1、昆蟲抗菌肽及其基因工程研究盼望【摘要】昆蟲抗菌肽是一類具有免疫效應(yīng)的小分子多肽，它具有熱不變、抗菌譜廣、無免疫原性、作用機(jī)制奇特等特性，是昆蟲可以或許抵抗天然界中有害微生物侵染的緊張因素。比年來，隨著有關(guān)抗菌肽作用機(jī)理及成效研究的深化，其在醫(yī)藥范疇的研究越來越引起人們的存眷。本文就昆蟲抗菌肽的分類、生物成效、基因工程研究盼望以及在醫(yī)藥范疇的應(yīng)用等作一綜述?！娟P(guān)鍵詞】昆蟲；抗菌肽；基因工程Abstrat：Insetantiirbialpeptideisakindfplypeptidehihhasthespeifiiunityfrbateria,fungi,virusandtherpathgeni

2、irrganiss.Ithassuhharatersasheat-durability,brad-spetruantibiti,niungenandspeifiehanis,eta1.Reently,insetantiirbialpeptidehasbeenidelyusedinthepreventinandtreatentfinfetiusdiseasesiththebakgrundandappliatinresearhnit.Thispaperbrieflyreviesitslassifiatinitsbilgialfuntins,thedevelpentngenetiengineerin

3、gandtheappliatininediine.Keyrds:inset;antiirbialpeptides;genetiengineering昆蟲是天然界中最大的生物種群，現(xiàn)已確定并定名的約莫有80萬余種，約莫占全部生物種類的55，除海洋外，別的險(xiǎn)些全部的生態(tài)情況中都漫衍有種種百般的昆蟲種群1。然而，國表里學(xué)者研究創(chuàng)造，昆蟲沒有和淋巴細(xì)胞，也無免疫球卵白，不具備高等動(dòng)物那樣高度埋頭的得到性免疫體系。它們之以是可以或許在變化多端的天然界中占據(jù)極大的保存上風(fēng)，是由于昆蟲具有奇特而有用的無細(xì)胞免疫體系，當(dāng)昆蟲細(xì)胞被熏染后，其體內(nèi)可以或許快速產(chǎn)生一種免疫誘導(dǎo)分子抗菌肽(antiirbialpep

4、tide)，對(duì)抗微生物的侵染。昆蟲抗菌肽是昆蟲特異基因編碼產(chǎn)生的一類有免疫效應(yīng)的小分子多肽，其氨基酸殘基數(shù)量小于100，是昆蟲體液免疫中最緊張的抗菌因子。它具有分子量孝熱不變、抗菌譜廣、無免疫原性、作用機(jī)制奇特、對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞無害等特點(diǎn)。迄今已在昆蟲中創(chuàng)造了凌駕200種抗菌肽類物質(zhì)2，這些抗菌肽不但對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜抗菌本領(lǐng)，對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有必然作用。本文對(duì)昆蟲抗菌肽的分類、特性和基因工程研究盼望作一綜述。1昆蟲抗菌肽的分類抗菌肽是昆蟲免疫體系緊張的構(gòu)成部門，昆蟲藉此對(duì)細(xì)菌等病原菌有很強(qiáng)的對(duì)抗力。只管種種昆蟲抗菌肽在巨細(xì)或氨基酸構(gòu)成上不盡雷同，但是按照它們的序列和布局特性，可將昆蟲

5、抗菌肽分為4類：以天蠶素(erpin)為代表的不含半胱氨酸殘基的抗菌肽。天蠶素是第一種被創(chuàng)造的昆蟲抗菌肽，普及存在于昆蟲中，如今已經(jīng)從鱗翅目的蛾類、蝴蝶及雙翅目的蠅類中分散純化出20多種天蠶素雷同物。以防范素(defensin)、殞命素(thanatin)為代表的富含半胱氨酸殘基的堿性多肽。以膜翅目昆蟲中創(chuàng)造的蜜蜂肽(apidaein)等為代表的富含脯氨酸殘基的抗菌肽。以雙翅目昆蟲中分散得到的雙翅肽(dipteriins)、打擊素(attains)、麻蠅毒素(sartxins)等為代表的富含甘氨酸殘基的抗菌肽3。2昆蟲抗菌肽的生物學(xué)成效作為一種非特異性免疫分子，從昆蟲免疫體系中分散出來的抗菌肽

6、在抵抗外來病原體侵染歷程中起緊張作用。研究表白，昆蟲抗菌肽不但對(duì)細(xì)菌有殺傷作用，對(duì)癌細(xì)胞、病毒、真菌、原蟲也具有普及的殺滅活性。2.1抗細(xì)菌本領(lǐng)抗菌肽對(duì)很多致病菌包羅高度耐藥性細(xì)菌菌株，如致病型大腸桿菌、硝酸鹽桿菌、傷寒桿菌、金葡萄球菌等均有抗菌作用4。此中富含脯氨酸和甘氨酸的抗菌肽，假設(shè)蠅肽(drsin)、attain、dipteriin等對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)殺傷作用；Defensin那么對(duì)革蘭氏陽性菌較為敏感；而erpins以及2022年由izuiY等5從鱗翅目昆蟲Spdpteralitura.中分散出來的一種新抗菌肽riin，對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌都有廣譜的抗菌活性。2.2抗真菌本

7、領(lǐng)20世紀(jì)90年代初，Iijia等從麻蠅幼蟲血淋巴中初次分散出一種具有抗真菌活性，能按捺.albians生長的抗真菌肽。今后，很多具有抗真菌特性的抗菌肽也相繼被分散出來，如從黑腹果蠅DrsphilaelangasterEigen中創(chuàng)造的抗菌肽drsyin等。GenBank數(shù)據(jù)表現(xiàn)，已經(jīng)有30多種昆蟲多肽被斷定有抗真菌活性。昆蟲抗真菌肽的創(chuàng)造，無疑為根治真菌熏染性疾病提供了新的有力本領(lǐng)。2001年，AndresE等6從鱗翅目昆蟲煙蚜夜蛾Helithisviresens體內(nèi)分散得到抗真菌肽ETD151，在臨床預(yù)期實(shí)行中已經(jīng)證明該抗真菌肽可以或許有用治療真菌熏染性疾玻別的，有一些昆蟲抗菌肽對(duì)真菌和細(xì)

8、菌具有雙重抗性，如來自果蠅的ethikin對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌均表示出抗菌作用，而從半翅目昆蟲斑腹刺益蝽Pdisusauliventris中分散得到的thanatin那么對(duì)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌以及絲狀真菌都具有很強(qiáng)的抗菌活性。2.3抗腫瘤細(xì)胞的本領(lǐng)在腫瘤治療時(shí)，化療藥物在抑殺癌細(xì)胞的同時(shí)，每每也會(huì)非特異性地抑殺正常細(xì)胞，產(chǎn)生較大的毒副作用。與此形成光顯比擬的是，昆蟲抗菌肽可以或許直接定位并作用于腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜布局，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量排泄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞殞命，而對(duì)人體正常細(xì)胞那么無作用7。2022年，邱曉燕等8分散出兩種分子量為4kDa和9.6kDa的抗菌肽，它們?cè)谳^低濃度下就能有用按捺人胃

9、癌細(xì)胞G803和BG823、人乳腺癌細(xì)胞F7以及人肺癌細(xì)胞SPA1的體外增殖。作為腫瘤治療性藥物，抗菌肽無致畸變作用，無積蓄毒性，不輕易產(chǎn)生抗藥性，因此抗菌肽極有大概成為無(或低)毒副反響的抗腫瘤新藥。2.4抗原蟲和病毒的本領(lǐng)昆蟲抗菌肽對(duì)原蟲和病毒如痢疾、瘧疾、hagas氏并萊什曼病原蟲等，以及傷風(fēng)病毒、乙型肝炎病毒等也有必然作用。Sergeyhernysh等9從雙翅目昆蟲紅頭麗蠅alliphraviina中分散出一種抗菌肽allfern1對(duì)流感病毒A和B的療效明顯，可望進(jìn)入臨床實(shí)行；Parker和uh等10報(bào)道煙蚜夜蛾幼蟲的血淋巴對(duì)6種DNA、RNA病毒有顯著的廣譜按捺作用；更令人欣喜的是，

10、ahinger等11創(chuàng)造天蠶素和蜂毒素在亞毒性濃度下可以或許按捺艾滋病毒HIV-1的基因表達(dá)，這一創(chuàng)造無疑為霸占艾滋病這一頑癥提供了新的盼望。3昆蟲抗菌肽基因工程研究盼望3.1昆蟲抗菌肽基因的分子構(gòu)成在鱗翅目lepidptera、膜翅目(hyenptera)以及包羅果蠅在內(nèi)的雙翅目diptera昆蟲中,編碼抗菌肽如天蠶素、防范素等的基因已經(jīng)被樂成克隆，它們一樣平常由2040個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。研究創(chuàng)造這些基因?qū)儆诘浞兜恼婧嘶?，具有一個(gè)AAT框和一個(gè)TATA框，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有一個(gè)特異的帽子位點(diǎn)和多聚腺苷酸加尾信號(hào)序列(AATAA)，而且具有內(nèi)含子和假基因。種種抗菌多肽在翻譯后起首是從前體情勢存在的

11、，其前體肽包羅一個(gè)信號(hào)肽序列、肽前體序列和成熟肽12，前體顛末卵白水解后產(chǎn)天生熟肽。差異的抗菌肽都存在守舊和可變序列，比來從伊蚊(Aedesaegypti)中分散得到的一個(gè)新天蠶素erpin，通過序列比對(duì)闡發(fā)創(chuàng)造它與果蠅體內(nèi)分散的抗菌肽的同源性為37。而對(duì)防范素的研究創(chuàng)造，它們一樣平常都存在6個(gè)守舊的半胱氨酸序列13，從差異昆蟲體內(nèi)得到的防范素成熟肽互相的相似性很高(均在90擺布)，此中家蠅usadestia與麻蠅(Sarphagaperegrina)防范素氨基酸序列的同源性高到達(dá)94。3.2昆蟲抗菌肽基因的克隆及其表達(dá)隨著分子生物學(xué)技能的生長，抗菌肽基因的克隆技能也在不竭的更新，人們可以使用

12、構(gòu)建DNA文庫并舉行RT-PR擴(kuò)增，或使用差異基因挑選技能選出熏染與未熏染的昆蟲的差異表達(dá)基因，還可以依賴生物信息學(xué)的本領(lǐng)區(qū)分抗菌肽基因序列。如陳海旭等14使用RTPR技能克隆了果蠅抗菌肽dipteriin的DNA，其編碼區(qū)長度為249bp，編碼83個(gè)氨基酸，卵白分子量為9.0kD。王來城等15使用PR擴(kuò)增得抵家蠅防范素基因前體的DNA片斷全長430bp，此中開放閱讀框?yàn)?79bp，編碼一個(gè)具92個(gè)氨基酸殘基的短肽，分子量約為9.9kD，等電點(diǎn)為8.44；成熟肽DNA片斷長119bp，由40個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為4.0kD，等電點(diǎn)為8.69，甘氨酸含量為20，而且含有防范素典范的6個(gè)半胱氨酸殘

13、基；信號(hào)肽由22個(gè)氨基酸殘基(122)構(gòu)成，在體內(nèi)從N末了切掉52個(gè)氨基酸殘基，形成有活性的防范素(成熟肽)。在差異基因挑選要領(lǐng)上，劉振義等16使用差異表現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄PR(DDRT-PR)技能對(duì)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的家蠶總RNA舉行差異表現(xiàn)闡發(fā)，得到了一條長約241bp片斷，此基因在昆蟲免疫反響中大概飾演緊張的腳色；2022年金小寶等17使用DDRT-PR技能對(duì)家蠅幼蟲差異表達(dá)基因舉行研究，從誘導(dǎo)后家蠅幼蟲體內(nèi)挑選出2條差異表達(dá)基因片斷，長度別離為495bp和265bp，預(yù)計(jì)在家蠅免疫反響中起必然的作用。隨著形式生物假設(shè)蠅等測序事情的日臻美滿、生物信息學(xué)的不竭生長，研究職員將能使用基因組搜刮創(chuàng)造具有守舊布

14、局域的基因片斷，進(jìn)一步克隆出更多的昆蟲抗菌肽新基因?；蛑亟M技能是大量表達(dá)有活性抗菌肽的一條有用途徑。如今抗菌肽的表達(dá)體系重要有大腸桿菌表達(dá)體系、酵母表達(dá)體系、桿狀病毒介導(dǎo)的昆蟲表達(dá)體系。在使用大腸桿菌表達(dá)抗菌肽時(shí)，必要思量表達(dá)產(chǎn)物對(duì)工程菌的毒性以及表達(dá)產(chǎn)物不變性等題目，對(duì)此，可以通過挑選抗性株系以及接納交融卵白表達(dá)途徑的計(jì)謀加以辦理。如Jaynes等18于2022年將修飾過的天蠶素B基因以交融卵白的方法在大腸桿菌中表達(dá)，不單避開了對(duì)宿主的損傷作用，而且實(shí)現(xiàn)了高程度的表達(dá)。酵母表達(dá)體系是以酵母菌為宿主構(gòu)建的表達(dá)體系，可有用地轉(zhuǎn)錄和翻譯外源基因，較好地完成糖基化、磷酸化、二硫鍵形成等加工修飾歷程

15、，較客不雅地表達(dá)天然卵白質(zhì)的布局并維持其生物學(xué)活性。2022年，蘇志堅(jiān)等19用天蠶素雜合肽基因和人酸性成纖維細(xì)胞生長因子基因構(gòu)建成交融基因重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到酵母中舉行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物既有抗菌肽的抑菌活性，又有細(xì)胞生長因子的促進(jìn)傷口愈合的本領(lǐng)。在桿狀病毒介導(dǎo)的昆蟲表達(dá)體系應(yīng)用中，Hellers等20將編碼天蠶素肽原的前體片斷克隆至苜蓿歪紋蛾核型多角病毒啟動(dòng)子的卑劣，目的基因樂成地在重組熏染的粉紋夜蛾末齡幼蟲和天蠶滯育蛹中表達(dá)，且產(chǎn)量很高。3.3昆蟲抗菌肽基因工程研究中碰到的題目及辦理方案昆蟲抗菌肽奇特的良好性使人們?cè)桨l(fā)致力于對(duì)它的研究，但是要得到足量的抗菌肽交換傳統(tǒng)抗生素用于臨床，還存在很多題目

16、有待辦理。針對(duì)上述困難，應(yīng)用當(dāng)代基因工程技能，如突變體技能，交融卵白表達(dá)技能，展示技能，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等舉行的消費(fèi)革新大概會(huì)成為人們得到藥用抗菌肽有用的、具有潛力的途徑?？咕幕虮磉_(dá)的研究最初是在原核表達(dá)體系中舉行的，但由于抗菌肽對(duì)細(xì)菌的殺傷作用及原核表達(dá)缺乏酰氨化成效，因此抗菌肽基因只能以交融卵白情勢在E.li中表達(dá)，串聯(lián)體表達(dá)是增長目的肽的表達(dá)服從的有用途徑，是將肽抗生素基因一個(gè)緊接一個(gè)串聯(lián)起來，此后插入相宜的表達(dá)載體中舉行表達(dá)。如許，一方面借助串聯(lián)體的空間折疊來屏蔽肽抗生素單體大概給工程菌帶來的毒性，另一方面使用串聯(lián)單體間卵白酶或化學(xué)裂解位點(diǎn)可將交融卵白落解成單體而大大進(jìn)步表達(dá)物產(chǎn)率。如

17、Lee等21將蟾蜍肽抗生素bufrin基因毗連成串聯(lián)體，效果多聚體在大腸桿菌中以包容體情勢高程度表達(dá)，而且，其抗微生物活性與天然bufrin同等。這種多拷貝串聯(lián)表達(dá)的形式不但明顯進(jìn)步了重組肽抗生素的產(chǎn)率，而且為其他小分子活性肽的表達(dá)制備提供了新思緒。別的，要得到天然基因表達(dá)的不變抗菌肽，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獵取有殺菌活性的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物將是一條抱負(fù)的途徑。Yarus等24將小鼠乳清酸卵白基因AP調(diào)控序列與牛氣管抗菌肽基因(TAP)構(gòu)建的pAPbTAP交融基因注入小鼠原核期受精卵，樂成得到了pAPbTAP轉(zhuǎn)基因小鼠，并從乳汁中得到了目的基因產(chǎn)物，體外試驗(yàn)證明，此種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌具有殺傷作用。通過轉(zhuǎn)基因

18、動(dòng)物還可以進(jìn)步動(dòng)物抗病本領(lǐng)和熏抱病防治本領(lǐng)，Reed等25將小鼠IL-2基因與抗菌肽shivala基因和sV40多腺苷酸化剪接信號(hào)肽毗連構(gòu)建的交融基因，注入小鼠原核期受精卵，效果該轉(zhuǎn)基因老鼠對(duì)基因布魯氏桿菌熏染抗菌本領(lǐng)顯著加強(qiáng)。這使得應(yīng)用抗菌肽相干基因?qū)δ承┤祟愲y治性疾病舉行基因治療不再成為空想。在轉(zhuǎn)基因植物研究方面，Shara等26將天蠶肽erpinsB基因轉(zhuǎn)入水稻，使用稻谷殼質(zhì)酶信號(hào)肽使erpinsB排泄到細(xì)胞間隙,一方面庇護(hù)了目的肽免受細(xì)胞質(zhì)中肽酶的落解，另一方面，得到了抗病本領(lǐng)加強(qiáng)的植株品系。隨著對(duì)昆蟲抗菌肽的種類、布局和作用機(jī)理的進(jìn)一步探究，抗菌肽的基因工程研究將不竭深化，通過基因工

19、程技能改革抗菌肽基因布局，從而得到越發(fā)不變的高活力抗菌肽，必將促進(jìn)其在各范疇的普及應(yīng)用，具有極大的應(yīng)用遠(yuǎn)景。4昆蟲抗菌肽在醫(yī)藥中的應(yīng)用遠(yuǎn)景抗生素的創(chuàng)造曾經(jīng)為人類抗御疾病提供了有用本領(lǐng)。但是，隨著抗生素的濫用，病原微生物也在變異和進(jìn)化中不竭捕捉耐藥本領(lǐng)，以致近些年不竭有“超等細(xì)菌的消息見諸報(bào)道。作為新一代天然抗生素，抗菌肽的作用機(jī)理差異于傳統(tǒng)抗生素，它通過電荷中和的機(jī)制穿透細(xì)菌膜性布局殺死細(xì)菌，即它作用于靶“布局而非“成效，因此，極大地淘汰了靶菌株產(chǎn)生抗藥性的大概性；別的，只管昆蟲抗菌肽的有用活性濃度與傳統(tǒng)的抗生素比擬相對(duì)較低，但是由于它具有抗菌譜廣、種類多、對(duì)很多致病菌都具有顯著有用的抗菌作用

20、，以及無致畸性、無積蓄毒性等特點(diǎn)，均使其作為現(xiàn)有抗生素大概的有用交換品而備受人類的青睞。如今，對(duì)抗菌肽的研發(fā)事情已經(jīng)生長到疾病防治的各個(gè)范疇，一些抗菌肽已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。美國馬蓋寧制藥公司已挑選出一種源于蛙皮素againin的小肽SI-78，在期臨床試驗(yàn)的926例糖尿病患者中，其對(duì)多種病原菌熏染引起的足潰瘍均有明顯療效；在腦脊髓膜炎、人幽門螺旋桿菌熏染及抗真菌熏染等范疇抗菌肽已經(jīng)進(jìn)入了臨床前期應(yīng)用階段27；德國粹者已將從果蠅體內(nèi)提取的抗菌肽用于化療和器官移植后出現(xiàn)的重度真菌熏染等治療。在我國，一些抗菌肽作為臨床新藥已經(jīng)得到了開端樂成，如用于治療腎炎的“腎肝寧及容許作為類西藥舉行臨床不雅察的乙型肝炎新藥；而以抗菌肽作為消洗劑、治療胃十二指腸潰瘍及消化道炎癥等新藥的臨床實(shí)行也正在舉行中28?？咕脑谛滤庨_拓中越來越表示出宏大的應(yīng)用潛力,并成為研究熱門，隨著新型抗菌肽的不竭創(chuàng)造以及基因工程改革抗菌肽的日趨美滿，抗菌肽極有大概作為一種寧靜有用的新型藥物普及應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床范疇。5預(yù)測20世紀(jì)90年代后期以來，隨著分子生物學(xué)技能在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)范疇的普及應(yīng)用，某些昆蟲抗菌肽的基因或DNA片斷已經(jīng)被連續(xù)克隆和分散出來，使得人們對(duì)抗菌肽的性子和特性有了進(jìn)一步的相識(shí)29。研究創(chuàng)造，差異種類的昆蟲所