1、1. 質粒DNA提取2. 限制性內切酶切割重組質粒實驗三實驗目的掌握質粒提純的原理和方法;掌握核酸內切酶切割質粒的原理并學會運用內切酶.預習：基因克隆示意圖基因克隆操作過程： 分分離載體和目的基因 切限制酶切載體與目的基因接拼接重組體 轉轉入受體菌 篩篩選重組體 基因載體（gene vector）什么是基因載體 把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行復制和表達的工具基因載體的作用為目的基因提供進入受體細胞的轉移能力為目的基因提供在受體細胞中的復制（或整合）和表達所需條件基因載體應具備特點1.具有獨立復制能力，在細胞中能大量繁殖，從而使目的基因大量擴增2.作為表達載體

2、應能利用宿主的酶系統(tǒng)，表達目的基因（表達能力）3.具有適當?shù)南拗菩詢惹忻缸R別和切割位點（酶切位點）4.細胞內穩(wěn)定性高（持續(xù)表達和復制）5.具有供篩選用的（遺傳標記）6.相對分子量小（一定的容量）6基因載體類型質粒(plasmid)粘粒（cosmid）噬菌體(phage)病毒(virus)DNA染色體（BAC/YAC）7一.質粒DNA的制備1 關于質粒的概念a.什么是質粒（plasmid）？b.質粒的本質是什么？c.質粒有哪些構型？c.質粒有哪些特點？d.質粒的用途有哪些？8(1)質粒的定義 質粒是存在于細菌體內、獨立于染色體的、可以自主復制的一類雙鏈環(huán)狀DNA，在細胞內它們常以共價閉環(huán)的超螺旋

3、(supercoil)形式存在。 9 超螺旋DNA(SC DNA)(2)質粒的三種構型10 開環(huán)DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂，分子就發(fā)生旋轉而消除鏈的張力，形成松弛型的環(huán)狀分子。11 線狀DNA(linear DNA,L DNA): 如果兩條鏈均斷開，即為線狀DNA。電泳時，三者泳動速度大小關系（？） 12(3)質粒DNA的一般特性： 質粒是細菌內的共生型遺傳因子,有相對獨立性。 它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞一些表型。 它是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等。13(4)提取質粒DNA的目的與意義（？） 基因載體/基因克隆/

4、基因工程2 提取質粒DNA的常規(guī)方法:2.1 核酸分離純化的總原則： 保證核酸一級結構完整 排除其他分子的污染（蛋白質、脂類、 糖、有機溶劑、金屬離子、其他DNA、RNA等）2.2 分離純化質粒DNA 的主要步驟培養(yǎng)細菌使質粒擴增（DNA的擴增與選擇）細菌的收集與裂解 收集高速離心的方法質粒DNA的純化 所有純化方法都是利用了質粒DNA相對較小及共價閉合環(huán)狀的性質。3. SDS-堿裂解法提取質粒DNA3.1 實驗原理：在有EDTA及去污劑（SDS）存在的條件下，用堿處理細菌，可以使細菌的細胞壁破裂，釋放出細胞內容物（染色體DNA、質粒DNA、蛋白質和RNA等）；處理過程中，染色體DNA斷裂成不

5、同長度的雙鏈DNA。16強堿環(huán)境（pH12.0-12.6）時：宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性，而質粒DNA共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離；當加入高濃度酸性鹽，pH值恢復至中性時：變性的染色體DNA與變性的蛋白質以及細胞碎片凝聚成網絡狀大分子不溶性沉淀物；而質粒DNA又恢復天然構型，能溶解在上清液中，這樣通過離心可以把染色體DNA、蛋白質-SDS復合物等一起除去。17如果要提高DNA的純度，則可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質。183.2 主要試劑及作用溶液：由葡萄糖、EDTA、TrisCl組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的 機械

6、剪切作用,防止破壞質粒.(保護作用) EDTA 的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子,防止DNA酶對質粒分子的降解作用。（保護作用） TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）19 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成 SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之 變性（裂解細胞和蛋白質變性作用） NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用） 20溶液III：HAC和KAC組成的高鹽溶液(復性作用)HAC溶液能中和溶液的堿性，使染色體DNA 變性而發(fā)生纏繞并使質粒DNA復性。KAC會與SDS溶解度很低的鹽，并與蛋白質形成 沉淀而除去；溶液

7、中的DNA也會與蛋白質-SDS 復合物纏繞成大分子而與小分子質粒DNA分離。 實驗步驟及注意事項加1.4ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm30S 除去上清，再取1.4ml離心30s 除去上清，加入冰的100 l溶液I，顛倒EP管，混勻加入200l溶液II，溫和混勻，冰浴35min加入150l冰溶液III，溫和混勻，冰浴35min，12000rpm5min 轉移上清到新EP管，加入等體積酚和氯仿/異戊醇，12000rpm5min 轉移上清到新EP管，加入等體積氯仿/異戊醇，12000rpm5min 上層水相轉移到新EP管，加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，-20 冰箱中放置20min，12000

8、5min 棄上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm5min 去上清，管平放室溫靜置1015min ， 20 l TE 溶解DNA注意事項： 1、加樣槍正確使用； 2、標記自己所提取的質粒類型（pUC119-U6 ）； 3、廢液倒在水池中，槍頭扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要換槍頭； 5、離心前把管擦干； 6、轉移上清時不要吸到沉淀； 7、吸取酚時槍頭伸到下層溶液中，注意不要沾到 皮膚。二、限制性內切酶切割重組質粒 1 關于限制性核酸內切酶 （restriction endonuclease）定義 能在特異位點（酶切位點）上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產生相應的限制性DNA片段。 主要

9、存在于細菌體內。 切割不同來源的DNA分子將產生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應用價值（“分子手術刀”）。24作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護自身DNA。分類、（基因工程技術中常用型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶類酶識別序列特點 回文結構(palindrome)切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G

10、+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口影響限制酶活性的因素1）“星”活性 酶的特異性改變或特異性降低而呈現(xiàn)的活性。 EcoR：GAATTC EcoR*： AATT2）甲基化 識別序列中某些堿基甲基化后會阻礙酶活性。3）底物性狀4）試劑：緩沖系統(tǒng)pUC18/19酶切位點的分布示意圖2 BamHI 、Hind酶切重組質粒及鑒定1 實驗原理： 利用限制性內切酶特異的識別DNA特異的核苷酸序列，并切割DNA,產生一定長度的DNA片段，通過電泳對酶切前后產物分析可以鑒別目的基因（重組質粒DNA）31重組質粒BamHIHind III雙酶切電泳檢測5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III2 實驗材料: 重組質粒; BamHI 、Hind 限制性內切酶;反應緩沖液;瓊脂糖凝膠電泳所需試劑和設備。333 實驗步驟:A 建立反應體系B 酶切反應（溫育1-3h）C 電泳鑒定344、雙酶切體系（0.2mlEP管）： 質粒DNA 1