1、一、苜蓿多糖對淋巴細胞的影響1材料與試劑1.1動物小白鼠1.2材料苜蓿多糖、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、96孔細胞培養(yǎng)板、四甲基偶氮唑鹽（MTT ）、臺盼藍、尼龍毛、1.3試劑配制1.3.1 RPMI-1640培養(yǎng)基配制100 U/mL青霉素、125 g/mL鏈霉素將RPMI-1640干粉袋中的粉末用力往下甩，開口倒出粉末，量取800mL的三蒸水，先沖洗袋子至干凈，然后加入2 g NaHCOs,攪拌定容至1000 mL ,調pH值為7.1-7.3。過濾除菌，放于-200C儲存。1.3.2胎牛血清將冷藏的胎牛血清放在 4C,使之融化一半，然后室溫放置使其完全融化。56C水

2、浴30 min將其滅活，分裝到 15 mL的離心管中，-20 C保存?zhèn)溆谩?.3.3 pH7.2 PBS 緩沖液準確稱取 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl , 2.925g Na2HPO4 12H2O , 0.2g KH 2PO4，用三蒸 水溶解，然后用 HCI （ 1 mol/L ）調pH值至7.2,加水定容至 1000 mL , 120C高壓滅菌， 4 C保存?zhèn)溆谩?.3.4紅細胞裂解液稱取 NH4CI 4.16 g , KHCO 3 0.5g, Na2EDTA 0.02g ,溶于 100 mL 蒸餾水中，調 pH 7.2，加水至 500mL，存于 403。1.3.5 MTT作用

3、液稱取50 mg MTT （3- （4, 5-二甲基噻唑-2） -2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。），溶解在10 mL PBS中，0.22卩帕勺濾器過濾除菌，4C避光保存。（MTT有致癌性，用時需戴透明PE手套）2 （1） T、B淋巴細胞制備：頸椎脫臼法處死，用 75%酒精消毒，浸泡1-2 min，在超凈工作臺中取出脾臟，用滅 菌生理鹽水沖洗 3次，剔除脂肪和結締組織，置于含D-Hanks （相當于生理鹽水）無菌培養(yǎng)皿里，放入含 D-Hanks液的平皿中用滅菌的剪刀、鑷子把器官剪碎，在200目的細胞篩網(wǎng)上擠壓研磨過濾，收集細胞懸液。將Percoll分層液1 mL

4、加到10 mL試管中，緩慢貼壁把以上淋巴細胞懸液加到分層液上面，把試管用橡皮塞塞緊，以3000 r/min離心15 min ;后RPMI-1640培養(yǎng)液，用槍頭吹吸使之混勻，計數(shù)板顯微鏡下計數(shù)；計數(shù)以后以1000 r/min離心5 min ;離心以后棄去上清液，加適量的完全RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞調成 2X107個mL-1，并用臺盼藍染色檢測細胞活力大于 95%，即得到淋巴細胞培養(yǎng)液。T、B淋巴細胞的純化1:尼龍棉以0 .2 mol/L HCI浸泡6 h,再用大量蒸餾水反復沖洗，晾干。稱取尼龍棉50 mg ,將其仔細撕開裝填入 10 mL注射器內，高壓滅菌。尼龍棉柱高度為6 cm ,可有

5、效地過濾（23） X107個細胞。用D-Hanks液和RPMI-1640 （含10 %胎牛血清）培養(yǎng)基洗柱各2次，以平衡pH、溫度、排除空氣，37C放置1 h。上柱前，先將平衡液放出，垂直滴加入淋巴細胞 懸液0.5 mL,平放尼龍棉柱，以細長的毛細滴管伸入柱內界面加入培養(yǎng)液0.5 mL封口，將柱于37C靜置孵育1 h，用預溫的培養(yǎng)液淋洗柱23次，流速控制在1 mL/ min ,收集最初的10 mL流出液，1300 r/min離心10 min，此即分離的純化 T淋巴細胞。再用培養(yǎng)液 邊洗脫邊擠壓尼龍毛柱，用鋼針緩緩從上至下擠壓尼龍棉，使柱中細胞擠出，收集的洗脫液是B淋巴細胞，1300 r/min

6、離心10 min，此即分離的純化 B淋巴細胞。流式細胞術測定 T、B淋巴細胞純度：取 2個流式上樣管，其中2管為純化前的脾細胞懸液對照組，用于測定分選前T、B細胞含量，另外2管為純化后的T、B淋巴細胞樣品組，用于測定分選后 T、B細胞含量。向各管中分別加入5 X105個脾細胞或T、B淋巴細胞，并在管中補入含1% FBS的PBS溶液，使得各管總體積為 0.5 ml ,4C條件下1000 rpm X5 min離心，然后小心傾倒上清，向管底相應加入小鼠Anti-CD3-FITC 或Anti-CD19-PE熒光標記抗體 100 M管（含熒光標記抗體原液 1 （L）,輕微震蕩混勻，避光反應30 min。

7、每 管加入0.5 ml含1% FBS的PBS再次洗滌細胞，傾倒上清，加入0.5 ml含1% FBS的PBS緩 沖液重懸細胞，錫箔紙避光處理樣品管，然后分別上流式細胞記數(shù)儀檢測細胞純度。將分離的T或B淋巴細胞培養(yǎng)于 RPMI-1640 （含10%胎牛血清）完全培養(yǎng)基中，調整細胞數(shù)為5 X106 mL-1。吸取100 L細胞懸液加至96孔細胞培養(yǎng)板中，分別加入不同濃 度的苜蓿多糖，使其終濃度為12.5、25、50、100、200 /mL，每樣均設置3個重復，并設空白對照孔，置 CO2培養(yǎng)箱（5% CO2、370C）培養(yǎng)48 h。（2） MTT法測定淋巴細胞增殖活性（增值指數(shù)）：在含有10 %胎牛血

8、清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)淋巴細胞，置入含 5 %CO2, 95 %空氣，37 C培養(yǎng)箱繼續(xù)培 養(yǎng)48 h后，每孔加入四氮唑鹽（MTT） 10山（5 mg/ml）標記，然后再培養(yǎng) 8 h，用移液槍收集 各孔細胞懸液，置入15 mL離心管中離心，棄上清，加入RPMI1640培養(yǎng)基沖洗，并重新轉移到培養(yǎng)孔中，每孔加入15 % SDS 100丄，過夜。次日檢測各孔 OD570 nm值，計算增殖指數(shù)。計算公式為：山“- -: |：1 ：4 h ，取出細胞培養(yǎng)板 2000 r/min 離心 10 min ，小心吸棄上層液體，再加90 mL DMSO ，振蕩混勻后放入培養(yǎng)箱中裂解12

9、 h后取出，用酶聯(lián)免疫檢測儀測540 nm下的吸光度值，作為T、E淋巴細胞增殖的指標。（3） IL-2、IL-4、IFN- 丫測定：利用ELISA試劑盒按照說明書測定。（ 4）抗體含量測定：由以上試驗確定刺激T 細胞最適的苜蓿多糖濃度，分別加入含有Anti-TLR4 、Anti-TLR2 、 Anti-CR3 單克隆抗體、 PD98059（MEK-1 抑制劑）、 SP600125（ SAPK/JNK 抑 制劑）、SB203580 （ p38抑制劑）以及 PDTC （ NF- k B p65抑制劑）的 RPMI-1640溶液，繼 續(xù)培養(yǎng)2 ho 2 h后加入最適濃度的苜蓿多糖，繼續(xù)培養(yǎng)24 ho 24 h后，無菌EP管小心收集上清，EP管1500 rpm X10 min離心除去懸浮細胞，重新取上清液，用于測定IL-2、IL-4、IFN- 丫含量由以上試驗確定刺激 B 細胞最適的苜蓿多糖濃度，分別加入含有anti-TLR4 、anti-CD19、 anti-CD79b 單克隆抗體、 PD98059 （ MEK-1 抑制劑）、 SP600125（ SAPK/JNK 抑 制劑）、 SB203580