1、3D皮膚模型與化妝品體外科學(xué)評(píng)估研究專(zhuān)題講座第1頁(yè)，共48頁(yè)。21研究背景目錄2構(gòu)建3D皮膚模型3基于3D皮膚模型建立體外替代檢測(cè)方法第2頁(yè)，共48頁(yè)。3研究背景第一部分第3頁(yè)，共48頁(yè)?；瘖y品種類(lèi)繁多，科學(xué)評(píng)估是關(guān)鍵超過(guò)67萬(wàn)件化妝品產(chǎn)品第4頁(yè)，共48頁(yè)?；瘖y品與皮膚的相互作用：安全與功效第5頁(yè)，共48頁(yè)。6傳統(tǒng)化妝品毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目化妝品安全技術(shù)規(guī)范所列檢測(cè)項(xiàng)目原料普通化妝品（非特）特殊用途化妝品易接觸 眼睛類(lèi) 發(fā)用產(chǎn) 品易接觸 護(hù)膚類(lèi)眼睛類(lèi)護(hù)膚品一般彩妝 眼部彩妝 品品護(hù)唇及唇部彩 。育發(fā) 妝品染發(fā)燙發(fā)脫毛美乳健美。急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)

2、皮膚變態(tài)反應(yīng)皮膚光毒性試驗(yàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)睪丸生殖細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)亞慢性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)致畸試驗(yàn)慢性毒性/致癌性結(jié)合試驗(yàn)第6頁(yè)，共48頁(yè)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能滿(mǎn)足評(píng)估需求種屬、個(gè)體差異造成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能反映人體結(jié)果，不科學(xué)每年有大量動(dòng)物被處死，不人道第7頁(yè)，共48頁(yè)。8國(guó)際體外替代檢測(cè)發(fā)展先驅(qū)3R理念William M.S. RussellRex Burch1959第8頁(yè)，共48頁(yè)。9國(guó)毒性終點(diǎn)際體外替代檢測(cè)方法的發(fā)展測(cè)試方法趨勢(shì)OECD 接受狀態(tài)皮膚刺激/腐蝕體外

3、重組人體表皮模型- 皮膚腐蝕OECD 431*體外檢測(cè)生物膜屏障試驗(yàn)-皮膚腐蝕OECD 435*體外重組人體表皮模型-皮膚刺激性O(shè)ECD 439皮膚致敏直接肽反應(yīng)試驗(yàn)(DPRA)OECD 442c (2015)ARE-Nrf2熒光素酶試驗(yàn)法(KeratinoSens)OECD 442d (2015)人類(lèi)細(xì)胞系激活試驗(yàn) (h-CLAT)OECD 442e(2016)LuSens（角化細(xì)胞內(nèi)ARE受體基因試驗(yàn)）待同行評(píng)議IL-8記錄細(xì)胞試驗(yàn)（IL-8 Luc assay ）同行評(píng)議骨髓U937皮膚刺激性試驗(yàn)（U-SENS）同行評(píng)議過(guò)敏原基因組快速檢測(cè)(GARD) 試驗(yàn)方法待驗(yàn)證利用皮膚模型分析基因

4、試驗(yàn)（The SENS-IS assay）待驗(yàn)證外周血單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞(PBMDC) ;-重組人體表皮(RhE)中 IL-18的 效力試驗(yàn);-過(guò)氧化物酶 肽反應(yīng)試驗(yàn) (PPRA) ;-表皮過(guò)敏化分析試驗(yàn)- EpiSensA-第9頁(yè)，共48頁(yè)。10毒性終點(diǎn)測(cè)試方法OECD 接受狀態(tài)眼刺激/腐蝕性牛角膜混濁和滲透性試驗(yàn) (BCOP)OECD 437離體雞眼試驗(yàn)(ICE)OECD 438熒光毒漏出試驗(yàn) (FL)OECD 460短期暴露試驗(yàn) (STE)OECD 491 (2015)重組人角膜上皮模型試驗(yàn)(RhCE) EpiOcular 角膜模型的眼刺激實(shí)驗(yàn)(EIT) SkinEthic眼刺激實(shí)

5、驗(yàn)(EIT)（提案） LabCyte 角膜模型（驗(yàn)證中）OECD 492 (2015)微生理儀細(xì)胞傳感器試驗(yàn) (CM)2010年提出草案角膜刺激性檢測(cè)試驗(yàn)（Ocular Irritection）EURL ECVAM 審查三維（3D）半角膜模型蛞蝓粘膜刺激試驗(yàn)國(guó)際體外替代檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)第10頁(yè)，共48頁(yè)。11毒性終點(diǎn)測(cè)試方法OECD 接受狀態(tài)皮膚吸收人類(lèi)離體皮膚吸收試驗(yàn)OECD 428 *光毒性3T3中性紅攝取試驗(yàn)重組人皮膚模型試驗(yàn)（開(kāi)發(fā)中）OECD 432*遺傳毒性/致突變細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)OECD 471*體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)OECD 473*體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)OECD 487

6、*體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞Hprt和xprt基因突變?cè)囼?yàn)OECD 476 (原1984年采納的 476于2015年被分為兩個(gè)方法：476 和490.)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞胸苷激酶基因突 變?cè)囼?yàn)OECD 490 (2015)重組3D皮膚模型的微核試驗(yàn)和彗星 試驗(yàn)計(jì)劃2016年完成驗(yàn)證。人類(lèi)表皮模型的微核試驗(yàn)計(jì)劃2016年提交法規(guī)認(rèn)可申請(qǐng)。國(guó)際體外替代檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)第11頁(yè)，共48頁(yè)。歐盟法規(guī)EC1223/2009規(guī)定：2009年立法禁止化妝品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和禁止銷(xiāo)售經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的化妝品原料2013年3月11日起全面實(shí)施歐盟率先立法全面禁止動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第12頁(yè)，共48頁(yè)。其他國(guó)家相繼立法禁止動(dòng)物實(shí)驗(yàn)歐盟*以色列*印

7、度*新西蘭加拿大美國(guó)巴西澳大利亞韓國(guó)阿根廷中國(guó)日本俄羅斯中國(guó)臺(tái)灣實(shí)施化妝品動(dòng)物試驗(yàn)/銷(xiāo)售禁令的市場(chǎng)（* 全面禁止）積極開(kāi)展“終止動(dòng)物殘忍”活動(dòng)的國(guó)家著手立案化妝品動(dòng)物試驗(yàn)/銷(xiāo)售禁令的市場(chǎng)Rule 148-C動(dòng)物福利修正法案終止殘忍化妝品法案道德的化妝品法案動(dòng)物試驗(yàn)法EC1223引自HSI第13頁(yè)，共48頁(yè)。14中國(guó)亟待發(fā)展體外替代檢測(cè)體系化妝品進(jìn)出口貿(mào)易 技術(shù)壁壘中國(guó)化妝品產(chǎn)業(yè)發(fā) 展與技術(shù)升級(jí)新檢測(cè)技術(shù)體系與 市場(chǎng)的發(fā)展消費(fèi)升級(jí)與消費(fèi)安 全的有力保障社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展 與動(dòng)物福利保護(hù)法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展建立國(guó)家競(jìng)爭(zhēng)力第14頁(yè)，共48頁(yè)。15化妝品新原料/配方傳統(tǒng)方法新技術(shù) 新模型體外檢測(cè) 方法皮膚細(xì)胞

8、培養(yǎng)3D模型構(gòu)建器官芯片技術(shù)化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估動(dòng)物毒理評(píng)估基因水平蛋白水平細(xì)胞組織水平人體評(píng)估化妝品體外科學(xué)評(píng)估體外替代檢測(cè)是中國(guó)化妝品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)支撐第15頁(yè)，共48頁(yè)。16構(gòu)建3D皮膚模型第二部分第16頁(yè)，共48頁(yè)。3D表皮模型 EpiKutis含毛囊皮膚模型 FolliKutis3D全層皮膚模型FulKutis含血管皮膚模型EndoKutis3D黑素皮膚模型 MelaKutis含脂肪皮膚模型 AdipoKutis3D角膜上皮模型BioOcullar3D口腔上皮模型EpiOriis完成系列化3D重組模型的開(kāi)發(fā)第17頁(yè)，共48頁(yè)。結(jié)構(gòu)與中國(guó)人皮膚高度一致，測(cè)試與臨床結(jié)果高度一致成功

9、開(kāi)發(fā)國(guó)際第一個(gè)中國(guó)人3D皮膚模型3D皮膚模型：EpiKutis人體皮膚第18頁(yè)，共48頁(yè)。3D皮膚模型（ EpiKutis ） 高度接近于天然皮膚H&ELORFLGCK10使用中國(guó)人角質(zhì)形成細(xì)胞為種子細(xì)胞具有正常皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)早期分化蛋白（CK10）晚期分化蛋白（FLG、LOR）第19頁(yè)，共48頁(yè)。實(shí)現(xiàn)3D皮膚模型（ EpiKutis ）的規(guī)模產(chǎn)業(yè)化攻克3D皮膚模型大規(guī)模、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的國(guó)際難題 建成中國(guó)領(lǐng)先的3D皮膚模型產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模3D組織構(gòu)建發(fā)生器第20頁(yè)，共48頁(yè)。21基于3D重組模型 建立體外替代檢測(cè)方法第三部分第21頁(yè)，共48頁(yè)。22利用3D皮膚模型獲取多維度測(cè)

10、試數(shù)據(jù)基因表達(dá)組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞因子組織活力第22頁(yè)，共48頁(yè)。體外皮膚刺激性檢測(cè)第23頁(yè)，共48頁(yè)。24體外皮膚刺激性檢測(cè)體系Marker: 藥物曝露后的組織活力; Model: 3D重組皮膚模型(EpiKutis); Method: MTT組織活力檢測(cè);3 min30 min2 hrs4 hrs8 hrs16 hrs24 hrs中等刺激性輕微刺激或無(wú)刺激性O(shè)ECD 439GHS 2OECD 431GHS 1EPA IEPA II腐蝕性重度刺激性EPA IIIEPA IV藥物曝露時(shí)間與刺激性強(qiáng)弱關(guān)系Time to toxicity第24頁(yè)，共48頁(yè)。25基于3D皮膚模型皮膚刺激性（SIT）的檢測(cè)流

11、程給藥DPBS清洗以陰性對(duì)照為100%計(jì) 算組織活力值給藥組OD% =陰性對(duì)照OD異丙醇浸提酶標(biāo)儀讀數(shù)Followed OECD TG 439后孵育第25頁(yè)，共48頁(yè)。26多時(shí)間點(diǎn)暴露（）Exposure with multi time pointsFollow Time-to-Toxicity （ET50）Viability is presented relative to negative control tissue valuesTest Material OD% =Negative Control OD清洗Wash offMTT反應(yīng)MTT reactionOD值讀取 OD readin

12、g化妝品的微弱刺激性檢測(cè)方法（Time-to-Toxicity）第26頁(yè)，共48頁(yè)。SIT法不適用于判定化妝品的微弱刺激性SIT is not good enough to predict the weakness of skin irritation體外皮膚刺激性（Time-to-Toxicity）方法能有效判斷化妝品配方的微弱刺激性第27頁(yè)，共48頁(yè)。體外皮膚刺激性（Time-to-Toxicity）方法 在防腐體系篩選中的作用樣品編號(hào)ET50（h）HSY-1ET50 =11 hHSY-2ET50 24 hHSY-3ET50 =12 h三個(gè)配方很接近，但是防腐體系不一樣！防腐體系1：0.6

13、%（苯氧乙醇+乙基己基甘油）+ 40%甘油 防腐體系2：0.35%辛甘醇+ 40%甘油防腐體系3：0.6%苯氧乙醇+ 40%甘油 防腐體系4：0.2%苯甲酸鈉+ 40%甘油防腐體系5：0.6%（苯氧乙醇+乙基己基甘油）+ 0.35%辛甘醇+ 40%甘油防腐體系6：0.6% 苯氧乙醇 +0.2% 苯甲酸鈉+ 40%甘油 防腐體系7：40%甘油第28頁(yè)，共48頁(yè)。體外皮膚屏障功效檢測(cè)第29頁(yè)，共48頁(yè)。30消除炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)remove the inflammation cascade第30頁(yè)，共48頁(yè)。31皮膚角質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與皮膚屏障及 肌膚敏感狀態(tài)高度相關(guān)Corneocyte is highly

14、related to skin barrier functionrCE60%rCE30%Basing on over 5000 cases of corneocyte morphology analysis (Tape-stripping), as compared with consumer evaluation.Rigid CorneocyteSample：Tape Stripping/BioCell R&D data第31頁(yè)，共48頁(yè)。32NativeskinHD dermatitisThe lower ceramide(EOS)and higher FFA may explain de

15、creased skin barrier function in HDD patients.Sample：Tape Stripping/BioCell DATA Method：HPLC-ELSD皮膚屏障脂質(zhì)（CER）與皮膚屏障及 肌膚敏感狀態(tài)高度相關(guān)Ceramide is highly related to skin barrier function第32頁(yè)，共48頁(yè)。33keratinocytesLipidFilaggrin(Permeability): Lipid andCE, Cell adhesionsomesynthesisCorneodeLoricrin皮膚屏障的構(gòu)成與指標(biāo)確定 D

16、etermination of skin barrier related biomarkersCornified EnvelopeSkin LipidCell JunctionCytoskeletonOthers Filaggrin HMG-CoA reductase Occludin Keratin 1 Aquaporin 3 LoricrinSkAicnetbyla-CrorAiecrarboxylaseCColarundiinfi1edkCelaruadtinin4o/7cytes Keratin S5 kin barrier C(Pashpayssei1c4al): Involucri

17、n SeNrinMe pFalmitoyl transferase ZO-1 ZO-2 ZO-3 Keratin 10 Fas Transglutaminase 1 ABCA12 JALMat-1e differentiating Keratin 14 FasL Transglutaminase 3 extrusionPPAR- crosslink Desmokgelerian t1inocytes Keratin 1sm6 osome Csaysnptahsees8is Transglutaminase 5 PPAR-ss Desmocollin 1 Keratin 17 IL-1 Smal

18、l-proline-richprotein 2ALipid PPAR- Filaggrin EE-caadrhlyeridnifferentiating Keratin 2Desmo-InILv-o6lucrinsynthesissynthesis ABCA1 Gap junction protein,alpha 1 Keratin 6 IL-8 Integrin alpha3/6; beta4/5 Keratin 11Proliferating keratinocytes TNF確定了 200多種與皮膚屏障高度相關(guān)的基因第33頁(yè)，共48頁(yè)。34NoNoYesNoYesSample Reque

19、stMTTIC50/Proliferation/MorphologyBio-Markers Gene Expression Assay2D Normal Keratinocytes ModelEfficacySkincare Cytokines ELISAHigh Potential ActiveYesElisa & Western Blot Protein Assay ConfirmingSummarizationTissue ModelCell MigrationScratch TestConfirmation 3 Optimal Conc.100%+ Cell ViabilityYesD

20、eterminationOptimal Working Conc.Working Conc. AdjustingEnsure Viability and MorphologyNo2D UVBDisrupted Model 2D Normal Keratinocytes Model2D3D第34頁(yè)，共48頁(yè)。357.0006.0005.0004.0003.0002.0001.0000.0008.0009.000LORTGM1HMGCRACACASPT ABCA12FLGCASP14OCLN1 CLDN1DSG1K16ControlExperiment#2促屏障相關(guān)功效基因表達(dá)分析（2D）Acti

21、ve candidates upregulate skin barrier related gene expression第35頁(yè)，共48頁(yè)。36促屏障相關(guān)效應(yīng)物質(zhì)的表達(dá)（3D）The advantage of skin barrier test with 3D skin modelsBiomarker only exist in 3D (SC)NMF in SC;Lipid in SC;CE protein and structure；Penetration barrier；第36頁(yè)，共48頁(yè)。37Blank Control樣品2 20ppm樣品X 20ppm根據(jù)染色區(qū)域的光密度平均值，樣品

22、增加FLG表達(dá)約30%促屏障相關(guān)效應(yīng)物質(zhì)的表達(dá)（FLG）第37頁(yè)，共48頁(yè)。380.00002.00004.00006.00008.000010.000012.000014.0000正常2#1.60001.40001.20001.00000.80000.60000.40000.20000.0000正常2#NMF:PCANMF:UCA胰酶下底面降解1h2h促屏障相關(guān)效應(yīng)物質(zhì)的表達(dá)-NMF第38頁(yè)，共48頁(yè)。39皮膚美白活性物、配方 的整合評(píng)估方案In vitro evaluation of skin whitening efficacy第39頁(yè)，共48頁(yè)。Keratinocyte-derived

23、 factors that regulate skin pigmentation胞吐作用胞吞作用膜泡運(yùn)輸成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子干細(xì)胞因子粒單集落刺激因子神經(jīng)生長(zhǎng)因子內(nèi)皮素前列腺素白血病抑制因子黑色素皮質(zhì)素受體突觸蛋白酶激活受體皮膚黑素合成與美白的機(jī)理第40頁(yè)，共48頁(yè)。41反面高爾基體網(wǎng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換酶核內(nèi)體溶酶體黑素小體原纖維蛋白 具膜小泡黑素親和素肌球蛋白多巴色素異構(gòu)酶絲狀肌動(dòng)蛋白 微管驅(qū)動(dòng)蛋白動(dòng)力蛋白多巴受體黑色素皮質(zhì)素受體促黑素促腎上腺皮質(zhì)素角朊細(xì)胞Factors that affect skin pigmentation within melanocytes皮膚黑素合成與美白的

24、機(jī)理第41頁(yè)，共48頁(yè)。42傳統(tǒng)檢測(cè)方法100806040200120 Tyrosinase activity %*ControlNAKAArbTyr activity in melanocytes(4.0)4.03.02.01.00.0(1.0)(2.0)(3.0)Control-MSHNAKAArbmRNA fold change (lg)MITFgp100TYRRab27aTRP2MC1RMelanin synthesis related gene expressionInhibition of melanin amountPositive controlActivesInhibitio

25、n of melanin transfer（Rab27a）第42頁(yè)，共48頁(yè)。43美白功效體外整合評(píng)價(jià)體系Degree 3Degree 2Degree 1MelaKutis黑素皮膚模型第43頁(yè)，共48頁(yè)。443D黑素皮膚模型（MelaKutis）GP100特異性地表達(dá)于表皮基底層的黑素細(xì)胞中。 表明該模型具有正常的黑素合成響應(yīng)能力。Masson-Fontana染色結(jié)果表明，模型具有正常 的黑素合成能力，合成的黑素轉(zhuǎn)運(yùn)到表皮細(xì)胞中。第44頁(yè)，共48頁(yè)。45TA3TA5ControlUVBTA7TA-1TA-2KA-1KA-2377-1377-2NA-1NA-2VC-1VC-2VP-2VP-1Co

26、ntrolUVB活性物或配方表面給藥與評(píng)估第45頁(yè)，共48頁(yè)。UVB=1表面給藥低濃度UVB=1表面給藥高濃度絕對(duì)值相對(duì)值Mela/L*絕對(duì)值相對(duì)值Mela/L*L值黑素含量L值黑素含量L值黑素含量L值黑素含量UVB45.30046.228100.000100.0011.000UVB45.30046.228100.000100.0011.000VC-磷酸酯鈉59.36743.669131.05294.4650.721VC-磷酸酯鈉53.46742.243118.02891.3790.774VC-乙基醚55.60039.656122.73785.7830.699VC-乙基醚56.00041.689123.62090.1820.730煙酰胺54.43344.420120.16296.0890.800煙酰胺58.16740.403128.40387.4000.681曲酸59.10038.611130.46483.5