1、microRNA研究新思路- microRNA與三大熱點領(lǐng)域的聯(lián)合應用 2014康成生物KANGCHENExcellence for Research基因表達的調(diào)控： hnRNAmRNA mRNA蛋白質(zhì)失活mRNADNA細胞核細胞質(zhì)LncRNAmiRNAcircRNA講座內(nèi)容 microRNA 歷史的簡單回顧和現(xiàn)況介紹 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的聯(lián)合研究 microRNA和lncRNA的聯(lián)合研究 microRNA和DNA甲基化的聯(lián)合研究 康成生物研究平臺，實驗服務和數(shù)據(jù)分析康成生物技術(shù)服務歷史，發(fā)展和前景20062008200920102013201

2、4microRNA mRNA康成生物KANGCHENExcellence for ResearchExosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity. Jianhua Li， et al., NATURE IMMUNOLOGY 2013 (IF 26.008)Overexpression of miR-125b, a novel regulator of innate immunity, in eosinophilic chronic rhinosinusitis with nas

3、al polyps. Am J Respir Crit Care Med, 2012 (IF: 11.08)Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Li S., et al., Circulation, 2011 (IF 14.73)MiR-218 Inhibits Invasion and Metastasis of Gastric Cancer by Targeting the Robo1 Re

4、ceptorJun Tie., Yanglin Pan., et al. PLoS Genetics, 2010 (IF 8.69)Repression of the miR-17-92 cluster by p53 has an important function in hypoxia-induced apoptosis Hong-li Yan, Geng Xue, et al. The EMBO Journal, 2009 (IF 9.2)MicroRNA expression and regulation in mouse uterus during embryo implantati

5、on. Hu SJ, Ren G, Liu JL, et al. J Biol Chem., 2008 (IF 4.78)The muscle-specific microRNA miR-1 regulates cardiacarrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2 Baofeng Yang, Huixian Lin, Jiening Xiao, et al. NATURE MEDICINE, 2007 (IF 22.46)康成生物 microRNA 高通量技術(shù)服務 since 2006發(fā)表的SCI論文已超過70篇(平均IF5.5

6、)More papers please refer to 康成生物技術(shù)服務歷史，發(fā)展和前景200620082009201020132014microRNA lncRNA circRNA DNA甲基化 組蛋白修飾 DNA羥甲基化 TF結(jié)合 piRNA mRNA康成技術(shù)服務發(fā)表文章列表microRNA平臺和mRNA平臺同時使用：Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity. NATURE IMMUNOLOGY 2013 (IF: 26.008) lncRNA平臺：A Long N

7、oncoding RNA Activated by TGF-b Promotes the Invasion-Metastasis Cascade in Hepatocellular Carcinoma. Cancer Cell, 2014(IF: 24.755)MeDIP平臺：Exome sequencing identifies somatic mutation of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia. Nat. Genet, 2011(IF: 35.53) ChIP平臺：CRL4B Catalyzes

8、 H2AK119 Monoubiquitination andCoordinates with PRC2 to Promote Tumorigenesis. Cancer Cell, 2012. (IF: 24.755)microRNA基礎小分子RNA，大小約 22 nt miRBase 21.0, 2500個人的microRNAmicroRNA通過種子序列（seed region）與靶 mRNA的MRE（microRNA反應原件）結(jié)合，抑制翻譯或者降解mRNA 調(diào)控至少1/3的人類基因miRNA是臨床非常重要的biomarker；尤其在體液中的miRNA表達差異是重要研究目標講座內(nèi)容 mic

9、roRNA 歷史的簡單回顧和現(xiàn)況介紹 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的聯(lián)合研究 microRNA和lncRNA的聯(lián)合研究 microRNA和DNA甲基化的聯(lián)合研究 康成生物研究平臺，實驗服務和數(shù)據(jù)分析microRNA功能研究經(jīng)典思路 - microRNA和靶基因（mRNA）Nature Reviews Clinical Oncology 10, 643655 (2013)microRNA功能（細胞/組織水平）microRNA表達變化與隨之而來的表型變化調(diào)控機制（分子水平）癌microRNA 抑制腫瘤抑制基因調(diào)控機制（分子水平）腫瘤抑制microRNA抑制癌

10、基因microRNA作用機制研究：驗證靶基因: 報告基因?qū)嶒炓淮悟炞C一個靶基因Journal of Hepatology 2011 miR-135a 靶基因 - MTSS1 microRNA靶基因預測 報告基因?qū)嶒烌炞C靶基因microRNA芯片實驗由康成提供技術(shù)服務( IF:10.401)Huang and He (2011)難點：報告基因?qū)嶒?，一次只能驗證一個靶基因一個microRNA可能有很多個靶基因，每一個都要一次單獨的實驗驗證難點：報告基因?qū)嶒?，一次只能驗證一個靶基因miRNAs and target mRNAs in lung cancermiRNAs and target mRNA

11、s in colorectal cancermiR-126，在疾病不同階段，或不同腫瘤中，有不同的靶基因；每一個都要單獨驗證microRNA靶基因確定的難點：miRNA靶基因預測網(wǎng)站：TargetScan，miRanda，mirwalk，microRNA作用機制的重新思考：降解mRNA是主要的Lowered mRNA levels account for most (84%) of the decreased protein production mediated by miRNA regulation. These results show that changes in mRNA leve

12、ls closely reflect the impact of miRNAs on gene expression and indicate that destabilization of target mRNAs is the predominant reason for reduced protein output.Mammalian miRNAs exert functional roles mainly through mRNA cleavage !降解mRNA是microRNA調(diào)控靶基因的重要方式；可以通過表達譜芯片（RNA水平）來快速，高通量的篩選microRNA的靶基因micr

13、oRNA芯片和表達譜芯片聯(lián)合應用研究microRNA功能的思路實驗組 (n=6）Vs 對照組（n=6） 差異表達的microRNA和mRNA microRNA靶基因預測 microRNA和mRNA的表達相關(guān)性分析篩選microRNA-mRNA后續(xù)功能研究microRNA芯片表達譜芯片microRNA和靶基因聯(lián)合研究，平臺介紹 microRNAPlatformProducer高通量測序microRNA sequencingIllumina雜交芯片Exiqon microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM H

14、uman Cancer Focus miRNA PCR Array ArraystarmRNAPlatformProducer高通量測序microRNA sequencingIllumina雜交芯片Gene profiling microarrayAgilentPCR芯片Pathway Focused PCR panelQiagen康成生物技術(shù)服務：一站式from Sample to DatamicroRNA芯片和表達譜芯片聯(lián)合應用，數(shù)據(jù)分析淺藍色,圓形節(jié)點為靶基因紅色,方形節(jié)點為miRNAMolecular oncology 2013 (IF：5.935)miRNA-mRNA-network

15、microRNA芯片實驗由康成提供技術(shù)服務microRNA芯片和mRNA表達譜芯片聯(lián)合應用，案例 miR-135amiRNA芯片F(xiàn)OXM1調(diào)控miR-135a生物信息學Vs 表達譜 CHIP-PCR siRNA/過表達 FOXM1IHCmiR-135a Gain of function/Loss of function檢測增殖，凋亡，侵襲變化PT/PVTT sample ISH/ qPCRmiR-135a表達水平的相關(guān)性分析Kaplan-Meier 生存分析up-regulated in PVTTIn vitromiR-135a In vivoGain of function/Loss of

16、function檢測腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移miR-135a靶基因MTSS1靶基因預測 Vs 表達譜過表達miR-135a MTSS1 WB 報告基因?qū)嶒炁R床相關(guān)研究細胞和組織水平細胞和分子水平Real time PCRPVTT(門靜脈癌栓)PT（軟組織腫瘤）microRNA芯片和表達譜芯片實驗由康成提供技術(shù)服務Shupeng Liu., et al. Journal of Hepatology , 2011 ( IF:10.401) microRNA和靶基因聯(lián)合研究，平臺介紹 microRNAPlatformProducer高通量測序microRNA sequencingIllumina芯片Exiqo

17、n microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM Human Cancer Focus miRNA PCR Array ArraystarmRNAPlatformProducer高通量測序microRNA sequencingIllumina芯片Gene profiling microarrayAgilentPCR芯片Pathway Focused PCR panelQiagenPlatform for both miRNA & target mRNA profilingProducerHuman Can

18、cer Focus miRNA & Target mRNA PCR ArrayArraystarmiRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array一張PCR芯片，一次PCR實驗，同時檢測microRNA(184)和靶mRNA(178) microRNA表達和mRNA表達變化 & microRNA對靶基因的調(diào)控miRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array184個關(guān)鍵的腫瘤相關(guān)microRNAs 通過海量文獻和數(shù)據(jù)庫挖掘篩選 覆蓋主要腫瘤類型: lung, breast, prostate,

19、colorectal, gastric, ovarian, pancreatic, and liverCancer miRNAs184Spike-in Controls (SP)1Small nuclear or small nucleolar RNA reference controls (Ref)3Housekeeping miRNA controls5Cancer TypemiRNAsgastric cancer97liver cancer113ovarian cancer123colorectal cancer130pancreatic cancer139prostate cancer

20、140breast cancer157lung cancer156miRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array178 個靶基因(mRNA)，基于嚴格的篩選標準和海量研究結(jié)果篩選：Arraystar專門的microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫；至少有三個經(jīng)典數(shù)據(jù)庫支持，例如miRBase, miRanda和TargetScan等 ； 靶基因（mRNA）按照權(quán)重并排序，挑選出排名靠前的文章研究結(jié)果支持Nat Rev Cancer (2009) 9:293-302workflowSuperior performance: Tm normalization

21、optimalPCR TmTm normalization to ensure uniform and optimal performancemiRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array研究思路圖實驗組 (n=6）Vs 對照組（n=6） 差異表達的microRNA和mRNA microRNA和靶基因 microRNA和mRNA的表達相關(guān)性分析快速篩選microRNA-mRNA后續(xù)功能或機制研究miRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array講座內(nèi)容 microRNA 歷史的簡單回顧和現(xiàn)況

22、介紹 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的聯(lián)合研究 microRNA和lncRNA的聯(lián)合研究 microRNA和DNA甲基化的聯(lián)合研究 康成生物研究平臺，實驗服務和數(shù)據(jù)分析lncRNALonger than 200 ntRegulate gene expression： epigenetic control, transcriptional regulation,post transcriptional regulation microRNAsmall RNAs around 22 nt Targeting mRNA：translational repress

23、ion,mRNA degradationmicroRNA和lncRNA的聯(lián)合研究 microRNA sponge ceRNA人工合成microRNA sponge：研究microRNA功能的重要方法內(nèi)源性的microRNA sponge：非編碼RNA的重要功能Developmental Cell 2013Endogenous miRNA Sponge lincRNA-RoR Regulates Oct4, Nanog, and Sox2 in Human Embryonic Stem Cell Self-RenewalceRNA研究實例：OCT4和OCT4-pg4 in HCCCarcinog

24、enesis 2013ceRNA ：Competing endogenous RNA lncRNA和目標基因結(jié)合共同的microRNA lncRNA和目標基因的表達水平正相關(guān) microRNA表達是否受影響？OCT4-pg4 is abnormally activated in HCCOCT4-pg4 can upregulate OCT4 protein in HCCceRNA是非編碼RNA調(diào)控基因功能的重要方式Front.Genet. 2014.能夠發(fā)揮ceRNA作用的分子越來越多：lincRNA，circRNAmicroRNA芯片和lncRNA芯片聯(lián)合應用，思路實驗組 (n=6）Vs 對

25、照組（n=6） 差異表達的lncRNA，mRNA；microRNA lncRNA結(jié)合microRNA預測microRNA靶基因(mRNA)預測 mRNA和lncRNA的表達相關(guān)性分析篩選ceRNA（lncRNA-microRNA-mRNA）ceRNA研究microRNA芯片lncRNA芯片microRNA和lncRNA的聯(lián)合研究：平臺ncRNAPlatformProducer芯片Human LncRNA Array V3.0 ArraystarLncPath Pathway Focused LncRNA MicroarraysCircular RNA MicroarraysmicroRNAPl

26、atformProducer高通量測序microRNA sequencingIllumina芯片Exiqon microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM Human Cancer Focus miRNA PCR Array Arraystar康成生物技術(shù)服務：一站式from Sample to Data康成生物KANGCHENExcellence for ResearchmicroRNA和lncRNA的聯(lián)合研究：數(shù)據(jù)分析miRNAmRNAlncRNAlncRNA-microRNA-mRNA的ceRNA網(wǎng)

27、絡構(gòu)建講座內(nèi)容 microRNA 歷史的簡單回顧和現(xiàn)況介紹 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的聯(lián)合研究 microRNA和lncRNA的聯(lián)合研究 microRNA和DNA甲基化的聯(lián)合研究 康成生物研究平臺，實驗服務和數(shù)據(jù)分析DNA甲基化屬于表觀遺傳范疇表觀遺傳定義：在基因組序列不變的情況下，可以決定基因表達與否并可穩(wěn)定遺傳下去的調(diào)控密碼表觀遺傳-染色體水平： DNA 相關(guān)蛋白（組蛋白等）Rodriguez-Paredes.et al Nature Medicine 2011表觀遺傳：DNA甲基化和組蛋白修飾激活標志沉默標志甲基化 H3（K4、K36、K79）

28、H3（K9、K27）H4（K20）乙?；疕3（K9、K14、K18、K56）H4（K5、K8、K12、K56）H2B（K6、K7、K16、K17）甲基化 5mC抑制轉(zhuǎn)錄羥甲基化5hmC激活轉(zhuǎn)錄DNA修飾組蛋白修飾microRNA和mRNA，lncRNA一樣， 在轉(zhuǎn)錄水平受到表觀調(diào)控 主要是啟動子區(qū)域的調(diào)控microRNA與表觀遺傳的聯(lián)合研究思路1思路2 Cancers 2013 思路1：microRNA對表觀遺傳關(guān)鍵酶的調(diào)控胞嘧啶5甲基胞嘧啶5羥甲基胞嘧啶Int. J. Mol. Sci. 2013microRNA是核心分子思路1：microRNA-表觀遺傳關(guān)鍵酶受表觀調(diào)控的基因關(guān)鍵的micr

29、oRNADNA甲基化相關(guān)的酶DNA羥甲基化相關(guān)的酶組蛋白修飾相關(guān)的酶受甲基化調(diào)控的下游基因表觀調(diào)控基因表達芯片篩選microRNA思路1：Part2 表觀調(diào)控和mRNA聯(lián)合研究關(guān)鍵點：表觀遺傳關(guān)鍵酶的變化必然導致下游基因表達的變化思路1：Part1 microRNA和mRNA的聯(lián)合研究關(guān)鍵點：microRNA的靶基因是表觀遺傳關(guān)鍵酶microRNA靶基因思路2：腫瘤中的microRNA受到表觀調(diào)控DNA甲基化是主要的調(diào)控機制microRNA受到調(diào)控，表達變化思路2：表觀調(diào)控microRNA表達變化靶基因表達變化microRNA表達變化DNA甲基化DNA羥甲基化組蛋白修飾轉(zhuǎn)錄因子microRNA

30、靶基因思路2：Part1 表觀調(diào)控和microRNA表達聯(lián)合分析關(guān)鍵點： DNA水平的變化導致microRNA表達變化 不考慮microRNA（RNA）的表達變化， microRNA甲基化（DNA）可以作為Biomarker思路2：Part2 microRNA和mRNA聯(lián)合分析關(guān)鍵點：microRNA的表達變化導致下游靶基因表達變化思路2：腫瘤中的microRNA受到表觀調(diào)控腫瘤中miR-34b/c 與miR-148a啟動子發(fā)生高度甲基化miR-34b/c 與miR-148a表達下調(diào)恢復表達miR-34b/c 或miR-148a能抑制腫瘤發(fā)展PNAS. 2008應用：腫瘤中的microRNA甲

31、基化作為分子標記物J Gastroenterol 2014新進展：DNA羥甲基化（5hmC）和microRNA聯(lián)合研究- Song SJ. et al. 2013 Cell新進展：DNA羥甲基化（5hmC）和microRNA聯(lián)合研究- Song SJ. et al. 2013 Cell新進展：DNA羥甲基化（5hmC）和microRNA聯(lián)合研究表觀遺傳和microRNA的聯(lián)合研究：平臺表觀PlatformProducer基于測序MeDIP-sequencing（DNA甲基化）IlluminahMeDIP-sequencing（DNA羥甲基化）ChIP-sequencing（組蛋白修飾）基于芯片

32、MeDIP-chip（DNA甲基化）ArraystarhMeDIP-chip（DNA羥甲基化）ChIP-on-chip（組蛋白修飾）microRNAPlatformProducer高通量測序microRNA sequencingIllumina芯片Exiqon microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM Human Cancer Focus miRNA PCR Array Arraystar講座內(nèi)容總結(jié) 體液microRNA的biomarker研究 - 推進臨床檢驗應用 microRNA和mRNA的聯(lián)合

33、研究 - microRNA功能的快速篩查 microRNA和lncRNA的聯(lián)合研究 - 非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡 microRNA和DNA甲基化的聯(lián)合研究 - 調(diào)控microRNA的機制分析 康成生物研究平臺，實驗服務和數(shù)據(jù)分析Thanks for your attention!lncRNA-microRNA-mRNA構(gòu)成ceRNAlncRNA-ATB upregulated ZEB1 and ZEB2 by competitively binding the miR-200 family and then induced EMT and invasion.康成生物技術(shù)服務歷史，發(fā)展和前景2006

34、2009201020132014microRNA lncRNA circRNA DNA甲基化 組蛋白修飾 DNA羥甲基化 TF結(jié)合 piRNA mRNA測序PCR芯片 芯片基本芯片結(jié)果生物信息學分析：功能和標志物多平臺聯(lián)合分析lncRNA可以結(jié)合microRNAmiR-200 family repress EMT and tumor invasion by targeting the 3 UTRs of ZEB1 and ZEB2miR-200 family：miR-200a, miR-200b, miR-200c,miR-141, and miR-429lncRNA-microRNA-mRN

35、A構(gòu)成ceRNAlncRNA-ATB upregulated ZEB1 and ZEB2 by competitively binding the miR-200 family and then induced EMT and invasion.Cell 2013 lncRNA和目標基因結(jié)合共同的microRNA lncRNA和目標基因的表達水平正相關(guān) microRNA表達是否受影響？ceRNA ：Competing endogenous RNA microRNA與各個平臺聯(lián)合研究的說明 聯(lián)合研究的背景 聯(lián)合研究的思路 聯(lián)合研究的平臺 聯(lián)合研究的服務：數(shù)據(jù)分析 聯(lián)合研究的案例miRStar Human Cancer miRNA PCR Array一張PCR芯片，檢測184個關(guān)鍵的腫瘤相關(guān)microRNAs 通過