1、免疫層析法測(cè)定動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留王喜亮金秀娥李奎熊寧石德時(shí)畢丁仁【摘要】創(chuàng)立了動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留的免疫層析快速測(cè)定要領(lǐng)。用膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟磺胺嘧啶單克隆抗體作為顯色劑，磺胺嘧啶競(jìng)爭(zhēng)物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕捉試劑，接納競(jìng)爭(zhēng)反響形式制成膠體金免疫層析試紙。該免疫層析試紙可以在15in內(nèi)完成對(duì)磺胺嘧啶殘留的半定量檢測(cè)。讀條體系斷定敏捷度為5ng/l，肉眼斷定檢測(cè)限敏捷度為10ng/l，與別的磺胺類藥物無交織反響。該要領(lǐng)在差異動(dòng)物源性食品(雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、豬肝、牛奶、蜂蜜)中添加磺胺嘧啶的接納率在68.1%118.8%范疇內(nèi)。動(dòng)物試驗(yàn)樣品檢測(cè)結(jié)果表白，該要領(lǐng)與ELIS

2、A及HPL具有好的切合率。該要領(lǐng)敏捷度高,檢測(cè)正確、輕便、快速，有精良的開拓應(yīng)用遠(yuǎn)景。【關(guān)鍵詞】膠體金；免疫層析；磺胺嘧啶KEYRDSllidalgld;Iunhratgraphy;Sulfadiazine磺胺嘧啶(SD)是應(yīng)用普及的抗菌藥物之一，在畜牧業(yè)消費(fèi)中被普及應(yīng)用，但它有很多副作用。別的，恒久應(yīng)用很多細(xì)菌可對(duì)其產(chǎn)生抗藥性1。磺胺嘧啶的不公正利用將導(dǎo)致其在動(dòng)物源性食品中殘留，并通過食品鏈進(jìn)入人體，給人體康健帶來埋伏的威脅。我國(guó)以及美國(guó)、歐盟等國(guó)度劃定了動(dòng)物性食品中磺胺嘧啶的最高殘留限量(RLs)為0.1g/kg。如今檢測(cè)磺胺嘧啶殘留的常用要領(lǐng)重要是高效液相色譜法(HPL)2，3和酶聯(lián)免疫

3、吸附試驗(yàn)(ELISA)4，5，該要領(lǐng)敏捷、正確，但必要昂貴的裝備，必要專業(yè)職員操縱，并且操縱啰嗦，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，本錢高，推廣利用受到必然限定。免疫層析要領(lǐng)是一種新型的檢測(cè)要領(lǐng)，具有輕便、快速、正確、用度低和不必要專業(yè)職員操縱等長(zhǎng)處，實(shí)用于免疫學(xué)范疇中的快速檢測(cè)闡發(fā)。如今，該要領(lǐng)已被應(yīng)用于藥物殘留闡發(fā)68。針對(duì)磺胺嘧啶殘留檢測(cè)要領(lǐng)存在的缺陷及免疫層析要領(lǐng)的長(zhǎng)處，在本研究中我們利用免疫層析要領(lǐng)實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留的的快速檢測(cè)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要質(zhì)料1.2要領(lǐng)(3)膠體金顆粒的制備接納檸檬酸三鈉復(fù)原法11制備膠體金。取0.01%的氯金酸溶液100l，攪拌狀態(tài)下加熱至沸騰，參加1%的檸檬

4、酸三鈉2l，攪拌加熱15in，室溫冷卻后，安排4存放。(4)金標(biāo)抗體的制備10l膠體金，用0.1l/LK23溶液調(diào)其pH至8.0，在攪拌狀態(tài)下，參加必然量的抗SD單抗100g(將磺胺嘧啶單抗?jié)舛日{(diào)解到1g/l)，混勻，安排30in，參加2.5l5%的BSA，混勻，4安排1h，412000r/in離心30in，棄上清，將沉淀用pH9.0的硼酸緩沖液溶解至10l；重復(fù)離心洗滌兩次，沉淀用pH9.0的硼酸緩沖液稀釋至1l。用點(diǎn)膜儀將其勻稱的噴涂于玻璃纖維上，冷凍枯燥后，密封備用。(7)樣品預(yù)處置懲罰雞蛋樣品將雞蛋樣品勻漿，取2g樣品參加4l乙酸乙酯上、下振蕩3in，室溫5000r/in離心5in，取

5、300l上層液體80水浴蒸干或在氮?dú)饬飨麓蹈桑?50l0.01l/LpH7.4的PBS溶解殘留物。構(gòu)造樣品(雞肉、豬肉、肝臟等)將構(gòu)造樣品勻漿，取2g參加4l乙酸乙酯振蕩2in，室溫3000r/in離心5in，取300l上層液體于1.5l離心管中80水浴蒸干或在氮?dú)饬飨麓蹈?，?50l0.01l/LpH7.4的PBS解殘留物。牛奶樣品樣品經(jīng)3000r/in離心5in脫脂，汲取中層牛奶2l參加4l乙酸乙酯振蕩2in，室溫圖1膠體金試紙條表示圖3000r/in離心5in，取300l上層液體于1.5l離心管中80水浴蒸干或在氮?dú)饬飨麓蹈?，?50l0.01l/LpH7.4的PBS溶解殘留物。蜂蜜樣

6、品取1g蜂蜜樣品參加2l雙蒸水溶解，加2l乙酸乙酯上下振蕩2in，室溫3000r/in離心5in，取300l上層液體于1.5l離心管中80水浴蒸干或在氮?dú)饬飨麓蹈?，?50l0.01l/LpH7.4的PBS溶解殘留物。(8)樣品的檢測(cè)及結(jié)果斷定別離將120lSD空缺尺度品及待檢樣品依次參加微孔板孔中，將試紙插入微孔板孔中，反響1015in斷定結(jié)果。SD空缺尺度品試紙檢測(cè)線處出現(xiàn)赤色條帶；假設(shè)待檢樣品試紙檢測(cè)線出現(xiàn)與空缺尺度品檢測(cè)線相似的赤色條帶，說明樣品中未檢出SD，判為陰性；出現(xiàn)顯著淺于空缺尺度品檢測(cè)線顏色的淺赤色條帶，說明樣品中SD濃度在10100ng/g范疇內(nèi)，判為弱陽(yáng)性；假設(shè)待檢樣品試

7、紙檢測(cè)線無顏色出現(xiàn)，說明樣品中SD濃度大于100ng/g，判為陽(yáng)性；假設(shè)試紙比較線不出現(xiàn)赤色條帶，說明該試紙失效。(9)免疫層析法(IA)與ELISA及高效液相色譜法(HPL)的比力選擇康健“白來航蛋雞7只，隨機(jī)分成比較組(2只)和試驗(yàn)組(5只)。比較組飼喂不含磺胺類藥物的飼料，試驗(yàn)組飼喂含400g/kgSD的飼料12。試驗(yàn)期間，自由采食，自由飲水。試驗(yàn)組一連喂藥5d后停藥，停藥后一連網(wǎng)絡(luò)8d雞蛋。同時(shí)用IA和ELISA對(duì)雞蛋樣品舉行檢測(cè)；選擇康健“三黃仔肉雞(每只0.75kg)56只，隨機(jī)分成比較組(40只)和試驗(yàn)組(16只)。比較組飼喂不含磺胺類藥物的飼料，試驗(yàn)組飼喂含500g/kgSD的

8、飼料9。試驗(yàn)期間自由采食，自由飲水。試驗(yàn)組一連喂藥7d后停藥，喂藥后1、3、5、7d和停藥后12、24、48、72h每次宰殺試驗(yàn)組雞5只，比較組雞2只，采其肌肉。同時(shí)用IA和HPL對(duì)樣品舉行檢測(cè)。2結(jié)果2.1抗SD單克隆抗體的純化2.2SD競(jìng)爭(zhēng)物的斷定及選擇2.3膠體金的斷定2.4試紙條敏捷度試驗(yàn)2.5試紙條特異性試驗(yàn)用免疫層析試紙別離檢測(cè)濃度1000ng/l的其2.6添加接納試驗(yàn)2.7免疫層析法(IA)與ELISA的比力用IA和ELISA同時(shí)測(cè)定來主動(dòng)物試驗(yàn)雞蛋樣品，IA按照肉眼斷定結(jié)果，結(jié)果見表2。52份雞蛋樣品中，二者陽(yáng)性切合率為100%(25/25)，弱陽(yáng)性切合率為72.7%(8/11

9、)，陰性切合率為84.2%(16/19)，總切合率為94.2%(49/52)。參照我國(guó)SD殘留限量尺度，SD殘留大于100ng/g判為陽(yáng)性(+)，小于100ng/g判為陰性(-)，IA和HPL檢測(cè)雞肉中SD表1磺胺嘧啶在動(dòng)物源性食品中的接納率表2免疫層析法(IA)與ELISA的比力殘留的切合率為100%。2.8IA與HPL的比力用IA和HPL同時(shí)測(cè)定來主動(dòng)物試驗(yàn)雞肉樣品，IA按照肉眼斷定結(jié)果，結(jié)果見表3。二者陰性切合率為82.8%(24/29)，弱陽(yáng)性切合率為28.6%(2/7)，陽(yáng)性切合率為100%(24/24)，總切合率為89.3%(50/56)。參照我國(guó)SD殘留限量尺度，SD殘留大于10

10、0ng/g判為陽(yáng)性(+)，小于100ng/g判為陰性(-)，IA和HPL檢測(cè)雞肉中SD的切合率為100%。表3免疫層析法與高效液相色譜法的比力2.9應(yīng)用在某市的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超等市場(chǎng)網(wǎng)羅140份雞蛋樣品和100份雞肉樣品，用免疫層析試紙舉行檢測(cè)，結(jié)果表白，3份雞蛋樣品中含有SD殘留，濃度均大于100ng/g，為陽(yáng)性樣品；2份雞肉樣品中含有SD，此中1份濃度在10100ng/g，另1份濃度大于100ng/g。用HPL法對(duì)其復(fù)核，雞蛋樣品SD含量別離為229、112和125ng/g，雞肉樣品SD含量別離為56和138ng/g，與免疫層析法檢測(cè)結(jié)果同等。3討論由于鹽類身分能影響膠體金對(duì)抗體的吸附，并可使

11、其聚沉，因此，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟之前必需徹底除鹽，一樣平常將卵白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低的鹽溶液(0.005l/LNalpH7.0)中透析。恒久低溫保存的抗體，特殊是在濃度高時(shí)，很輕易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟歷程及金標(biāo)抗體的不變性有必然影響，因此，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟之前須用微孔濾膜或超速離心撤除不溶物。如今應(yīng)用免疫層析技能創(chuàng)立的檢測(cè)要領(lǐng)，大多只能舉行定性闡發(fā)(陽(yáng)性、陰性)。要舉行半定量、定量闡發(fā)，一樣平常必要借助讀條裝置來實(shí)現(xiàn)6，14。為了降服這種缺陷，在本研究我們以肉眼斷定檢測(cè)限(10ng/l)與我國(guó)SD殘留限量尺度(100ng/l)為utff值，接納分區(qū)斷定的要領(lǐng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)SD殘留

12、的半定量檢測(cè)。當(dāng)樣品中SD殘留濃度低于要領(lǐng)肉眼斷定檢測(cè)限時(shí)，檢測(cè)線顏色與陰性比較檢測(cè)線無顯著差異，判為陰性；當(dāng)樣品中SD殘留濃度在肉眼斷定檢測(cè)限與我國(guó)SD殘留限量尺度(100ng/l)范疇內(nèi)時(shí)，其檢測(cè)線顏色顯著淺于陰性比較檢測(cè)線，判為弱陽(yáng)性；當(dāng)樣品中SD殘留濃度高于我國(guó)SD殘留限量尺度(100ng/l)范疇內(nèi)時(shí)，其檢測(cè)線無顏色出現(xiàn)，判為陽(yáng)性。該分區(qū)斷定半定量檢測(cè)要領(lǐng)在SD殘留中獲得了較好的結(jié)果。在IA和HPL對(duì)來主動(dòng)物試驗(yàn)的56份雞肉樣品同步檢測(cè)中，HPL要領(lǐng)為中國(guó)獸藥監(jiān)察所草擬的檢測(cè)要領(lǐng)，該本要領(lǐng)在雞肉中的檢測(cè)限為50ng/g，劃定樣品中殘留量小于50ng/g時(shí)，斷定為未檢出；IA的肉眼斷定檢測(cè)限為10ng/g。在10100ng/g區(qū)段內(nèi)，檢測(cè)試劑盒檢出的7份樣品中，大概此中有的