子雜交，判斷二者同源性程度。2.根據雜交結果就可以分析待測DNA中有無該基因或該基因是否發(fā)生了變化，從而作出診斷。3.DNA探針（基因探針）是一段與目的基因相互補的核酸序列（DNA或RNA），其長度不一，可為完整基因亦可為其一部分

20、。4.探針：單鏈，帶有容易被追蹤和檢測出來的標記。5.寡核苷酸探針：單堿基改變的檢測。5656DNA探針技術5657目前可孕前診斷的單基因病 Prader-Willi綜合征(PWS)、性畸形(SRY基因診斷)、X染色體連鎖魚鱗病、Duchenne肌營養(yǎng)不良（DMD）、脆性X染色體綜合癥、地中海貧血、地中海貧血、脊髓性肌萎縮、肯尼迪氏綜合征及雄激素受體基因異常所致疾病、型粘多糖貯積癥、Marfan綜合征、血友病、視網膜母細胞瘤、無精子癥相關基因缺失診斷、成骨發(fā)育不全、Huntington舞蹈癥、Kallmann綜合征、遺傳性視神經萎縮、軟骨發(fā)育不全、苯丙酮尿癥、Wilson氏病、結節(jié)性硬化癥等。

21、5757目前可孕前診斷的單基因病 5758聚合酶鏈反應（PCR）： 利用耐熱的DNA聚合酶,以一對與模板DNA互補的寡核苷酸為引物，在體外模擬體內的DNA復制過程，即進行變性、退火和延伸三個階段（循環(huán)30次），使目的DNA擴增到約106個拷貝，既100百萬倍。優(yōu)點：快速、簡便、準確、可靠、經濟、特異性強等。 擴增倍數=2n（ n：擴增周期）PCR模板DNA取材：細胞、發(fā)根、精斑、血斑、已制備成的標本、木乃伊（二）聚合酶鏈反應技術5858聚合酶鏈反應（PCR）： （二）聚合酶鏈反應技術5859引物：能與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補的寡核苷酸（1520bp）上游序列： 5TTTGGAGGCAAGCAAGCA G 3PGC-1基因引物序列：擴增的DNA片段長度：508bp5TATTTAGGGTTTTGCCA