1、馬鈴薯組織培養(yǎng)前言：馬鈴薯組織培養(yǎng)的意義.馬鈴薯（Solanum tuberosum）屬茄科茄屬植物！常見的育種途徑有：常規(guī)二倍體雜交法， 四倍體水平的品種間雜交法，遠(yuǎn)緣種間雜交法，2n配子利用法。這些途徑都是通過有性生殖 產(chǎn)生馬鈴薯變異體，通過系譜，回交，輪回選擇的方法，需經(jīng)過6-8代選出附合目標(biāo)性狀的 新個(gè)體。進(jìn)入20世紀(jì)90年代后，隨著生物技術(shù)的深入發(fā)展，人類對(duì)植物細(xì)胞遺傳行為， 基因表達(dá)傳遞行為達(dá)到分子水平深入了解，作物育種工作者開始引入了除單純戶外有性雜交 育種之外，又一育種方法室內(nèi)體細(xì)胞無性系變異育種法，其中組織培養(yǎng)（tissue culture） 誘導(dǎo)再生植株的突變就是最常用的一

2、種。當(dāng)馬鈴薯外植體（莖尖脫毒分生組織）培養(yǎng)時(shí)， 由于組培環(huán)境引發(fā)了細(xì)胞異染色質(zhì)DNA延遲復(fù)制，產(chǎn)生了較田間自然突變率高出500倍的 大量變異。這一現(xiàn)象已越來越被馬鈴薯育種工作者所認(rèn)可，并成為一條馬鈴薯育種的有效途 徑?，F(xiàn)從組織培養(yǎng)及組織培養(yǎng)在馬鈴薯育種上的發(fā)展歷史，研究意義，研究方式以及未來展 望等方面逐一論述。馬鈴薯的市場效益（為什么選馬鈴薯作試驗(yàn)材料）馬鈴薯是世界上僅次于小麥、水稻和玉米的第四種主要農(nóng)作物就單位面積出產(chǎn)的干物質(zhì)而 言，它高于小麥、大麥和玉米，就單位面積出產(chǎn)的蛋白質(zhì)而言，分別為小麥、水稻和玉米的 2.02, 1.33和1.20倍。目前我國馬鈴薯常年種植面積為467萬公頃左右，

3、鮮薯年總產(chǎn)量5 500萬噸，居世界第一位。種植區(qū)域主要分布在黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、山西、甘肅、青海、 云南、貴州、四川等廣大地區(qū)。但是我國的馬鈴薯加工業(yè)發(fā)展十分緩慢，基本上以鮮食為主， 少部分用于傳統(tǒng)食品加工和制取粗淀粉，深加工產(chǎn)品很少，而且加工生產(chǎn)規(guī)模小，工藝落后。 20世紀(jì)90年代國內(nèi)以馬鈴薯為原料的食品工業(yè)進(jìn)入了一個(gè)蓬勃發(fā)展的時(shí)期然而產(chǎn)品與外同 類產(chǎn)品相比，無論是在色澤、口味、品質(zhì)，還是在包裝上均存在一定差距。馬鈴薯塊莖水分 多、脂肪少、單位體積的熱量相當(dāng)?shù)?，所含的維生素C是蘋果的10倍，B族維生素是蘋果 的4倍，各種礦物質(zhì)是蘋果的幾倍至幾十倍不等，土豆是降血壓食物膳食中某種營養(yǎng)多了或

4、缺了可致病。近年來隨著人民群眾生活水平的日益提高，我國的食品結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一些新的變 化，中西方的飲食文化開始相互滲透和融合，馬鈴薯加工食品在我國同樣備受歡迎。隨著麥 當(dāng)勞、肯德基等洋快餐在我國落戶，其中必有一款的炸薯?xiàng)l、薯泥等馬鈴薯食品很受國內(nèi)中 層消費(fèi)者的喜愛，尤其是兒童對(duì)其情有獨(dú)鐘，成為未來我國馬鈴薯食品潛在的龐大的消費(fèi)群 體。1馬鈴薯的生態(tài)習(xí)性和種類馬鈴薯生長對(duì)土壤的適應(yīng)性很強(qiáng)，但對(duì)氣候要求涼、冷、燥，在濕熱地區(qū)雖然也能生長， 不過一代以后品種就會(huì)演化，需要經(jīng)常從寒冷地區(qū)引進(jìn)新的種。種薯在土溫58C的條件 下即可萌發(fā)生長，最適溫度為1520C。適于植株莖葉生長和開花的氣溫為1622C。夜

5、間最適于塊莖形成的氣溫為1013C（土溫1618C），高于20C時(shí)則形成緩慢。出土和 幼苗期在氣溫降至-2C即遭凍害。開花和塊莖形成期為全生育期中需水量最大的時(shí)期。馬鈴薯在原產(chǎn)地就有幾百個(gè)品種，在世界各地又不斷地培養(yǎng)新品種，目前全世界有幾千 個(gè)品種，有含淀粉比例較高，適合作為主食的，也有適合作為蔬菜食用的。人們根據(jù)不同的 用途培養(yǎng)出很多新品種，花色有白色、紅色、紫色等品種，地下塊莖有圓形、卵形和橢圓形， 其皮色有紅色、黃色、白色和紫色的不同品種。一般用塊莖上的“芽眼”切下播種，如果用 種子種植，很快就會(huì)產(chǎn)生變異，因此非常容易出現(xiàn)新品種。2馬鈴薯莖尖的組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)(Plant tissu

6、e culture)是指在無菌的條件下，將離體的植物(根、莖、 葉、花、果實(shí)、種子等)、組織(形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細(xì)胞(體細(xì)胞和生 殖細(xì)胞)以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，使其長成完整 的植株。由于培養(yǎng)物是脫離植物母體，在玻璃瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，所以也叫做離體培養(yǎng)。在有些 情況下，再分化也可不經(jīng)愈傷組織階段，而直接發(fā)生于脫分化的細(xì)胞1。植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)初發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，隨著這項(xiàng)技術(shù)的日益完善，其應(yīng)用 也越來越廣泛，可用于種苗快繁、植物脫毒、植物育種、種質(zhì)資源保存以及次生代謝物提取 等方面。尤其植物快繁和脫毒是應(yīng)用最多和最廣的方面，而且許多花卉苗

7、木的試管育苗已進(jìn) 入了商品化生產(chǎn)2。馬鈴薯薯塊及芽外植體消毒滅菌后在MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果最好3黃萍等認(rèn)為在馬鈴薯初代培養(yǎng)基(作莖尖培養(yǎng)用)和增殖培養(yǎng)基(作試管苗快速繁殖用) 中分別加入25ug/ml鏈霉素、四環(huán)素和苯甲酸鈉3種抗污染劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn):苯甲酸鈉在初代 培養(yǎng)基中抑菌效果最好;而在增殖培養(yǎng)基中以四環(huán)素的抑菌效果最佳。4植物組織中普遍存在內(nèi)生菌，當(dāng)植物組織進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，這些內(nèi)生菌就會(huì)產(chǎn)生污染5 為了消除植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的真菌和細(xì)菌污染，而又不殺傷植物組織，采用多菌靈 和青霉素混合溶液浸泡污染的組培苗莖段的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌靈對(duì)真菌有殺滅作用，對(duì)細(xì)菌 沒有明顯作用；青霉素只對(duì)細(xì)菌有抑

8、制作用，繼代后細(xì)菌污染照常存在；而對(duì)污染的組培 苗采用75 %乙醇和0 .1% HgCl2處理可徹底殺滅真菌和細(xì)菌6 3植物激素對(duì)馬鈴薯生長的影響試驗(yàn)以品種為主區(qū)，激素處理為副區(qū)進(jìn)行裂區(qū)設(shè)計(jì)，研究赤霉素(GA3)與茉莉酸甲酯 (MeJA)對(duì)霧培馬鈴薯內(nèi)源激素與生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明:外源GA3處理增加了 3個(gè)馬鈴 薯品種葉片內(nèi)源IAA和JA的含量，降低了中晚熟品種高原7號(hào)的內(nèi)源ABA含量。外源MeJA 對(duì)馬鈴薯塊莖均有一定誘導(dǎo)作用,但結(jié)合GA3處理其誘導(dǎo)結(jié)薯的能力會(huì)減弱。7馬鈴薯塊莖 形成期，脫落酸含量顯著增加，赤霉素含量則顯著降低，赤霉素與脫落酸比值下降到一定水平 是塊莖開始形成的重要條件

9、。外加脫落酸噴施葉面，使塊莖形成提早,但結(jié)薯數(shù)并未增加;外加 赤霉素噴施葉面，使植株細(xì)高，匍匐莖細(xì)長，塊莖形成顯著延遲，塊莖數(shù)顯著減少,這一結(jié)果進(jìn)一 步證明了脫落酸和赤霉素在塊莖形成中的作用。8研究表明外源添加赤霉素(GA，Gibberellins) 能促進(jìn)馬鈴薯莖、葉和匍匐莖的生長，而抑制塊莖的形成.添加GA生物合成抑制劑可降低植 株體內(nèi)GA水平和活性，促進(jìn)塊莖形成。9在誘導(dǎo)結(jié)薯的過程中給以不同濃度的香豆素處理， 研究香豆素對(duì)試管微型薯誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)結(jié)薯的培養(yǎng)基中，添加香豆素處理 的濃度為30mg/L時(shí)，獲得的微型薯塊莖較大且大薯率較高。10在加入100mg/l香豆素時(shí)， 試管

10、結(jié)薯的數(shù)量與使用500mg/l矮壯素效果相近似。使用50mg/l人參寡糖素或10mg/l黑節(jié) 草寡糖素時(shí)，試管結(jié)薯的數(shù)量明顯超過或略超過用500mg/l矮壯素的效果。IAA與GA互作對(duì)馬鈴薯試管苗生長有積極的促進(jìn)作用,能夠明顯提高試管苗的高度，最 大增幅可達(dá)90.3%,而IAA與BAP互作對(duì)試管苗生長有明顯抑制作用。IAA與GA互作對(duì)試 管苗根的形成和生長影響不明顯。BAP對(duì)試管薯形成有重要作用，而GA與BAP互作能進(jìn)一 步促進(jìn)試管薯生長，處理4(IAA+GA十BAP)比處理3(IAA+BAP)的試管薯鮮重和直徑分別增 加 163.8%和 46.4%11低濃度的2,4-D有利于紅色愈傷組織的花

11、色苷積累，高濃度的2,4-D促進(jìn)其生長而不利于 花色苷的積累;高濃度的6-BA能促進(jìn)紅色愈傷組織中花色苷的積累并誘導(dǎo)白色愈傷組織花 色苷的合成，但抑制其生長;卡那霉素能使白色愈傷組織變紅并積累花色苷，高濃度的卡那霉 素嚴(yán)重抑制愈傷組織的生長并最終變褐死亡;提高蔗糖濃度能促進(jìn)愈傷組織花色苷的產(chǎn)生和 積累,但超過70g/L時(shí)抑制生長124馬鈴薯組織培養(yǎng)的具體實(shí)驗(yàn)方案4.1外植體培養(yǎng)從已催出芽（芽長一般24cm）的干凈健康馬鈴薯塊莖上掰下芽，用自來水沖洗干凈，放 入0.10.15%的升汞溶液中浸泡810分鐘，在超凈工作臺(tái)上消毒完后，放入無菌水中浸 泡 6 次，每次 5 分鐘，然后接種到 MS + 6

12、BA1.5mg/L（毫克/升）+GA30.5mg/L+IBA0.5mg/L +瓊脂8g/L+蔗糖30g/L （PH值為5.8）的培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種15個(gè)外植體?？? 將接種好的培養(yǎng)皿用封好置于恒溫光照箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28，每天光照16h，光 照強(qiáng)度2 ooo Ix。形成團(tuán)狀的愈傷組織后，繼續(xù)培養(yǎng)至根、芽分化后，及時(shí)移植于三角瓶中 培養(yǎng)。144.2莖尖剝離及初代培養(yǎng)外植體培養(yǎng)20天后，在超凈工作臺(tái)上解剖鏡下用解剖針將生長點(diǎn)0.10.5mm部分剝離出 來，轉(zhuǎn)接到 MS+肌醇 100mg/L+6BA1.5mg/L+GA30.5mg/L+泛酸鈣 1.5mg/L+蔗糖 30g/L +瓊脂8

13、g/L+活性炭0.17g/L （PH值為5.8）的培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種45個(gè)生長點(diǎn)。 光照保持30006000Lux （勒克斯）左右，每天照光1316小時(shí)，溫度控制在23C，經(jīng)2 一6個(gè)月左右培養(yǎng)誘導(dǎo)，其間轉(zhuǎn)接23次，生長點(diǎn)即可長成新的小植株。經(jīng)病毒檢測不 帶病毒的株系就可進(jìn)行擴(kuò)繁，未脫毒的株系淘汰。154.3試管苗擴(kuò)繁4.3.1擴(kuò)繁前的準(zhǔn)備1擴(kuò)繁培養(yǎng)基的制備。擴(kuò)繁培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為擴(kuò)繁基本培養(yǎng)基，外加6一BA0.5mg/L+NAA0.5 1.5mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 8g/L+活性炭 0.17g/L，pH 值為 5.8。2把接種用具在超凈工作臺(tái)上用紫外線燈消毒2030分鐘，關(guān)

14、掉紫外線燈，打開日光 燈和吹風(fēng)機(jī)。3用肥皂把手洗干凈并擦干，再用75%酒精消毒，待手上酒精干后，點(diǎn)上酒精燈，把剪 子、鑷子培養(yǎng)皿等所需用具在酒精燈上進(jìn)行消毒。4.3.2接種擴(kuò)繁用75%酒精噴待接的試管苗和制備好待用的擴(kuò)繁培養(yǎng)基表面，將已脫毒株系按每苗留1 一2片葉為一個(gè)莖段剪下，正向插入擴(kuò)繁培養(yǎng)基（即MS + 6BA0.5mg/L+NAA0.51.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+活性炭0.17g/L，PH值為5.8的培養(yǎng)基）上。一般每個(gè)培養(yǎng)瓶接 種15個(gè)莖段，在溫度2527C,光照20003000Lux，每天1516小時(shí)條件下培養(yǎng)34 天即可生根長芽。30天后可按1： 7瓶進(jìn)行擴(kuò)繁

15、一次，即原來每瓶15苗擴(kuò)繁一次可達(dá)7瓶 105苗，以后每隔30天擴(kuò)繁1次，繁殖到目標(biāo)苗數(shù)后，再經(jīng)23個(gè)月培養(yǎng)即可抨插到原原 種繁殖網(wǎng)室，進(jìn)行原原種繁殖16。5馬鈴薯組織培養(yǎng)中的污染原因及控制措施1.污染的癥狀和原因真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接種后38d可在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)各種顏色的菌斑。 真菌性污染，一般是由空氣污染和瓶口邊緣的灰塵和真菌孢子落人器皿中造成的。另外，在 濕度太大的季節(jié)和培養(yǎng)室內(nèi)。棉塞也會(huì)長出真菌孢子引起大量污染。細(xì)菌性污染是指在培養(yǎng) 過程中.工作人員使用了未經(jīng)充分消毒的工具.在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、 菌落或渾濁的水漬狀.有時(shí)呈現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀。一般在接種后12d

16、即可發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌污染 又以芽孢桿菌最普遍、最嚴(yán)重。這種芽孢桿菌能耐一定高溫、高壓，對(duì)消毒劑和紫外線也有 一定抗性。常由于高壓滅菌不徹底造成的。因此，每次培養(yǎng)基滅菌后.應(yīng)放在培養(yǎng)室2-3d。 看培養(yǎng)基表面和內(nèi)部無任何細(xì)菌痕跡才能使用。2在滅菌過程中需注意以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：鍋內(nèi)滅菌物不能堆放過滿，否則將阻礙蒸汽的流通和熱交換，使容器內(nèi)升溫減慢造成物體 內(nèi)部殺菌不完全。壓力升到O. 5k：加rn=時(shí)打開放汽閥，將鍋內(nèi)冷空氣徹底排放干凈，防止滅菌不徹底后 再關(guān)閉放汽閥，使壓力穩(wěn)定。在壓力1.1k小m2、溫度為120121C下持續(xù)滅菌1525min，滅菌時(shí)間不宜超過30min， 以免引起培養(yǎng)基成分變化。據(jù)報(bào)道

17、.對(duì)于一些內(nèi)生細(xì)菌可在培養(yǎng)基中加入一定濃度的抗菌素 （青霉素Na 120mg / L+鏈霉素40m班），對(duì)其污染可起到一定程度的抑制作用。3基礎(chǔ)苗的表面消毒在接種之前，基礎(chǔ)苗需經(jīng)嚴(yán)格的挑選。仔細(xì)觀察待轉(zhuǎn)基礎(chǔ)苗，清除已被污染的基礎(chǔ)苗，確 認(rèn)無污染才能取用。對(duì)于一些初期感染的基礎(chǔ)苗，由于菌源太小，肉眼不易發(fā)現(xiàn)，不確定是否被污染的基礎(chǔ)苗 也應(yīng)果斷清除。用75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶的外壁（及瓶蓋），消除附著在瓶外壁上的雜菌后放在超凈工作臺(tái) 中，用紫外燈消毒2030min備用。4接種過程的注意事項(xiàng)接種的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是降低污染率的關(guān)鍵措施。在接種中，為了降低污染應(yīng)注意以下幾項(xiàng)事 宜：接種室保持干凈整潔應(yīng)定期對(duì)接

18、種室用75%酒精進(jìn)行噴霧降塵和熏蒸f甲醛：高錳酸鉀 =2： 1）滅菌4。并定期對(duì)接種室進(jìn)行2025min的紫外滅菌。在每次接種前，用紫外燈光 照射、殺菌3035min。接種過程中操作人員應(yīng)及時(shí)用75%酒精擦拭雙手和超凈工作臺(tái)臺(tái)面及臺(tái)壁。接種過程中， 瓶子呈斜角，瓶口放在酒精燈火焰上方，利用氣流上升的原理，以阻止空氣中飄揚(yáng)的孢子落 入瓶內(nèi)。接種后瓶蓋要擰緊、擰嚴(yán)。接種器械應(yīng)及時(shí)在酒精燈火焰上進(jìn)行灼燒滅菌。每接一瓶所用器械消毒一次。臺(tái)面上盡量 少放瓶子保證氣流暢通。使操作區(qū)空氣不斷凈化。注：若長時(shí)間使用一種消毒藥劑，空氣中 散落的真、細(xì)菌孢子就會(huì)產(chǎn)生抵抗不利環(huán)境的抗性。所以應(yīng)該每隔一段時(shí)間就更換一

19、種消毒 液。如：過氧乙酸。17馬鈴薯組織培養(yǎng)的前景展望組織培養(yǎng)是一種打破傳統(tǒng)的新型繁衍后代方法，能最大效率地利用空間，使高等作物 生長發(fā)育的微生物化，田間馬鈴薯育種材料圃種植45000株/hm2，在組織培養(yǎng)室每4cm2 培養(yǎng)1株，且能多層架放置培養(yǎng)瓶，加上繁殖周期短，變異母體材料擴(kuò)大了 500-2000倍。 同時(shí)由于組織培養(yǎng)條件使染色體突變率的增強(qiáng)，若再增設(shè)人工誘導(dǎo)突變劑，提高了變異率， 所以組織培養(yǎng)在馬鈴薯育種是一種很有潛力的方法。從20世紀(jì)90年代至今，隨著細(xì)胞分 子領(lǐng)域的深入，基因DNA序列的測定，人類對(duì)生命的微生理化，為現(xiàn)代生物技術(shù)輔助育種 成為可能，至今已有許多作物成功地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，表達(dá)基因調(diào)控，體細(xì)胞無性系雜交， 細(xì)胞器移植，花粉單倍體培養(yǎng)，單倍體加倍純合等。而這些輔助育種手段都離不開組織培養(yǎng)， 可見，21世紀(jì)開展馬鈴薯及其它作物育種，應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)勢在必行，前景美好。參考文獻(xiàn)（References）1曹孜義，劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程修訂本.甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，2001.1.許紅梅.植物組織培養(yǎng)中的污染及防止措施，北方園藝2006年06期韋瑩.