1、節(jié)旋藻實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇摘要:本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)極大節(jié)選藻中16SrRNA、TEF（翻譯延伸因子，GTPases）RPL13（核糖體蛋白）、PSR（藻藍(lán)蛋白B亞基）、CYP（親環(huán)素家族）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、Hsp（熱休克蛋白）和rpoD（RNA聚合酶70因子）八個(gè)候選基因在正常生長(zhǎng)和持續(xù)光照條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測(cè)。用geNorm軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從中選出合適的內(nèi)參基因。結(jié)果表明RPL13和CYP38可以作為正常生長(zhǎng)和持續(xù)光照處理下極大節(jié)選藻節(jié)律性研究通用的內(nèi)參基因16SrRNA基因的穩(wěn)定性要低于其他的候選內(nèi)參基因，并不是一個(gè)合適的內(nèi)參基因。

2、關(guān)鍵詞節(jié)旋藻內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCRgeNorm生物節(jié)律用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)，需選取在不同實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)恒定的基因作為內(nèi)參對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行校正。常用的內(nèi)參基因有GAPDH、憐actin、18SRNA、16SRNA、RPL13、Cyclophilin等,然而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)常用的內(nèi)參基因存在一些缺陷。Revillion等1發(fā)現(xiàn)GAPDHmRNA在不同癌組織、不同個(gè)體間以及細(xì)胞周期的不同階段變化較大。18SrRNA和16SrRNA作為內(nèi)參也遭到了質(zhì)疑。Tricarico等2認(rèn)為對(duì)于已純化mRNA中的目標(biāo)基因進(jìn)行定量時(shí),rRNA不能用于標(biāo)準(zhǔn)化；相對(duì)于大部分目標(biāo)基因,rRNA的表

3、達(dá)量太高，不能真實(shí)的反映目標(biāo)基因的降解情況。1材料與方法將節(jié)旋藻ArthrospiraFACHB438于Zarrouk液體培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。培養(yǎng)條件為23C恒溫，光強(qiáng)30卩mol-2s-1,12L/12D培養(yǎng)。藻液黑暗處理12h以達(dá)到同步化后，分別進(jìn)行持續(xù)光照處理和正常培養(yǎng)。每隔4小時(shí)收一次藻收集48小時(shí),共得到26個(gè)樣品組，兩種實(shí)驗(yàn)條件下各13個(gè)。材料用上海飛捷公司RNAfast200提取試劑盒提取總RNA,用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)質(zhì)量；用微量定量?jī)x測(cè)定濃度和純度。取800ng消化后的總RNA加100prmol的六堿基隨機(jī)引物，按照反轉(zhuǎn)錄操作流程合成cDNA。根據(jù)候選內(nèi)參基因序列設(shè)計(jì)

4、引物，使PCR擴(kuò)增效率(E)在95%到110%之間。q-rt-PCR在ABI7500Real-timePCRSysterm上進(jìn)行。反應(yīng)體系按照試劑說(shuō)明配制。實(shí)驗(yàn)過(guò)程分八次熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行,每次檢測(cè)一個(gè)基因，每個(gè)基因的檢測(cè)包括每個(gè)樣品中此基因的熒光定量PCR和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?；虻臉?biāo)準(zhǔn)曲線是用極大節(jié)旋藻FACHB438的基因組DNA為模板，稀釋10、102、103、104、105、106107倍7個(gè)濃度梯度，然后以模板稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫軸，平均Ct值為縱軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。用geNorm軟件篩選內(nèi)參基因時(shí)首先樣品Ct值利用2-Ct法轉(zhuǎn)化成基因表達(dá)量值Q,具體做法如下3:將同一基因所有樣品中Ct

5、值最小的樣品Q值設(shè)為1,同一基因其余樣品的Q值用下面兩式計(jì)算:Q=EdeltaCt(1),deltaCt二minCt-sampleCt(2)。其中E為擴(kuò)增效率，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算得到，公式為:E=10-1/斜率。GeNorm程序?qū)⒘恐礠作為輸入文件，把某一看家基因與其他看家基因的表達(dá)量值進(jìn)行兩兩比對(duì)，然后將得到的比值經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)變換，再計(jì)算這些對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差,并以此作為這個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性M。M值越高，說(shuō)明該基因的穩(wěn)定性越差；M值越低，說(shuō)明該基因的穩(wěn)定性越好。2結(jié)果與討論研究發(fā)現(xiàn)，使用單一內(nèi)參基因比使用2個(gè)或以上數(shù)目的內(nèi)參基因引起的誤差高36.4倍。GeNorm篩選出2個(gè)以上的內(nèi)參基因。在正常

6、生長(zhǎng)組，平均M值最低即表達(dá)穩(wěn)定性最好的兩個(gè)基因?yàn)镃YP和RPL13,M值分別為1.50和1.45,16SrRNA的M值高達(dá)1.883在光照處理組，平均M值最低即表達(dá)穩(wěn)定性最好的兩個(gè)基因也為CYP和RPL13,M值分別為1.379和1.528,16SrRNA基因的M值高達(dá)2.195。16SrRNA在光照處理組和正常生長(zhǎng)組相比于CYP和RPL13均未表現(xiàn)出較好的表達(dá)穩(wěn)定性，也意味著16SrRNA并不是一個(gè)合適的內(nèi)參基因。藍(lán)藻作為地球上最古老的物種之一，具有重要的研究?jī)r(jià)值。目前針對(duì)藍(lán)藻的研究主要集中在其耐鹽機(jī)制、耐堿機(jī)制以及藍(lán)藻高效的CO2利用率。其中16SrRNA被默認(rèn)為在所有實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)量都

7、是穩(wěn)定的。但本研究發(fā)現(xiàn)16SrRNA的穩(wěn)定性都比較差。在GeNorm分析中，GAPDH、16SrRNA和Hsp基因的M值最高，表明它們不適合作為內(nèi)參；光照處理組中基于平均M值分析,表達(dá)穩(wěn)定性最高的是CYP和RPL13基因,在正常生長(zhǎng)組，基于平均M值分析,表達(dá)最穩(wěn)定的基因是RPL13和CYP基因。RPL13基因良好的穩(wěn)定性在真核生物部分生物的研究中已經(jīng)得到證實(shí)。CYP基因是親環(huán)素家族一員，它在節(jié)旋藻光系統(tǒng)H中起關(guān)鍵作用，而且它在環(huán)境脅迫下的馬鈴薯中具有很好的表達(dá)穩(wěn)定性。參考文獻(xiàn)RevilionF,etal.Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasegeneexpressioninhumanbreastcancerJ.EurJCancer,2000,36(8):1038-1042.TricaricoC,etalQuantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction:normalizationtorRNAorsinglehousekeepinggenesisinappropriateforhumantissuebiopsiesJ.AnalyticalBiochemistry,2002,309(2):293-300.VandesompeleJetal