1、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法 神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。 人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。 一 設(shè)備： 無(wú)菌操作設(shè)備。 二 大型設(shè)備CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。 倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 解剖顯微鏡，用于準(zhǔn)

2、確地取材。 常溫冰箱：-4，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。 低溫冰箱：-20-80，用于儲(chǔ)存血清酶，貴重物品和試劑。 電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。 高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術(shù)器械。 過(guò)濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過(guò)濾后才可使用，以去除細(xì)菌。 滲透壓儀，pH劑，天平等。 三 培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械 1 培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。 2 培養(yǎng)板，24-40孔，可用于開(kāi)放培養(yǎng)。 3 培養(yǎng)瓶： 4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。 5 各類培養(yǎng)液貯存器。 6 小型手術(shù)器械。 準(zhǔn)備： 一 配制培養(yǎng)液 （1） 解剖液：以無(wú)機(jī)鹽

3、（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。 （2） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。 （3） 接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細(xì)胞分散，做成細(xì)胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當(dāng)天配制。 （4） 維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 二 培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠 三消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d，達(dá)兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥

4、消毒，于培養(yǎng)前1天進(jìn)行。 神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng) （一） 選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。 （二） 取材。腦則取出相應(yīng)組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。 （三） 細(xì)胞

5、分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1106），做電生理應(yīng)為5105或更低。 （四） 抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)3-5d后，也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 （五） 觀察。接種6-12h，開(kāi)始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細(xì)胞生長(zhǎng)突起明顯，5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面，形成地毯，2周時(shí)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)最豐滿，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始退化，變形，

6、甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周最宜。 但神經(jīng)細(xì)胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì)有細(xì)胞周期，而且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量在下降，但膠質(zhì)細(xì)胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以。在培養(yǎng)過(guò)程中，早期9-12d時(shí)，有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡，這是第一次死亡階段，應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長(zhǎng)而多，且相互形成突觸。 （六） 常用培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；免疫組化分析； 但免疫組化分析應(yīng)注意，由于抗體直接作用于活細(xì)胞，不易穿透活細(xì)胞，故對(duì)核內(nèi)抗原定位時(shí)，首先考慮膜對(duì)抗體的通透性問(wèn)題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。 在免疫組化中，或其它組織學(xué)染色中，常用不同的染色方法以區(qū)分不同細(xì)胞，如半乳糖腦苷脂對(duì)小樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記明顯；GFAP對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有特異性染色等。這對(duì)研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)