1、甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒提高抗腫瘤藥物對肝細(xì)胞癌的靶向性和療效肝癌、肝炎等肝臟疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病 , 常規(guī)劑型的藥物經(jīng)靜脈注射、口服或局部注射后 , 藥物非特異性分布于全身 , 毒副作用較大。靶向給藥系統(tǒng)通過載體可將藥物選擇性遞送至肝臟的病變部位, 可降低對正常組織和全身的毒副作用 , 減少給藥劑量和給藥次數(shù), 提高藥物功效。其中兩親性聚合物納米粒作為給藥載體 , 可提高難溶性藥物的溶解性和穩(wěn)定性、延長血液循環(huán)時(shí)間、改善藥物體內(nèi)分布, 并具有良好的緩控釋效果。聚合物納米粒表面經(jīng)特異性配體（GL）修飾，可實(shí)現(xiàn)藥物對肝癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向。據(jù)此，設(shè)計(jì)并研究新型肝靶向性聚合物納米

2、粒-甘草酸（GL）修飾竣甲基殼聚 糖納米粒（CMCNP-GL）以紫杉醇（PTX）為抗月中瘤模型藥物制備載藥納米粒,研究 PTX/CMCNP-GL理化性質(zhì)、載藥與釋藥、體外細(xì)胞攝取與體內(nèi)組織分布、體外 細(xì)胞增殖抑制與體內(nèi)抑瘤率,考察不同GL取代度對PTX/CMCNP-GL內(nèi)外肝癌細(xì) 胞靶向性及抗月中瘤效果的影響，并通過體內(nèi)外試驗(yàn)初步評價(jià)CMCNP-G體的安 全性。1CMCNP-GL制備與表征以O(shè)-竣甲基殼聚糖（O-CMC訥親水主鏈，甲基丙烯 酸甲酯（MMA訥疏水單體，在APS引發(fā)劑作用下，通過自由基聚合法制得具有核殼 結(jié)構(gòu)的羧甲基殼聚糖納米粒（CMCNP。）高碘酸鈉氧化甘草酸制備GL醛,經(jīng)氨醛縮

3、合與硼氫化鈉還原反應(yīng)將 GL醛接 枝至CMCNP面游離氨基，制得CMCNP-GL改變投料比合成不同GL取代度的 CMCNP-GLMCNP-GL2 CMCNP-GL干TIR、1HNMRDSCS征 CMCNP-GL結(jié)構(gòu),TEM 觀察納米粒形態(tài)，分別測定GL取代度、接觸角、粒徑和Zeta電勢，并研究 CMCNP-GL不同條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明CMCNP-GLCMCNP-GL2 CMCNP-GL4的GL取代度分另為2.4%、6.9%ffi 9.6%;CMCNP-GL大小均一的球形粒子，平均水合動(dòng)力學(xué)粒徑為100 250nm，生理?xiàng)l件下荷恒定負(fù)電(-30mV)。隨GL取代度的增大，粒徑先增加后減 小

4、,Zeta 電勢無明顯改變, 納米粒表面親水性逐漸增強(qiáng)。CMCNP-GL有良好的凍干和貯存穩(wěn)定性，不同的pH、離子強(qiáng)度及生理?xiàng)l件下 理化性質(zhì)均保持穩(wěn)定。2載紫杉醇CMCNP-GL制備、表征及體外釋藥特性以PTX 為模型藥物，研究CMCNP-G作為難溶性抗月中瘤藥物載體的特點(diǎn)。超聲法制備不同GL取代度的PTX/CMCNP-G側(cè)定其平均水合動(dòng)力學(xué)粒徑為 110205nm，生理?xiàng)l件下Zeta電勢約為-30mV,與相對應(yīng)的空白納米粒粒徑與 Zeta電勢基本相同。不同GL取代度的CMCNP-G載藥量與包封率均隨GL取代度 的增加而增大，對PTX的包封率均高于69.0%,最高可達(dá)81.5%;載藥量均高于

5、13.0%,最高可達(dá)15.1%。PTX/CMCNP-GL體外釋放表現(xiàn)為先突釋后緩釋的釋放行為,PTX釋放速率隨 GL取代度的增加而減慢，均顯著低于PTX/CMCNP,明GL表面修飾可增強(qiáng)CMCNP 對PTX的緩釋能力。不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放百分 率無顯著性差異。3載紫杉醇CMCNP-GL體內(nèi)外靶向性制備羅丹明 B (RhB)熒光標(biāo)記納米粒 RhB-CMCNP不同GLM代度的RhB-CMCNP-G以肝癌細(xì)胞SMMC-772名正常肝細(xì) 胞 L02 為細(xì)胞模型, 研究納米粒的細(xì)胞黏附、 細(xì)胞攝取、 攝取機(jī)制與亞細(xì)胞定位。CMCNP-G在二種細(xì)胞的黏附率和攝取率均顯

6、著高于 CMCNPf同GL取代度的 CMCNP-G在肝癌細(xì)胞的黏附率和攝取率均顯著高于正常肝細(xì)胞，不同GL取代度 的CMCNP-GL間無顯著性差異。游離GL分子可與肝細(xì)胞表面GL特異性結(jié)合位點(diǎn)相互作用,競爭性抑制CMCNP-GL攝取，對CMCNP攝取無影響，該抑制作用在肝癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞顯著。CMCNP-GL2要經(jīng)小窩蛋白及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞 ,攝取過程具 有能量依賴性, 且與細(xì)胞的骨架重構(gòu)有關(guān)。GL修飾對CMCNP內(nèi)吞途徑無顯著影響,入胞后主要聚集在細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中。 以 H-22 肝癌荷瘤小鼠為模型, 分別考察空白納米粒與載藥納米粒經(jīng)靜脈注射后的體內(nèi)分布, 評價(jià)納米粒的靶向性。

7、結(jié)果表明PTX/CMCNP-GL2顯著減緩PTX在血液中的清除速率，改善PTX的體內(nèi)分布，聚集于肝臟和月中瘤，顯著降低PTX的心臟和腎臟毒性；PTX/CMCNP-GL2 對肝癌組織的靶向性顯著高于未修飾的 PTX/CMCN和PTX注射液?？瞻纵d體與載 藥納米粒的體內(nèi)分布趨勢一致。4載紫杉醇CMCNP-GL體內(nèi)外抗月中瘤功效及安全性以 SMMC-7721S胞為肝癌細(xì)胞模型研究PTX/CMCN抑制月中瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力；以 H-22 肝癌荷瘤小鼠為模型，考察載藥納米粒的體內(nèi)抗腫瘤功效，比較不同GL取代度對 載藥CMCNP內(nèi)外作用功效的影響。結(jié)果表明 PTX/CMCNP-GL顯著抑制肝癌

8、細(xì)胞SMMC-772的體外增殖，72h的IC50為2.73.2mg - ML-1,顯著低于PTX注射液(13.5mg mL-1)和 PTX/CMCNP (8.1mg-mL-1)不同 GL取代度的 PTX/CMCNP-GL 之間無顯著性差異。PTXM誘導(dǎo)一定程度白肝癌細(xì)胞凋亡，24h的凋亡率均為1020%,CMCNP米載 體及其GL表面修飾對PTX引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制和效果無顯著影響。靜脈注射 PTX/CMCNP-GL有效抑制H-22荷瘤小鼠的月中瘤生長，延長月中瘤倍增時(shí)間。PTX/CMCNP-GL抑瘤效果最佳，平均抑瘤率為87.4%,分別約為PTXS射液和PTX/CMCNP 2.5和1.6倍，表

9、明PTX經(jīng)CMCN包載后,抗月中瘤效果顯著增強(qiáng),不 同GL取代度PTX/CMCNP-GL抗月中瘤效果無顯著差異?？疾?CMCNP-GL白載體 的細(xì)胞毒性、血液相容性、急性毒性和亞急性毒性, 從細(xì)胞、組織和動(dòng)物整體水平初步評價(jià)CMCNP-G的安全性。FDA/PI 雙染色、LDH、 中性紅、蛋白質(zhì)含量測定試驗(yàn)結(jié)果表明正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞SMMC-772行不同GL取代度CMCNP-G(5mg mL-1)短時(shí)間(6h或24h) 作用后，胞外LDH釋放量、胞內(nèi)中性紅攝入量、蛋白質(zhì)含量均無顯著變化，細(xì)胞活力無顯著影響；MTT式驗(yàn)結(jié)果表明二種細(xì)胞與 CMCNP-G(5mg mL-1)較長時(shí)程(72h) 共培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖率無顯著影響，CMCNP-G細(xì)胞毒性低。CMCNP-G溶血率低于5%,血漿復(fù)鈣時(shí)間較長, 動(dòng)態(tài)凝血率低于硅化玻璃, 具有一定的抗凝血效果, 血液相容性良好。CMCNP-GL鼠尾靜脈給藥最大耐受劑量為 18