1、第八章 原位雜交組織化學原位雜交組織化學ISHH原理：用標志的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的方法。特點：雜交在載玻片上的細胞進展。分類：根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同- DNA-DNA雜交、 DNA-RNA雜交、 RNA-RNA雜交根據(jù)探針標志物能否直接被檢測 直接法、間接法一 原位雜交的由來與開展一核酸分子雜交技術按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種液相雜交：參與反響的兩條核酸鏈都游離在溶液中。 液相分子雜交技術包括： 吸附雜交 發(fā)光液相雜交 液相夾心雜交 復性速率液相分子雜交固相雜交： 是將參與反響的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼

2、龍膜、乳膠顆粒和微孔板等，另一條參與反響的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交技術包括： 菌落原位雜交 斑點雜交法 Southern印跡雜交 Northern印跡雜交 組織原位雜交二原位雜交技術的開展在近20年飛躍開展的突出特點： 由分子遺傳學研討提供的探針大量添加； 探針消費的可靠性和速率大大開展了； 非放射性標志物的開展使原位雜交技術成為實驗室的常規(guī)技術和臨床日常運用的診斷技術。 新的非放射性標志技術正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。二 原位雜交組織化學根本技術原位雜交的根本方法和運用原那么： 雜交前預備，包括固定、取材、玻片和組織的處置，如何加強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； 雜交； 雜交后處置； 顯示vi

3、sualization： 放射性自顯影顯色、非放射性標志顯色一原位雜交的根本要求1 固定2 玻片和組織切片的處置3 雜交4 雜交后處置5 顯示6 對照實驗和ISHH結(jié)果的判別 1 固定 固定劑的運用和選擇原那么： 堅持細胞構造； 最大限制地堅持細胞內(nèi)DNA或RNA程度； 使探針易于進入細胞或組織。 DNA：比較穩(wěn)定，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不非常重要。RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低限制，固定劑的種類、濃度和固定的時間非常重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。固定劑：多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouins固定劑、 Carnoys液 優(yōu)缺陷： 沉

4、淀性固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouins液、 Carnoys液 能添加核酸探針的穿透性，但不能最大限制地保管RNA， 且對組織構造有損傷。 戊二醛：能較好地保管RNA和組織形狀構造，但由于和蛋白質(zhì) 產(chǎn)生廣泛的交叉銜接，從而影響了核酸探針的穿透性。 多聚甲醛：仍被公以為ISHH較為理想的固定劑。 多聚甲醛mRNA的定位 將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中12h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱過夜，次日切片或保管在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。 組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣枯燥后保管在-70。如冰箱溫度恒定，在-70可保管數(shù)月

5、之久不會影響雜交結(jié)果。病理學活檢取材 福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號。石蠟包埋切片 由于與蛋白質(zhì)交叉銜接的添加，影響核酸探針的穿透，因此雜交信號常低于冰凍切片，同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。冷凍切片 運用多聚甲醛蒸汽固定枯燥后的冷凍切片也可獲得稱心效果。2 玻片和組織切片的處置 1玻片的處置 熱肥皂刷洗 自來水清洗 清潔液中浸泡24h 清水洗凈 烘干 95%酒精中浸泡24h 蒸餾水沖洗 烘干 烘箱溫度150過夜以去除RNA酶 蓋玻片硅化處置 錫箔紙包裹無塵存放2加強組織的通透性和核酸探針的穿透性 根據(jù)運用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核

6、酸探針長度而定。 常用方法： 稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑 Triton X-100、酒精或某些消化酶等。 優(yōu)點: 經(jīng)過去蛋白作用加強組織通透性和探針的穿透性,提高雜交信號. 缺陷: 減低RNA的保管,影響組織構造形狀.因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。3減低背景染色 預雜交Prehybridization: 是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預雜交液中可到達封鎖非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。雜交后洗滌: 采用低濃度的RNA酶溶液20g/ml洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。4防止RNA酶的污染 在

7、整個雜交前處置過程都需戴消毒手套。 一切實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤消除RNA酶,亦可用消毒鍋。 要破壞RNA酶，最低溫度必需在150左右。 消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標志和防止取出 時空氣污染。 雜交前及雜交時所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處置。3 雜交Hybridisation雜交:核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。 是ISHH中關鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。 雜交方式:是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。 加蓋片的目的 防止孵育過程中的高溫50左右導致雜交液的蒸發(fā); 硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑,無氣泡,不會影響組織切片與雜交液的接觸; 蓋玻片

8、本身分量能與雜交液吸附到達覆蓋和防蒸發(fā)的作用。雜交留意環(huán)節(jié) 1探針的濃度 原那么:探針濃度必需給予該實驗最大的信/噪比值。最正確原那么應是運用最低探針濃度以到達與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。雜交液的量要適當:以1020l/每張切片為宜。雜交液過多浪費，且液量過多常易致蓋玻片滑動零落,過量的雜交液含核酸探針濃度過高，易導致高背景染色等后果。 2探針的長度 最正確長度應在50100個堿基之間。 探針短- 易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。 500個堿基的探針- 雜交時間約需20h左右。 200500個堿基的探針- 可運用. 超越500個堿基的探針- 在雜交前最好用堿或水解酶進 行水解，使其變成

9、短的片段， 到達實驗所需求的堿基數(shù)。 3雜交的溫度和時間 雜交溫度： DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才干進展雜交。原位雜交中，DNA、RNA探針需求的Tm分別是90、95，這種高溫對保管組織形狀完好和堅持組織切片粘附在載玻片上是不能夠的。因此，在雜交液中參與鹽和甲酰胺，減低Tm。根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差別。 雜交時間： 16-20h或孵育過夜甲酰胺：在雜交液中占50%左右；調(diào)理雜交反響溫度，利于堅持組織形狀構造；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。硫酸葡聚糖：在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水協(xié)作用，因此能大大添加雜交液

10、的粘稠度；促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。甲酰胺和硫酸葡聚糖： 4雜交嚴厲度Hybridization stringency 雜交嚴厲度：表示經(jīng)過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。 錯配對雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，經(jīng)過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的構成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反響亦然。低嚴厲度：雜交及沖洗條件在Tm3540之間，高鹽或低甲酰胺濃度。大約有70%90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。 中嚴厲度：Tm 20-30的范圍。高嚴厲度：為 Tm10-15，低鹽和高甲

11、酰胺濃度。只需具有高同源性的核苷酸序列才干構成穩(wěn)定的結(jié)合。4 雜交后處置包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的：經(jīng)過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。洗滌的條件：如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標志的種類不同而略有差別，普通遵照的共同原那么是鹽溶液濃度由高到低，而溫度那么由低到高。本卷須知： 漂洗過程中切勿使切片枯燥。枯燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而加強了背景染色。 放射性標志探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法測背景染色作為改善漂洗程序的指針。5 顯示 Visualization 又稱檢測系

12、統(tǒng) Detection system根據(jù)核酸探針標志物的種類分別進展放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進展不同顯色處置。放射自顯影： 圖象分析儀檢測銀粒的數(shù)量和分布的差別。 非放射性核酸探針雜交的細胞或組織： 酶檢測系統(tǒng)顯色 顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。6 對照實驗和ISHH結(jié)果的判別 Northern 和 Southern印跡雜交法。 可用結(jié)合的免疫組織化學和ISHH法從蛋白質(zhì)或多肽水平和轉(zhuǎn)錄程度在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應mRNA共存于同一細胞中。 預先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術證明喪失的是DNA或RNA。事先與特異性的cRNA或cDNA進展雜交。再進展I

13、SHH，其結(jié)果應為陰性。由于同一RNA探針和組織內(nèi) mRNA序列順序是一樣的，運用其進展ISHH，結(jié)果應為陰性。 檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應在無標志探針的情況下進展。 多要素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。二核酸探針1 核酸探針的種類2 探針的標志與運用 1 核酸探針的種類 1按標志方式分類 直接法和間接法： 直接標志探針 運用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素FITC或羅丹明Rhodamine等熒光物質(zhì)的dNTP或NTP直接標志探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測。 間接標志探針 采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標志探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進展檢測，配體上分別連有不

14、同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下察看分析。兩種方法的比較：1直接標志的DNA探針雜交后經(jīng)過簡單洗滌就可顯示雜交信號，簡一方便，而間接標志的探針雜交后需經(jīng)過繁瑣的檢測步驟；2間接標志的探針可進展多步驟信號放大，但其受配基親和力的影響。而直接標志的信號放大普通遭到限制，目前多用Dupon公司的TSA系統(tǒng)進展直接標志信號的放大。3對于多色FISH，往往選擇直接標志法標志探針。 2按核酸性質(zhì)分類 DNA探針 cDNA探針 RNA探針 寡核苷酸探針3按染色體上位置分類： 反復序列探針 涂染探針 基因探針及其它2 探針的標志與運用 切口平移法Nick translation隨機引物法 (Random Prim

15、er)末端標志法PCR標志法體外轉(zhuǎn)錄標志法不同模板需不同標志方法 生物素標志cRNA探針在原位雜交組織化學中的運用1 光敏生物素標志cRNA探針的運用2 酶促生物素標志cRNA探針的運用1 光敏生物素標志cRNA探針的運用 光敏生物素標志核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照1020min，生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上，屬于化學修飾法，此方法簡單；本錢低；適用于大量制備50ug。光敏生物素試劑種類： 光生物素乙酸鹽 補骨脂素生物素。 生物素-聚乙二醇-當歸素BPA：在長波UV下它可與DNA堿基共價鍵結(jié)合。BPA反響物與DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反響，這個特異性可使BPA

16、只標志粗制細胞裂解物中的核酸，而不標志蛋白、多糖和其他細胞大分子。光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下： 石蠟切片脫蠟入水后，PBS洗；冰凍切片直接入PBS洗。 0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。 0.4%Trixtion X-100 PBS洗15min。 1ug/ml蛋白酶K，37保溫30min。 4%多聚甲醛PBS固定。 0.1mol/L PBS洗23min。 0.25%乙酸酐10min。 2SSC洗10min。 取10ul含相應探針的雜交液滴于標本上，假設是cDNA探針，那么用前將探針于95水浴中保溫10min，馬上冰浴冷卻，然后再用。10 蓋上硅化蓋玻片或蠟膜，43濕盒保溫12

17、16h。11 4SSC洗脫蓋片，并在同一液中，37漂洗10-30min。12 2SSC含20ug/mlRNaesA，適于RNA探針37洗30min。13 1SSC，0.1SSC，37各漂洗10-30min。14 0.05mol/L PBS洗45min。15 3%BSA0.4%Triton X-100 PBS配37保溫30min。16 堿性磷酸酶室溫13h。17 0.05mol/L PBS洗45min。18 緩沖液洗25min。19 緩沖液洗25min。20 NBT/BCIP液顯色，室溫，暗處3h。21 20mmol/L EDTA，pH8.0終止顯色。22 甘油明膠直接封片。2 酶促生物素標志c

18、RNA探針的運用原理：酶促生物素標志探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針DNA 中，制成標志探針，敏感度高于化學修飾法，但操作程序復雜，產(chǎn)量低，本錢高。反響步驟如下： 用PBS沖洗黏附有切片的載玻片。 將載玻片浸入0.3%H2O2，以封鎖內(nèi)源性過氧化物酶。 PBS洗23min，參與抗生物素血清和正常山羊血清，室溫1h或4過夜。 PBS洗23min。 加生物素化室溫30min孵育。 PBS洗23min。 運用ABC復合物與等量的1%牛血潔白蛋白-PBS液混合，室 溫孵育1h。 PBS洗23min。 DAB溶液孵育3-15min。 水洗，復染，脫水，透明和以甘油/P

19、BS或DPX封固。地高辛標志cRNA探針的運用地高辛標志cRNA探針的運用原理： 地高辛Dig為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物無交叉反響，地高辛標志于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷dUTP上構成Dig-11-dUTP。經(jīng)過隨即引物或缺口平移法，將Dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構成Dig-配基標志的核酸探針。 將這種標志的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的抗地高辛抗體結(jié)合物作為酶標或熒光標志，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產(chǎn)生熒光以到達檢測目的。 常用的免疫酶學檢測方法： Dig-HRP檢測系統(tǒng)：

20、 以DAB/H2O2為底物，結(jié)果為棕色； 以4-氯-1-萘酚/ H2O2為底物，結(jié)果為藍色。 Dig-AKP檢測系統(tǒng)： 以BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍紫色沉淀。 AKP靈敏度和分辨率較HRP高，但HRP的優(yōu)點為廉價、穩(wěn)定。地高辛標志的核酸探針較穩(wěn)定，-20儲存可達2年，隨時可以取用，但在現(xiàn)實運用中，人們?nèi)圆捎眯路f的地高辛標志3-6個月以內(nèi)的核酸探針。為節(jié)省核酸探針的用量，凡運用過的含有探針的雜交液也可反復多次運用。地高辛標志探針具有非放射性探針的優(yōu)點，對人體無害，不受半衰期限制，探針可長期保管。與生物素標志探針相比，地高辛探針不受組織、細胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。 由于地高辛標志cRNA探針在原位雜交細胞化學中已愈來愈得到廣泛的運用，我們在根本方法中較詳細的表達其操作過程 。地高辛探針的運用 根本操作步驟： 1組織處置 冷凍切片：切片貼在預先清潔、高溫處置并涂以粘附劑的載玻片上，先在37預枯燥4h，然后置于37烤箱中過夜。經(jīng)過上述處置的切片在-20可保管周，在-70可保管數(shù)月之久，也有報告可保