1、山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系實(shí)驗三 細(xì)胞化學(xué) 目的要求1. 掌握甲基綠-派洛嚀染色法原理及操作2. 了解幾種化學(xué)成分的顯示方法及原理3. 觀察各種化學(xué)成分在細(xì)胞中的分布4. 了解PCC原理5.了解細(xì)胞融合及其應(yīng)用內(nèi)容（一）錄像 ：克隆羊（二）光鏡下細(xì)胞成分的觀察1.糖原（動物肝切片，PAS反應(yīng)）胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（periodic acid）氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫(Schiff )試劑中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色染料而沉積于胞漿中。 2.酸性蛋白（蟾蜍血涂片，酸性固綠染色）細(xì)胞質(zhì)和核仁中蛋

2、白質(zhì)均被染成綠色4.酸性磷酸酶（鼠腹腔液涂片，金屬沉淀法顯色） 主要定位于溶酶體中5.DNA（兔肝切片，F(xiàn)eulgen反應(yīng)顯色）HCl酸解使DNA醛基暴露醛基與Schiff試劑發(fā)生顯色反應(yīng) 6.吖啶橙熒光染色DNA,RNA（人口腔粘膜上皮細(xì)胞涂片，熒光顯微鏡觀察。示教）吖啶橙與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別, DNA高度聚合，吸收熒光物質(zhì)的位置較少，發(fā)綠色熒光，而RNA聚合度低,能和熒光物質(zhì)結(jié)合的位置多，故發(fā)紅色熒光。7.細(xì)胞融合（雞血細(xì)胞）仙臺病毒法融合聚乙二醇（PEG）法（分子量大于200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑）電融合法（融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害??；方法簡單、可在顯微鏡

3、下觀察融合過程；誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)，遺傳學(xué)，免疫學(xué)，病毒學(xué)等多種學(xué)科的研究工作中 8.（細(xì)胞）將處于分裂期(M期)的細(xì)胞與處于間期的細(xì)胞融合, 使其他期細(xì)胞的染色質(zhì)提早包裝成染色體，這種現(xiàn)象稱為染色體早熟凝集(premature chromosome condensation, PCC)。由于G1 、S、 G2的DNA復(fù)制狀態(tài)不同，早熟凝集的染色體的形態(tài)各異，如與M期細(xì)胞融合的G1期的染色體為單線狀, S期為粉末狀, G2期染色體為雙線。ProphaseMetaphaseMitosisInterphase Cell cycle （三）操作 制作蟾蜍血涂片（顯示、）原理甲基綠派洛

4、嚀是兩種堿性染料，與帶負(fù)電荷的磷酸根形成鹽健。甲基綠分子有兩個正電荷，易于雙鏈DNA分子結(jié)合，使DNA顯示綠色，派洛嚀分子有一個正電荷，易于單鏈RNA結(jié)合使RNA顯示紅色。 1 左手四指下面腹部回拉，拇指背部前推，這樣做可減少蟾蜍掙扎的力度。2 殺蛙針從雙耳后腺到劃的倒三角的頂點(diǎn)（腦髓位置）插入1mm左右，旋轉(zhuǎn)針尖攪動腦髓4，5圈，然后保持針尖在腦髓內(nèi)的時候放平針尖對貼著下背部從脊柱方向插入脊柱破壞脊髓，抽動1，2次。 蟾蜍就完全失去活動能力了。頭部與身體交界處有皺褶搗毀脊髓時后肢強(qiáng)直狀剪開腹部皮膚蟾蜍內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖 步驟殺蟾蜍取血血涂片酒精固定分鐘滴甲基綠派洛嚀，染色3分鐘沖洗觀察蛙血涂片的制作 將蛙血滴在載玻片中外1/3處，取另一張邊緣光滑的載玻片做推片，將其一端至于血滴前方，向后拉到接觸血滴，使血液均勻分散在載玻片與推片的接觸