1、篩選（篩選（Screening）遺傳表型（遺傳表型（phenotype）：）：是生物體遺傳組成同環(huán)境是生物體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。1 1 抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗生素抗性基因質(zhì)粒上有兩個(gè)抗生素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位點(diǎn)上有插入位點(diǎn)BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位點(diǎn)上有插入位點(diǎn)Pst I。原理：原理：外源外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端連接酶連接酶重組子重組子(ampstetr

2、) 空載體空載體(amprtetr) 插入子插入子(ampstets) 野生型的野生型的E.coli (ampstets) 導(dǎo)入導(dǎo)入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重組子轉(zhuǎn)化子重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr) 空載體空載體轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空載體空載體轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子(amprtetr)因插入外源因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)插入失活效應(yīng)。對(duì)比兩個(gè)平板上的菌落，凡在對(duì)比兩個(gè)平板上的菌落，凡在Tc平板上生長(zhǎng)而在平板上生長(zhǎng)而在Ap平板上不能生長(zhǎng)的菌落則是平板上不能生長(zhǎng)的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑

3、選陽(yáng)性克隆，分離出重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽(yáng)性克隆，分離出重組質(zhì)粒。（1）四環(huán)素抗性基因）四環(huán)素抗性基因 Tetr ：（2）氨芐青霉素抗性基因）氨芐青霉素抗性基因 Ampr ：產(chǎn)生產(chǎn)生 -內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟馇嗝雇?，使?青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。（3）環(huán)絲氨酸：）環(huán)絲氨酸：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，導(dǎo)致四

4、，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)四環(huán)素加環(huán)絲氨酸絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來(lái)；絲氨酸殺死，保留下來(lái)； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活）四環(huán)素抗性插入失活無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液選擇。指示液選擇。 -半乳糖

5、苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍(lán)氯靛藍(lán)+深藍(lán)色深藍(lán)色原理：原理：載體載體上有一段上有一段假陽(yáng)性：假陽(yáng)性： 如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍數(shù)并且沒(méi)有的倍數(shù)并且沒(méi)有中止密碼；（不破壞中止密碼；（不破壞 肽）。肽）。-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。分解成蘭色產(chǎn)物。篩選白色菌落篩選白色菌落噬菌斑是指在噬菌斑是指在宿主細(xì)菌的菌宿主細(xì)菌的菌苔上，噬菌體苔上，噬菌體使菌體裂解而使菌體裂解而形成的空斑。形成的空斑。（1 1）大腸桿菌的大腸桿菌的-D-葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶 （-D-gluc

6、uronidase，GUS）；）； （2 2）細(xì)菌和螢火蟲(chóng)的熒光素酶細(xì)菌和螢火蟲(chóng)的熒光素酶 （luciferase）；）； （3 3）水母綠色熒光蛋白（水母綠色熒光蛋白（GFP）基因）基因 （Green Fluorescent Protein）。）。報(bào)道基因（報(bào)道基因（reporter gene)（4 4）其它）其它4-甲甲-D-葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸熒光產(chǎn)物熒光產(chǎn)物GUSGFP紫外光照紫外光照發(fā)綠色熒光發(fā)綠色熒光5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸藍(lán)色水解產(chǎn)物藍(lán)色水解產(chǎn)物GUSGFP- Kac的狗GFP 老鼠GFP Alba發(fā)青綠光芒的兔子真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸

7、真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。提供甲基。二氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK選擇原理選擇原理四氫葉酸的必要性四氫葉酸的必要性DHFR利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。體菌株的突變型缺陷。一、原理：一、原理：1.彌補(bǔ)缺陷彌補(bǔ)缺陷his- -his+

8、+受體菌：受體菌：外源基因：外源基因：在不含組氨酸的在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)小鼠的二氫葉酸還原酶（小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對(duì)三甲氧）對(duì)三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體載體連接連接轉(zhuǎn)化受轉(zhuǎn)化受體菌體菌三甲氧芐二氨嘧三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板啶培養(yǎng)基平板含含DHFR的克隆才能生長(zhǎng)的克隆才能生長(zhǎng)例：例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。利用有插入片段的重組載體的分子量比利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測(cè)法一、直接電泳檢測(cè)法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中

9、分離質(zhì)粒，電泳、中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。比較其分子量。分子量分子量 Marker載體重組克隆重組克隆1. 原理：原理：根據(jù)根據(jù)已知的外源已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切圖譜圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長(zhǎng)度）。帶數(shù)和長(zhǎng)度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用或用合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。ABA或或B1. 原理原理PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。片斷。

10、2. 過(guò)程過(guò)程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）（2）用外源）用外源DNA插入片斷引物作插入片斷引物作PCR（3）電泳）電泳PCR產(chǎn)物產(chǎn)物（4）檢查是否有）檢查是否有PCR產(chǎn)物產(chǎn)物（5）PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是否與外源基因一致產(chǎn)物的長(zhǎng)度是否與外源基因一致1. 核酸雜交核酸雜交一、原理：一、原理：重組克隆與探針雜交重組克隆與探針雜交3. 識(shí)別標(biāo)記識(shí)別標(biāo)記32P 或或 125I 。（1）放射性同位素）放射性同位素2. 檢測(cè)用的探針檢測(cè)用的探針與外源與外源DNA插入片斷互補(bǔ)的序列插入片斷互補(bǔ)的序列（2）非放射性標(biāo)記）非放射性標(biāo)記熒光素、生物素?zé)晒馑?、生物素地高辛地高辛用用DN

11、A （或（或RNA）探針檢測(cè)）探針檢測(cè)DNA樣品。樣品。1. Southern blotting從宿主細(xì)胞中提取從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。與探針雜交，在底片上曝光顯示。SouthernBlottingDNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記與放射性標(biāo)記DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影帶有帶有DNA片片段的凝膠段的凝膠凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液用緩沖液轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移

12、DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜特點(diǎn)：特點(diǎn)：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落?？梢灾苯诱页鲫?yáng)性菌落。原位雜交篩選原位雜交篩選DNA重組體圖解重組體圖解復(fù)印至硝酸復(fù)印至硝酸纖維素膜上纖維素膜上用用NaOH菌體裂解菌體裂解DNA變性變性雜交雜交放射自顯影放射自顯影32P-cDNA與放射性與放射性cDNA雜雜交的菌落的斑點(diǎn)交的菌落的斑點(diǎn)細(xì)菌菌落細(xì)菌菌落單鏈單鏈DNA結(jié)結(jié)合到膜上合到膜上DNA-RNA雜交雜交1）原理：）原理：2）選擇過(guò)程）選擇過(guò)程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)雙鏈變性，復(fù)性的時(shí)候，性的時(shí)候，DNA-RNA雜交分

13、子比雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見(jiàn)一種雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見(jiàn)一種R-環(huán)環(huán)形結(jié)構(gòu)。形結(jié)構(gòu)。用外源基因的用外源基因的mRNA與重組載體雜交。與重組載體雜交。缺點(diǎn)：需要電鏡！缺點(diǎn)：需要電鏡！用用DNA（或（或RNA）探針檢測(cè)探針檢測(cè)RNA樣樣品。品。主要檢測(cè)插入片主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提從宿主細(xì)胞中提取取RNA，再用探，再用探針雜交。針雜交。Southern和和Western印跡法印跡法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradio

14、graphyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography利用抗體作為利用抗體作為“探針探針”來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的

15、外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：的性質(zhì)可分為幾種作用方式：1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。蛋白蛋白蛋白蛋白“雜交雜交” ” 待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 標(biāo)記的二標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白抗結(jié)合蛋白固相支固相支持濾膜持濾膜待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗125I標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗固相支固相支持濾膜持濾膜待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗固相支固相支持濾膜持濾膜固相支固相支持濾膜持濾膜待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一

16、抗 二抗二抗125I 標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗細(xì)菌菌落溶解，釋放出抗原蛋白質(zhì)細(xì)菌菌落溶解，釋放出抗原蛋白質(zhì)免疫化學(xué)法檢測(cè)克隆在載體免疫化學(xué)法檢測(cè)克隆在載體pUC8上的小雞原肌球蛋白基因上的小雞原肌球蛋白基因?yàn)V膜抗體溶液放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)法的操作程序聚乙烯薄膜培養(yǎng)皿及菌落放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)法的操作程序質(zhì)?；蛸|(zhì)?；駻插入基因插入基因B表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白檢測(cè)融合蛋白檢測(cè)融合蛋白既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物固相支固相支 持濾膜持濾膜抗抗A抗體抗體125I標(biāo)記的標(biāo)記的 抗

17、抗B抗體抗體質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持濾膜持濾膜抗抗A抗體抗體發(fā)光，底片曝光發(fā)光，底片曝光把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周?chē)鷷r(shí)，就會(huì)與抗體反應(yīng)形成菌落周?chē)鷷r(shí)，就會(huì)與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈沉淀圈”(白色圓圈白色圓圈)。1. 原理原理抗原抗原抗體凝集反應(yīng)。抗體凝集反應(yīng)。檢測(cè)分泌型產(chǎn)物。檢測(cè)分泌型產(chǎn)物。2. 方法方法對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。原位溶菌處

18、理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 與一抗的特異性結(jié)合。與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。從

19、而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待測(cè)基因待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗 二抗二抗無(wú)色的底物無(wú)色的底物有色的產(chǎn)物有色的產(chǎn)物比色觀察比色觀察酶酶 19（1）固定樣品）固定樣品將待測(cè)樣品加入將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底?？椎卓椎准尤胍豢?，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。一抗一抗加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗?？箾_洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶

20、（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。二抗二抗加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）?；磻?yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。在特殊的分光光度儀（在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀）上比色，打）上比色，打印出結(jié)果。印出結(jié)果。有效，但準(zhǔn)確性稍差（有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗主要取決于一抗的特異性的特異性）。）。 必須與其他方法一起綜合考慮。必須與其他方法一起綜合考慮。無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)能把外源的能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。取物。 如：如：麥胚提取物系統(tǒng)麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)