1、楓葉色素含量的季節(jié)性變化測定實驗方案實驗原理：楓葉中的色素，當葉子中所含的葉綠素占主導地位時，綠色就 為主色調，抑制了其他色素展現本來面目。入秋后，氣溫逐漸下降， 葉綠素的合成速度受阻，破壞卻與日俱增，到后來葉片中只剩下花 青素、類胡蘿卜等色素，于是它們便有機會盡情展現自己的如花嬌 顏。另外，隨著秋季不斷降溫，尤其是霜降之后，為適應即將到來 的寒冷氣候，葉肉內積累了較多的糖分，這些糖分經過復雜的反應， 形成了花青素，也由此形成了秋葉變紅的重要基礎花青素：花青素是具有2-苯基苯并吡喃陽離子結構的衍生物， 廣泛存在于植物中的水溶性天然色素?；ㄇ嗨卦谧匀粻顟B(tài)下常與各 種單糖形成糖昔，稱為花色昔。溶液

2、PH不同，花色昔的存在形式也 不同。對于一個給定的PH值，在花色昔的4種結構之間存在著平衡: 藍色的醍式(脫水)堿，紅色的花烊正離子，無色的甲醇假堿和查 爾酮?；ㄉ粼赑H值很低時，其溶液呈現最強的紅色。隨著PH值 的增大，花色昔的顏色將褪至無色，最后在高PH值時變成紫色或藍 色PH示差法測定花色昔含量的依據是花色昔發(fā)色團的結構轉換是 PH的函數，起干擾作用的褐色降解物的特性不隨PH變化。因此在 花青素最大吸收波長下確定兩個對花青昔吸光度差別最大但是對花 色昔穩(wěn)定的PH值。根據Fuleki T經驗公式花青素含量(mg/100g)=TO.D/(avE%1cm XW X10)；TO.D=AXDVX

3、VF； A=A(pH1.0)-A(pH4.5).其中：DV稀釋體積；VF稀釋倍數；W樣品重量；A-總吸光值；avE%1cm平均消光系數 代入數值計算：葉綠素a.b：葉綠素是由葉綠酸、葉綠醉和甲醇組成的二醇酷， 是四毗咯衍生物，其中的葉琳環(huán)是處于二氫形式，中心的金屬原子為鎂。蔬菜中的葉 綠素有葉綠素a和葉綠素b兩類。葉綠素在植物細胞中與蛋白質結 合成葉綠素蛋白質，由多種葉綠素蛋白復合物構成葉綠體，當細胞死亡之后，葉綠 素就游離出來。葉綠素是一種不穩(wěn)定的物質.不耐光、熱、酸、 不溶于水，易溶于堿、乙醉與乙醚，在堿性溶液中，皂化為葉綠素 堿鹽。葉綠素a、b在長波的最大吸收峰分別在663nm、645n

4、m，據 Lamber-Beer定律，可得濃度C與光密度D間的關系式：D663=82.04Ca +9.27CbD645=16.75Ca +45.6Cb(濃度單位：g/mL) 葉綠素 a 的濃度：Ca= 12.72D663 - 2.59D645 葉綠素 b 的濃度：Cb= 22.88D645 - 4.68 D663總葉綠素的濃度：Ct=20.29D645 +8.02D663 (濃度單位:mg/L) 材料與用品：楓葉提取液，乙醇95% (AR)，鹽酸 儀器：PHs-3B 型酸度計，紫外分光光度計 丙酮、石英砂、碳酸鈣 分光光度計、 天平、剪刀、研缽、移液管、漏斗、大試管實驗步驟：1.花青素測定：1，

5、將花青素取液稀釋至一定的體積，用稀氫氧化鈉和稀鹽酸調節(jié) PH，觀察提取液在不同PH下的顏色變化。對提取液進行200800nm 全波長掃描，繪制光譜圖PH1.02.0原液4.59.5溶液顏色2.測定波長的選擇取楓葉花青素提取液用5%HCL-EtOH (15:85)溶液稀釋至一定 體積，進行光譜掃描，確定最大吸收波長。紫外可見吸收光譜PH示差法中PH的選擇在選定PH時應考慮以下因素：在此兩個PH處測定的花青素的 吸收值差異應是最顯著的；單一 PH的輕微變動，對花青素吸光值的 影響是極小的；花青素在所處的兩個PH下，應是相當穩(wěn)定的。由于 花青素只有在酸性介質中是穩(wěn)定的，因此只測定PH小于7條件下花

6、青素吸光值的變化。PH為1. 0時，花青素以紅色的2-苯基苯并吡喃 的形式存在PH為4.5時，花青素以無色的甲醇假堿的形式存在。因 此選擇PH為1.0和4.5。平衡時間的確定因為花青素在溶液介質中存在4種結構形式，這4種結構形式 在某一 PH下處于動態(tài)平衡，當PH改變時，動態(tài)平衡發(fā)生轉移，總 的趨勢是PH降低時，平衡向紅色的2-苯基苯并吡喃陽離子移動； ?日升高時平衡向藍色醍式移動。一定時間后達到一個新的平衡。因 此提取液用緩沖液稀釋后，必須靜置一段時間，等動態(tài)平衡處于穩(wěn) 定后，才能測定吸光值。花青素在緩沖液中的吸光度值與時間的變化關系(入二nm)T(min)01020PH1.0 buffer

7、PH4.5 buffer305080110結果表明，花青素在緩沖液中的吸光度值隨時間變化，在 PH1.0()基本穩(wěn)定，在PH4.5時()基本穩(wěn)定。所以綜合考慮，選擇平衡時間為火棘果花青素含量的測定 移取濃縮液2ml，用5%HCL-EtOH稀 釋、定容至100ml，分別移取10ml，用PH1.0和PH4.5的緩沖液稀 釋至100ml，平衡()min，在波長 處測定吸光值。根據Fuleki T經驗公式花青素含量(mg/100g)=TO.D/(avE%1cm XW X10)；TO.D=AXDVXVF； 二A(pH1.0)-A(pH4.5).2,葉綠素a.b測定：稱1.25g葉用丙酮研磨I勻漿過濾(用

8、80%丙酮洗研缽及殘渣，合并濾液)濾液用80%丙酮定容至25mLI適當稀釋后測A645、A6631取樣：稱取1.25g剪碎的葉片(提供的樣品即為剪碎后凍于-80笆 的葉片)放入研缽中。注意取樣時要避開大的葉脈。2研磨提?。合蜓欣徶屑尤?0%丙酮2.5ml,以及少許(約0.002g) CaCO3 (中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素)和石英砂，研磨成 勻漿，再加入3ml 80%丙酮，繼續(xù)研磨至組織變白，在暗處靜止 35min后，用一層干濾紙過濾到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙 酮將研缽洗凈，清洗液也要過濾到容量瓶中，并用80%丙酮沿濾紙的 周圍洗脫色素，待濾紙和殘渣全部變白后，用80%丙酮

9、定容至刻度。3讀取吸光度：取厚度為lcm的潔凈比色皿，注意不要用手接觸比 色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗時要使清洗 液接觸比色皿內壁的所有部分，然后將色素提取液倒入比色皿中， 液面高度約為比色皿高度的4/5，將撒在比色皿外面的溶液用濾紙吸 掉(注意不能擦)，再用擦鏡紙擦干擦凈。將比色皿放入儀器的比 色皿架上，注意不要將溶液撒入儀器內。第一個位置放盛有80%丙酮 的比色皿，做為空白對照。將儀器波長分別調至663、645nm處，以 80%丙酮做為空白對照調透光率100%，分別測定溶液在上述2個波長 下的吸光度。每個樣品重復測定3次。注意，每次在轉換波長時，都 要用80%丙酮調透

10、光率100%。結果計算：根據Fuleki T經驗公式(1)花青素含量(mg/100g)=TO.D/(avE%1cm XW X10)；TO.D=AXDVXVF； A=A(pH1.0)-A(pH4.5).其中：DV稀釋體積；VF稀釋倍數；W樣品重量；A-總吸光值；avE%1cm平均消光系數 代入數值計算：（2）D663=82.04Ca +9.27CbD645=16.75Ca +45.6Cb（濃度單位：g/mL）葉綠素 a 的濃度：Ca= 12.72D663 - 2.59D645葉綠素 b 的濃度：Cb= 22.88D645 - 4.68 D663總葉綠素的濃度：Ct=20.29D645 +8.02D6