1、利用連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖解析毛白楊重要性狀的等位遺傳變異森林作為陸地生態(tài)系統(tǒng)最重要的組成部分,蘊(yùn)含了約82%的生物量和50%的生物多樣性，是人類可持續(xù)發(fā)展與可再生利用的主要資源。但我國(guó)森林覆蓋率低,國(guó)內(nèi)所需木材原料大多依賴進(jìn)口，木材資源的故略安全及國(guó)家林木育種工程面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)；而“林以種為本,種以質(zhì)為先”，常規(guī)的雜交育種策略雖為國(guó)家的速生豐產(chǎn)林建設(shè)提供了大批良種，但林木遺傳雜合度高、育種周期長(zhǎng)且重要經(jīng)濟(jì)性狀多為數(shù)量性狀等因素嚴(yán)重阻礙了林木遺傳改良進(jìn)程，當(dāng)前林業(yè)生產(chǎn)所用品種的生產(chǎn)力難以滿足工業(yè)發(fā)展對(duì)木材產(chǎn)量與質(zhì)量的需求。因此,深入研究木材形成的生物學(xué)基礎(chǔ),解析木材形成的遺傳調(diào)控機(jī)制,是加速林

2、木良種化進(jìn)程的根本。為此,本論文以我國(guó)北方重要的用材及生態(tài)型樹(shù)種毛白楊(PopulustomentosaCarr.)的自然群體與雜交群體為材料,在毛白楊木材形成相關(guān)候選基因內(nèi)微衛(wèi)星標(biāo)記資源大規(guī)模開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)上，首次開(kāi)展了以連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖為策略的研究工作,剖析了控制林木生長(zhǎng)及木材品質(zhì)性狀的等位遺傳變異,并建立了林木基因標(biāo)記輔助育種技術(shù)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下：L利用直接測(cè)序法從138個(gè)毛白楊木材形成相關(guān)候選基因內(nèi)開(kāi)發(fā)出544個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn),其中75%的位點(diǎn)位于基因的啟動(dòng)子或內(nèi)含子等調(diào)控區(qū)域。利用這些標(biāo)記在毛白楊自然群體中篩選出包含861個(gè)等位位點(diǎn)的188對(duì)多態(tài)性SSR引物,每一標(biāo)記平均

3、等位位點(diǎn)數(shù)目為2-7個(gè)。隨機(jī)選擇30對(duì)基因內(nèi)SSR引物對(duì)楊樹(shù)屬內(nèi)五個(gè)楊派26個(gè)種間個(gè)體(饅頭柳作為類外群)進(jìn)行種間轉(zhuǎn)移檢測(cè)發(fā)現(xiàn),72%的基因內(nèi)SSR標(biāo)記可以在胡楊派中有效擴(kuò)增，而在白楊派種間擴(kuò)增率為100%:eighbor-Joining(NJ)聚類分析確定/符合楊屈傳統(tǒng)分類的6個(gè)譜系分組。另外,通過(guò)比較220對(duì)包含基因內(nèi)SSR位點(diǎn)的毛白楊與毛果楊同源序列，確定了種間SSR變異的主要原因是SSR位點(diǎn)側(cè)翼序列的突變及重復(fù)基元類型的改變。進(jìn)一步的雜交群體遺傳分離檢測(cè)及單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析表明開(kāi)發(fā)的基因內(nèi)SSR標(biāo)記資源在關(guān)聯(lián)作圖、遺傳連鎖作圖及近緣種比較基因組學(xué)等方面均具有較大的應(yīng)用潛力。2.群體遺傳多樣

4、性及群體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)是開(kāi)展連鎖不平衡作圖及構(gòu)建核心種質(zhì)資源的前提。本文利用20對(duì)毛白楊特異性SSR標(biāo)記對(duì)選擇于毛白楊種質(zhì)資源基因庫(kù)的460株個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性評(píng)價(jià),共確定了99個(gè)等位位點(diǎn),其平均觀測(cè)等位位點(diǎn)數(shù)目為4.05,顯示了該群體具有中等遺傳多樣性水平。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明,毛白楊種質(zhì)資源可以劃分為11個(gè)亞群體(K=ll)。對(duì)STRUCTURE模型確定的K=3情況下的亞群體組成進(jìn)行分析,表明了毛白楊三個(gè)氣候區(qū)可以分別作為相對(duì)獨(dú)立的遺傳群體進(jìn)行相關(guān)研究。對(duì)不同氣候區(qū)的遺傳多樣性檢測(cè)表明南部氣候區(qū)具有最豐富的遺傳多樣性水平(N=93,Np=ll,HE=0.445,F=-0.102),東北及西北氣

5、候區(qū)次之,表明南部氣候區(qū)是當(dāng)前毛白楊生長(zhǎng)分布的中心區(qū)域。利用建立的“UPGMA-聚類分析逐次隨機(jī)取樣”與“群體結(jié)構(gòu)重檢測(cè)”聯(lián)合分析法對(duì)毛白楊種質(zhì)資源進(jìn)行核心種質(zhì)群體構(gòu)建，確定15%(69)的比例選擇出來(lái)的毛白楊核心種質(zhì)群體是最理想的。3.進(jìn)一步的連鎖不平衡研究顯示,在毛白楊候選基因內(nèi)1,200bp距離內(nèi)連鎖不平衡水平已衰退至不明顯，顯示了基于候選基因的連鎖不平衡作圖策略在林木中具有更高的效力。利用混合線性模型進(jìn)行單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析,確定了來(lái)自于39個(gè)候選基因的48個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)與10個(gè)生長(zhǎng)與木材品質(zhì)性狀顯著連鎖，構(gòu)成80個(gè)關(guān)聯(lián)(Q20.10),每一標(biāo)記位點(diǎn)可解釋表型變異的1.20314.5機(jī)基于

6、單倍型的關(guān)聯(lián)分析確定了來(lái)自于32個(gè)高連鎖區(qū)域(代表20個(gè)基因)的64個(gè)單倍型與10個(gè)性狀的80個(gè)關(guān)聯(lián)(QW0.10)。比較單標(biāo)記及單倍型的關(guān)聯(lián)結(jié)果顯示單倍型效應(yīng)主要來(lái)自于其包含的顯著單標(biāo)記位點(diǎn)，基于單倍型的關(guān)聯(lián)分析并沒(méi)有顯現(xiàn)出更高的作圖分辨率。4.利用1200株銀腺楊X毛白楊雜交F1連鎖作圖群體構(gòu)建了首張基于候選基因內(nèi)共顯性標(biāo)記的毛白楊高密度、高解析度遺傳連鎖圖譜。其中，在L0D25.0,rW0.25條件下，確定了包含1270個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(309個(gè)SSR、929個(gè)AFLP和32個(gè)InDei)的19個(gè)較大的連鎖群,連鎖位點(diǎn)覆蓋毛白楊基因組總長(zhǎng)約2758.6cM,標(biāo)記間平均遺傳距離為2.3cMo34

7、1個(gè)基因內(nèi)共顯性標(biāo)記在連鎖圖譜的標(biāo)定代表了候選基因的定位,為后期開(kāi)展重要性狀的QTL作圖提供了科學(xué)的遺傳平臺(tái)。5.基于遺傳圖譜信息,利用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)光合相關(guān)性狀、生物量、葉片性狀和木材品質(zhì)等28個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行了QTL分析。當(dāng)L0D值22.5時(shí),共檢測(cè)到與25個(gè)表型性狀相關(guān)的179個(gè)QTLs,每一標(biāo)記可解釋表型變異的1.27%-30.02%,顯示不同復(fù)雜數(shù)量性狀具有不同的遺傳控制機(jī)制。所有179個(gè)QTL按照光合相關(guān)性狀、葉片性狀、生物量及木材品質(zhì)分組后確定的QTL數(shù)目是10-84個(gè),不均勻地分布到18個(gè)連鎖群上,平均9.4個(gè)。LGVI和LGXII是控制這些性狀的重要區(qū)域,LG_XIII上沒(méi)有

8、發(fā)現(xiàn)與所有28個(gè)數(shù)量性狀相關(guān)的QTL。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)80%的QTLs區(qū)間內(nèi)包含基因內(nèi)共顯性標(biāo)記,其隸屬的基因主要包括與細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)的重要調(diào)控基因或轉(zhuǎn)錄因子，如類核酸剪切調(diào)控蛋白基因、蛋白酶體調(diào)控亞基S3蛋白家族基因和鋅指蛋白家族基因等，另外一部分是控制木材形成及生長(zhǎng)的功能基因，如纖維素合酶基因家族成員（CesA3、CesA7和CesA9）,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因與EXP1基因等。6.利用連鎖與連鎖不平衡聯(lián)合作圖策略，確定了來(lái)自產(chǎn)27個(gè)候選基因的29個(gè)SSR與8個(gè)生長(zhǎng)與木材品質(zhì)性狀組成的39個(gè)顯著關(guān)聯(lián)（QWO.10）。進(jìn)一步比較了每個(gè)顯著標(biāo)記在兩個(gè)作圖群體內(nèi)對(duì)應(yīng)的基因型效應(yīng)，最終選擇基因型效應(yīng)一