1、重組人白細(xì)胞介素-13在大腸桿菌中的表達(dá)純化及鑒定林輝煌1,2，劉春鳳2，尹鳳紅2，丁玉梅1，陳清西1* (1.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門361005； 2.廈門特寶生物工程股份有限公司，福建 廈門361028) 摘要：本文采用大腸桿菌作為宿主表達(dá)重組人白細(xì)胞介素-13（rhIL-13）融合蛋白，經(jīng)分離純化獲得高純度、高活性的rhIL-13。通過300 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試發(fā)酵表達(dá)rhIL-13融合蛋白；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，離心發(fā)酵液收集菌體，菌體經(jīng)溶解、變性、稀釋復(fù)性和親和層析捕獲，獲得融合蛋白；融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后，經(jīng)親和層析分離和分子篩精細(xì)純化等步驟后，獲得高純度rhIL-13原液。每

2、升發(fā)酵液可獲得高純度的rhIL-13原液約30 mg。通過本純化工藝獲得的rhIL-13原液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）法檢測純度大于98.75%；經(jīng)高效液相色譜分子排阻（HPLC-SEC）法檢測純度結(jié)果為100%；質(zhì)譜法分析rhIL-13分子質(zhì)量，結(jié)果為12 348 u，與理論值基本一致；采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法進(jìn)行比活性檢測，檢測結(jié)果大于8.0106 IU/mg；采用HPLC法和質(zhì)譜法對rhIL-13二硫鍵數(shù)目和位置進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示二硫鍵數(shù)目和位置與理論一致。關(guān)鍵詞：重組人白細(xì)胞介素-13；純化；鑒定中圖分類號：Q 3561 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：白細(xì)胞介素

3、-13(IL-13)是一種多功能細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等在活化狀態(tài)下分泌產(chǎn)生的，尤其是型輔助性T細(xì)胞（Th2）1。IL-13可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化，增強(qiáng)其MHC類分子的表達(dá)2；抑制LPS誘導(dǎo)的單核因子分泌，控制炎癥反應(yīng)；誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖及合成IgE類抗體，增強(qiáng)B細(xì)胞表面MHC類分子、CD23及CD72的表達(dá)3；協(xié)同IL-2刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN，從而促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞活化和TH1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。IL-13還具有抑制HIV-1在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞中IL-1RA基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成等多種功能4。重組人白細(xì)胞介素-13為一條非糖基化的單鏈多肽，含112個氨基酸殘基

4、，兩對二硫鍵，分子量約為12.3kD；氨基酸序列為：GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN。 收稿日期：2016-01-11 錄用日期：2016-03-08基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計劃（2007AA021604） *通信作者： 目前重組人IL-13（rhIL-13）基本上都是采用基因工程方法，通過對其cDNA加入特定的標(biāo)簽和引物后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，插入到質(zhì)粒中經(jīng)DNA重組后，篩選陽性克隆，轉(zhuǎn)化入感

5、受態(tài)的細(xì)胞中，進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)獲得融合蛋白，再通過對融合蛋白酶切和下游純化獲得IL-13蛋白。本文采用基因工程技術(shù)構(gòu)建的高效表達(dá)rhIL-13融合蛋白的表達(dá)菌株進(jìn)行300 L發(fā)酵融合蛋白，經(jīng)變性、復(fù)性以及親和層析、分子篩層析等分離純化后獲得高純度、高活性的rhIL-13，為rhIL-13工業(yè)化生產(chǎn)打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。1 主要材料大腸桿菌BL-21/pCold-IL -13基因工程菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；酵母提取物和蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品，丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品；Chelating Sepharose Fast Flow（CS）、Superdex 75（S-75）填料為GE公司產(chǎn)品；其它

6、試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)使用主要儀器：30 L、300 L全自動發(fā)酵罐，BBraun Biotech公司；全溫振蕩器，哈爾濱東明醫(yī)療器械廠；離心機(jī)，BECKMAN公司；P2B005A01超濾膜，Millipore公司；Basic 100蛋白純化儀，GE公司；LC1200高效液相色譜儀，Agilent公司；autoflex III TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀，Bruker Daltonics公司；DU800紫外/可見光分光光度計，美國貝克曼公司。 2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 rhIL-13 融合蛋白的發(fā)酵表達(dá)挑取rhIL-13工程菌株BL-21/pCold-IL-13，按1：400（V/V）接種至100

7、mL LB培養(yǎng)基/1 000 mL三角瓶，pH 6.0、37、200250 r/min培養(yǎng)OD600為1左右為一級種；一級種子按1：200（V/V）接種至20 L LB培養(yǎng)基/30 L種子罐，pH 6.0、37 、200250 r/min培養(yǎng)OD600為10左右為二級種。二級種按1：6（V/V）接種到含120 L LB培養(yǎng)基的D300發(fā)酵罐中，pH 7.0、37 ，溶氧（DO） 70% 培養(yǎng)、待菌液濃度達(dá)OD600約5.0，將發(fā)酵溫度降至15 ，用含40 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的氮源補(bǔ)料液1.5 L，1 h內(nèi)流加誘導(dǎo)，過程中補(bǔ)加碳源或2 mol/L NaOH以維持pH7.0

8、，誘導(dǎo)總時長約24 h。發(fā)酵完畢，離心收集菌體。2.2 融合蛋白變性與捕獲取發(fā)酵獲得菌體50 g 按1：10(W：V)的比例重懸于500 mL 100 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L 鹽酸胍、30 mmol/L -巰基乙醇（-ME），pH8.0的緩沖液中，冰水浴維持30 min；用高速冷凍離心機(jī)以10 ，10 000 rpm，20 min條件離心得上清。CS層析柱用50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L 鹽酸胍、3 mmol/L -ME，pH8.0緩沖液平衡4個柱床體積，再將離心上清液上樣，然后采用50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L鹽酸胍、3 m

9、mol/L -ME、20 mmol/L咪唑，pH8.0緩沖液和50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、3 mmol/L -ME、300 mmol/L咪唑，pH8.0緩沖液以分步洗脫方式洗脫目的蛋白，收集目的樣。2.3 融合蛋白復(fù)性捕獲的變性蛋白以1：19(V：V)的比例加入到100 mmol/L Tris-HCl、0.8 mol/L鹽酸胍、0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽（GSSG）、0.5 mmol/L 谷胱甘肽（GSH），pH8.0緩沖液中。10 左右緩慢攪拌復(fù)性48 h后，超濾至小體積，再用1磷酸鹽緩沖液（PBS），pH8.0緩沖液超濾置換掉鹽酸胍、GSH和GSSG

10、，最后收樣。2.4融合蛋白酶切與純化將腸激酶（EK）以1:120（摩爾比）的比例加入到超濾脫鹽后樣品中，混勻后10 酶切約14 hr。CS層析柱用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl，pH8.0緩沖液平衡5個柱床體積，酶切后樣品上完樣后，依次用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑，pH8.0緩沖液； 30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑，pH8.0緩沖液和30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑，pH8.

11、0緩沖液進(jìn)行洗脫，并收集各洗脫峰樣品。2.5 S-75層析柱精純S-75層析柱用1PBS，pH 7.4緩沖液平衡3個柱床體積，取上一步中由30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑，pH8.0緩沖液洗脫下來的目的樣上樣，再用1PBS，pH 7.4緩沖液洗脫收集目標(biāo)蛋白。0.22 m過濾膜過濾除菌，分裝即為原液，-65 以下凍存。2.6 rhIL-13的純度檢測高效液相色譜分子排阻（HPLC-SEC）純度檢測：色譜柱為TSK GEL 2000 SWxl 排阻柱，規(guī)格為直徑7.8 mm，柱高300 mm，粒徑 5 m，孔徑125 ，球蛋白分子質(zhì)量分離

12、范圍5150 ku；樣品稀釋到0.2 mg/mL，取50 L上樣色譜柱，以0.1 mol/L PBS(pH7.0)-0.1 mol/L NaCl溶液為流動相洗脫，流速0.7 mL/min，柱溫室溫，檢測波長280 nm。按面積歸一化法計算總的雜質(zhì)峰面積占總峰面積的百分?jǐn)?shù)得出rhIL-13的HPLC-SEC 純度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）純度檢測：取純化后的蛋白溶液，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%（250 ng）、2.5% (500 ng)、5% (1 g)、100%（20 g）的上樣量進(jìn)行SDS電泳分析。分離膠濃度16%；上樣量20 g，電壓80 100 V，考馬斯亮藍(lán)G250染色。

13、還原型方法步驟同非還原型，但使用2還原型上樣緩沖液（取1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）與2.5非還原型上樣緩沖液按1：4混合）。2.7 rhIL-13的理化性質(zhì)分析采用BRUKER公司REFLEXTM 型基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間（MALDI-TOF MS）質(zhì)譜儀，MALDI-TOF MS法測定IL-13分子質(zhì)量；基質(zhì)為-氰基-4-羥基肉桂酸；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品采用BRUKER公司之Protein Calibration Standard，分析軟件為flexAnalysis Ver.3.0.54.0。利用人紅白血病細(xì)胞系（TF-1）細(xì)胞具有對hIL-13依賴生長的特性，采用四甲基偶氮唑鹽（M

14、TT）法對rhIL-13進(jìn)行活性測定。標(biāo)準(zhǔn)品來自R&D公司，比活性為7.8105 IU/mg。采用Agilent LC1200高效液相色譜儀和Autoflex TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行二硫鍵分析，先用胰蛋白酶酶切后，HPLC收集二硫鍵連接的肽段，再用-糜蛋白酶酶切分析二硫鍵連接方式。3 純化結(jié)果分析3.1 rhIL-13融合蛋白的發(fā)酵表達(dá)在發(fā)酵過程中不同誘導(dǎo)時間的發(fā)酵液進(jìn)行取樣，掃描后取相同OD600的菌體，高溫破碎， SDS電泳檢測，試驗(yàn)結(jié)果見圖1，rhIL-13融合蛋白表觀分子質(zhì)量約為17 ku，隨著誘導(dǎo)時間的延長，發(fā)酵的目的產(chǎn)物逐漸增加，隨著時間的延長可以獲得更多的生物量的積累。30

15、0 L發(fā)酵罐最終可獲得發(fā)酵液約120 L，離心可獲得約2 kg菌體。lane18：rhIL-13誘導(dǎo)不同時間樣品；lane10：marker 。圖1 IL-13發(fā)酵過程菌體裂解液電泳圖Fig.1 Analysis of IL-13 fermentation by SDS3.2 融合蛋白變性與捕獲菌體經(jīng)溶解和融合蛋白包涵體溶解后，蛋白處于變性狀態(tài)。發(fā)酵表達(dá)的融合蛋白N末端帶有6個His氨基酸，可特異性與CS層析填料結(jié)合。純化洗脫圖譜見圖2中A，圖中I號峰為未掛柱的雜蛋白，號峰為上樣后預(yù)沖洗下來的雜質(zhì)，號峰為目標(biāo)蛋白，共250 mL，檢測蛋白濃度為1.88 mg/mL。號樣品電泳結(jié)果見圖3中l(wèi)an

16、e1。A. rhIL-13融合蛋白的CS捕獲圖譜；B. rhIL-13的CS層析純化圖譜；C. rhIL-13的S-75層析圖譜。圖2 rhIL-13的捕獲與分離純化的層析圖譜Fig.2 Chromatogram of rhIL-13 during capture and purification processlane 1：變性后融合蛋白捕獲樣；lane 2：復(fù)性后超濾樣品；lane 3：融合蛋白酶切后樣品；lane 4：酶切樣品50 mmol/L咪唑洗脫樣；lane 5：酶切樣品100 mmol/L咪唑洗脫樣；lane 6：酶切樣品300 mmol/L咪唑洗脫樣；lane 7：酶切樣品50

17、 mmol/L咪唑洗脫樣品過S75柱主峰樣品；lane 8：酶切樣品50 mmol/L咪唑洗脫樣品過S75柱主峰前樣品（-DTT）；lane 9：酶切樣品50 mmol/L咪唑洗脫樣品過S75柱主峰前樣品（+DTT）。圖3 SDS法分析純化過程各樣品Fig.3 Analyse the samples of rhIL-13 during purification process through SDS3.3 變性蛋白復(fù)性與超濾號峰經(jīng)稀釋后復(fù)性48 h后，超濾去除鹽酸胍、GSH和GSSG等，同時進(jìn)行緩沖液替換，最后超濾收樣200 mL，檢測蛋白濃度為1.1 mg/mL，樣品電泳結(jié)果見圖3中l(wèi)ane

18、2。3.4 融合蛋白的酶切與純化按超濾后樣品蛋白量的120：1（摩爾比）加入EK，10 酶切14 h。酶切后樣品電泳見圖3中l(wèi)ane3。CS純化柱純化過程如圖2中B所示，三種洗脫液洗脫下來的樣品分分別收集，I號樣品(40 mL，檢測蛋白濃度為3.1 mg/mL)用于下一步純化步驟；三個樣品分別進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果分別為圖3中l(wèi)ane4、lane5和lane6。CS層析柱分離后的I號樣用S-75 分子篩純化和緩沖液置換，收集目的樣；其洗脫見圖2中C，共收集兩個峰，圖3中，II號峰電泳為lane7，lane8和lane9分別為I號峰的電泳，其中l(wèi)ane9中樣品加了DTT 。樣品用0.22 m過濾膜過

19、濾除菌，分裝即為原液，-65 以下凍存。3.5 純化過程各樣品電泳與收率分析從圖3中l(wèi)ane 1可以看出，經(jīng)變性捕獲后，菌體相關(guān)蛋白雜質(zhì)已基本去除，融合蛋白純度較好；從lane 2可以看出超濾操作對樣品電泳純度基本上沒有影響；從lane 3可以看出，融合蛋白酶切較完全；從lane 4、5和6可以看出，酶切后產(chǎn)物被有效分離，主要目的樣在I號洗脫中，號和號洗脫樣品主要為雜質(zhì)；從lane7可以看出，樣品經(jīng)S-75純化后，純度較高，雜質(zhì)進(jìn)一步得到去除；從lane 8和9可以看出，雜質(zhì)主要是二聚體雜質(zhì)。純化過程各步蛋白收率見表1，由于菌體溶解后樣品中含大量菌體蛋白，掃描定量不準(zhǔn)，因此未定量。從表1可以看

20、出，捕獲后到原液總收率22.5%左右。表1 純化中各步收率Tab.1 The yield of each operation step during purification純化步驟目的樣體積/mL目的樣質(zhì)量濃度/(mgmL-1)收到蛋白量/mg收率/%融合蛋白捕獲2501.88470融合蛋白復(fù)性2001.122046.8酶切后CS柱純化403.112456.4S-75柱純化641.6510685.5總收率/22.54 原液檢測分析4.1 rhIL-13原液活性檢定采用TF-1/MTT比色的方法測定IL-13的效價。rhIL-13能促進(jìn)TF-1細(xì)胞的增殖，且TF-1細(xì)胞增殖數(shù)量與培養(yǎng)體系中rh

21、IL-13含量成劑量依賴性；MTT在活細(xì)胞的線粒體中可以定量的被還原為藍(lán)色的甲臜，通過比色法測定甲臜的量可以直接表示TF-1細(xì)胞的生長狀態(tài)。標(biāo)準(zhǔn)品來自R&D，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，3次測定結(jié)果RSD值小于10%。結(jié)果見表2。表2 rhIL-13比活性結(jié)果Tab.2 Specific activity of rhIL-13名稱樣品濃度平行實(shí)驗(yàn)生物學(xué)活性/(106 IUmL-1)比活性/(106 IUmg-1)標(biāo)準(zhǔn)品50 g/mL/0.0390.78IL-131.65 mg/mL116.910.2214.78.9316.810.2/平均16.19.8/RSD7.7%7.7%4.2 SDS電泳檢測結(jié)果用

22、非還原型和還原型SDS法檢測。分別上樣控制帶1.25%，2.5%，5%和10%，電泳結(jié)果（見圖4）表明：1.25%的蛋白條帶亮于目的樣品的雜質(zhì)帶，rhIL-13的雜質(zhì)含量低于1.25 %，即rhIL-13的電泳純度大于98.75%。lane1：rhIL-13 250 ng； lane2：rhIL-13 500 ng； lane3：rhIL-13 1 g；lane4：rhIL-13 20 g；lane5：MK；lane6：rhIL-13 250 ng； lane7：rhIL-13 500 ng； lane8：rhIL-13 1 g；lane9：rhIL-13 2 g；lane10：rhIL-13

23、 20 g。圖4. SDS法測定rhIL-13純度Fig.4. Determination of purity of rhIL-13 by SDS4.3 HPLC檢測結(jié)果rhIL-13的HPLC-SEC的檢測結(jié)果見圖5，從圖中可以得知，按面積歸一化法計算，檢測樣品中rhIL-13的峰面積占總面積的100 %，即rhIL-13原液的HPLC-SEC純度為100 %。圖5 HPLC-SEC法測定rhIL-13純度Fig.5 Determination of purity of rhIL-13 by HPLC-SEC4.4 rhIL-13的質(zhì)譜分子量檢測MALDI-TOF測定rhIL-13的分子質(zhì)量

24、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhIL-13的質(zhì)譜分子質(zhì)量為12348 u（見圖6），分子量大小與rhIL-13理論分子質(zhì)量（12312 u）基本一致。圖6 MALDI-TOF MS法測定rhIL-13分子質(zhì)量Fig.6 Determination of mass spectrum of rhIL-13 by MALDI-TOF MS4.5 rhIL-13的二硫鍵分析rhIL-13分子中含4個半胱氨酸，理論上其第28位的半胱氨酸和第56位的半胱氨酸形成二硫鍵，第44位的半胱氨酸和第70位的半胱氨酸形成二硫鍵。取兩份樣品（其中一份DTT處理）分別用胰蛋白酶酶切后，進(jìn)行肽圖比較分析，得知50.7 min樣品為含二硫鍵

25、肽段。將些肽段用-糜蛋白酶酶切后肽圖得36.2 min、38.8 min和43.8 min三個樣品，對這3個質(zhì)譜峰進(jìn)行二次解析，在分子質(zhì)量1 522 u（36.2 min）和分子質(zhì)量2 395 u（43.8 min）的二次圖譜中可以發(fā)現(xiàn)二硫鍵的特征譜圖。再分別取36.2 min和43.8 min的樣品上質(zhì)譜分析，同時上一份加DTT處理過的進(jìn)行對比，除了分子質(zhì)量為506 u的肽段較小，且得質(zhì)子能力較弱，未在圖譜中找到，其它3個肽段（分子質(zhì)量分別為1 019，1 077，1 320 u）均有找到，結(jié)果如表3所示。表3 rhIL-13二硫鍵結(jié)果Tab.3 Result of disulfide bo

26、nd of rhIL-13保留時間/min分子質(zhì)量/u匹配肽段+DTT后分子質(zhì)量/u+DTT后匹配肽段36.215221019(506)MLSGFC70PHK(C44AALE)38.8991SINLTAGMY43.8239510771320APLC28NGSMVWSLINVSGC56SAIEKrhIL-13原液二硫鍵的連接情況為C28-C56和C44-C70，與理論位置一致，如圖7。圖7 rhIL-13二硫鍵指示圖Fig.7 Diagram of disulfide bond of rhIL-135討 論rhIL-13目前主要通過基因工程方法進(jìn)行制備，而表達(dá)載體和表達(dá)細(xì)胞等各有不同，如王文5等

27、構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)菌株rhIL-13-p GEX-4 T-2/ TG1進(jìn)行GST-IL-13融合蛋白表達(dá)，但由于復(fù)性時大量目的蛋白的沉淀丟失及殘留鹽酸胍和原核多肽GST的影響，測得的生物活性并不高。江陽等6等構(gòu)建了畢赤酵母表達(dá)菌株pPICZA-IL-13/GS115進(jìn)行IL-13非融合蛋白表達(dá)，該重組蛋白的生物學(xué)活性達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品的要求。本文采用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大腸桿菌BL-21/pCold-IL-13表達(dá)菌株進(jìn)行rhIL-13融合蛋白的表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)在15低溫環(huán)境下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，低溫環(huán)境下蛋白質(zhì)折疊速度影響較輕微，而轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度將被充分降低，這就為蛋白質(zhì)折疊、產(chǎn)生有活性的蛋白和避免非活性蛋白

28、聚合體形成提供了充足的時間，有利于目的蛋白的產(chǎn)生。表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白攜帶組氨酸標(biāo)簽和腸激酶酶切位點(diǎn)，可通過親和層析高效獲得高純度目的蛋白，簡化了下游純化工作。本純化方法主要分為3個部分：1）采用CS親和層析作為捕獲步驟，捕獲帶有純化標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白，快速的與細(xì)胞破碎后釋放的酶、核酸、菌體蛋白、內(nèi)毒素以及色素分離，有利于融合蛋白的穩(wěn)定；2）EK酶切后蛋白首先用CS親和層析純化，利用不同蛋白質(zhì)其氨基酸序列中組氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基與固定化金屬離子結(jié)合能力不同，采用不同濃度的咪唑進(jìn)行蛋白分離，獲得高純度目標(biāo)蛋白；3）最后再用S-75分子篩進(jìn)行精細(xì)分離，去除少量多聚體雜質(zhì)，并替換緩沖

29、體系，即為rhIL-13純品。樣品活性、純度分析及鑒別，采用TF1細(xì)胞增殖法測定rhIL-13活性，比活性超過8.0106 IU/mg； SDS結(jié)果表明，rhIL-13純度超過98.75%；HPLC-SEC純度為100%。用質(zhì)譜檢測rhIL-13分子質(zhì)量為12 348 u，與理論分子質(zhì)量12 314 u基本相符；rhIL-13二硫鍵位置與理論一置，為C28-C56和C44-C70兩對二硫鍵。參考文獻(xiàn)：1 Wynn T A. IL-13 effector functionsJ. Annu Rev Immunol, 2003; 21: 425456. 2 de Waal Malefyt R, Fi

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31、ceptor and is tyrosine phosphorylated following receptor triggering J. Oncogene, 1999, 10: 1757-1761.4 Kornmann M, Kleeff J, Debinski W, et al. Pancreatic cancer cells express interkeukin-13 and -4 receptors, and their growth is inhibited by pseudomonas exotoxin coupled to interleukin-13 and -4J. An

32、ticancer Res, 1999, 19: 125-131.5王文, 田志剛, 等. hIL-13融合表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)J.中國免疫學(xué)雜志, 1998（14）: 322.6江陽, 黃偉達(dá), 時宏珍,等. rhIL-13在畢氏酵母中的表達(dá)及生物學(xué)活性研究J.蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2001; 21（2）: 117.Expression, Purification and Identify of Recombinant Human Interleukin-13 in Escherichia coliLIN Huihuang1, 2, LIU Chunfeng2, YIN Fengh

33、ong2, DING yumei1, CHEN Qingxi1*(1.School of Life Science, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2.Amoytop Biotechnique Company of Xiamen, Xiamen 361028, China)Abstract: The recombinant human interleukin-13 (rhIL-13) fusion protein was expressed in Escherichia coli, and the high purity and high activity of rhIL-13 was obtained by purification. The rhIL-13 fusion protein was conducted in the 300 L fermentation and induced by Isopropyl -D-Thiogalacto