1、第三章第三章 蛋白質(zhì)研究技術(shù)蛋白質(zhì)研究技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的檢測蛋白質(zhì)的檢測第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)的分離與純化 一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則 二、蛋白質(zhì)分離純化的方法二、蛋白質(zhì)分離純化的方法蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化概圖蛋白質(zhì)分離純化概圖一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則1 1、選擇豐度高、便于提取的材料、選擇豐度高、便于提取的材料 （磷酸單脂酶（磷酸單脂酶, ,肝、胰、脾豐富，但

2、選幾乎不含磷酸二脂酶的前列腺）肝、胰、脾豐富，但選幾乎不含磷酸二脂酶的前列腺）2 2、了解目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、了解目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 （肝素材料的冷凍和干燥）（肝素材料的冷凍和干燥）3 3、探索有效的抽提和濃縮方法、探索有效的抽提和濃縮方法 ( (包括細(xì)胞破碎，抽提系統(tǒng)，濃縮：沉淀、吸附、超濾、透析、凍干等包括細(xì)胞破碎，抽提系統(tǒng)，濃縮：沉淀、吸附、超濾、透析、凍干等) )4 4、建立一套層析組合方法和檢測方法、建立一套層析組合方法和檢測方法（如吸附、離子交換、親和層析、凝膠過濾；純化評價(jià)）（如吸附、離子交換、親和層析、凝膠過濾；純化評價(jià)）5 5、包裝、包裝、方法方法二、蛋白質(zhì)分離純化的方法二、

3、蛋白質(zhì)分離純化的方法粗提：粗提： 1.1.鹽析鹽析: : 固體加入法：固體加入法： 飽和溶液加入法飽和溶液加入法: : 2. 2.有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀: : 3. 3.結(jié)晶結(jié)晶（10-50mg/ml10-50mg/ml） 4.4.等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀精提精提 ：1.1.離心（離心（centrifugationcentrifugation） 2.2.電泳（電泳（electrophoresiselectrophoresis） 3.3.層析（層析（chromatographychromatography）注：注：S1:S1:原飽和度；原飽和度；S2S2：預(yù)期飽和度；：預(yù)期飽和度；S3S3：加入液

4、飽和度。：加入液飽和度。V V：欲加入體積（：欲加入體積（mlml）；）；V V0 0：原液體積原液體積1.1.離心（離心（centrifugationcentrifugation）原理：原理：懸液中的懸液中的各種粒子（細(xì)胞，細(xì)胞器及大分子）各種粒子（細(xì)胞，細(xì)胞器及大分子）有不同有不同質(zhì)量質(zhì)量（massmass）或）或密度密度（densitydensity），故在離心場中有不同沉降速率。），故在離心場中有不同沉降速率。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子量差別很大，密度差別很小分子量差別很大，密度差別很?。ú怀^（不超過15% 15% ）。蛋白）。蛋白質(zhì)的質(zhì)的平均密度是平均密度是 1.37 g/cm1.37 g

5、/cm3 3。結(jié)合蛋白密度差異較大。結(jié)合蛋白密度差異較大。沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（sedimentation constantsedimentation constant）：）：顆粒在單位離心力場顆粒在單位離心力場中粒子移動(dòng)的速度（中粒子移動(dòng)的速度（S S）。）。離心（離心（centrifugationcentrifugation）. .差速離心（差速離心（differential centrifugationdifferential centrifugation）. .速率區(qū)帶離心（速率區(qū)帶離心（rate-zonal centrifugationrate-zonal centrifugation

6、）. .差速離心（差速離心（differential centrifugationdifferential centrifugation）利用不同物質(zhì)沉降速率的差異，通過離心速度差異分離不同質(zhì)利用不同物質(zhì)沉降速率的差異，通過離心速度差異分離不同質(zhì)量顆粒的離心技術(shù)。量顆粒的離心技術(shù)。 從組織勻漿中將可溶性的蛋白質(zhì)與不從組織勻漿中將可溶性的蛋白質(zhì)與不溶性成分分開。溶性成分分開。離心后，蛋白質(zhì)留在上清液離心后，蛋白質(zhì)留在上清液（SupernatantSupernatant）中，其他成分形成）中，其他成分形成沉淀（沉淀（PelletPellet）細(xì)胞成份的細(xì)胞成份的差速離心分離差速離心分離離心力離心力

7、時(shí)間時(shí)間. .速率區(qū)帶離心（速率區(qū)帶離心（rate-zonalrate-zonalcentrifugationcentrifugation）也稱也稱平衡密度梯度離心，根據(jù)顆粒在介質(zhì)中的沉降速度平衡密度梯度離心，根據(jù)顆粒在介質(zhì)中的沉降速度差異分離目標(biāo)顆粒的方法。差異分離目標(biāo)顆粒的方法。蔗糖、甘油或氯化銫形成密度梯度；蔗糖、甘油或氯化銫形成密度梯度；超速離心機(jī)（超速離心機(jī)（40,000 r/min40,000 r/min）離心后，離心后，分離物分布在相應(yīng)的密度區(qū)分離物分布在相應(yīng)的密度區(qū)帶內(nèi)；帶內(nèi)； 注意：注意：控制時(shí)間：太短，不能充分分離；太長，分離物沉淀到離心控制時(shí)間：太短，不能充分分離；太長，

8、分離物沉淀到離心管底部。管底部。不能精確測定分子量，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的不能精確測定分子量，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的 形狀差異影響沉降率；形狀差異影響沉降率；一次分離多種不同類型聚合物或顆粒一次分離多種不同類型聚合物或顆粒 的最有效方法的最有效方法多用于分離細(xì)胞器，多用于分離細(xì)胞器，2. 2. 電泳（電泳（electrophoresiselectrophoresis） 帶電顆粒在電場中的移動(dòng)速度的差異帶電顆粒在電場中的移動(dòng)速度的差異, ,從而將其分離。由電荷從而將其分離。由電荷質(zhì)量比決定。質(zhì)量比決定。按支持物按支持物: :移動(dòng)界面電泳移動(dòng)界面電泳, ,聚焦電泳聚焦電泳, ,區(qū)帶電泳（凝膠、線絲）等區(qū)帶電泳（凝膠、

9、線絲）等按電泳裝置按電泳裝置: :水平平板水平平板, ,垂直平板垂直平板, ,圓盤圓盤, ,雙向電泳雙向電泳, ,毛細(xì)管電泳，毛細(xì)管電泳， 脈沖電泳。脈沖電泳。SDS SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamideSDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel electrophoresis，SDS-PAGESDS-PAGE）等電聚焦（等電聚焦（isoelectric focusing isoelectric focusing ，IEF IEF ）雙向電泳（雙向電泳（two-dimensional gel electr

10、ophoresistwo-dimensional gel electrophoresis）脈沖電泳（脈沖電泳（pulsed-field gel electrophoresispulsed-field gel electrophoresis）常用的電泳方法常用的電泳方法.SDS .SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-SDS-polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide gel electrophoresis，PAGEPAGE）凝膠凝膠丙烯酰胺（丙烯酰胺（acracrylamideylamide），甲叉雙丙烯酰胺（），甲叉雙丙

11、烯酰胺（methylenemethylenebisbisacrylamideacrylamide）聚合而成；）聚合而成；T%= (a:T%= (a:單體單體g;b:g;b:雙體雙體g;g; m: m:溶液體積溶液體積) )凝膠孔徑：選擇丙烯酰胺濃度，甲叉雙丙烯酰胺膠聯(lián)劑的濃凝膠孔徑：選擇丙烯酰胺濃度，甲叉雙丙烯酰胺膠聯(lián)劑的濃度；度；C%= (a:b=19:1)C%= (a:b=19:1)凝膠有分子篩效應(yīng)。凝膠有分子篩效應(yīng)。a+b m100% b a+b100%acrbisSDS -PAGESDSSDS（sodium dodecyl sulfatesodium dodecyl sulfate）陰

12、離子洗滌劑，幾乎能破壞天然蛋白質(zhì)中所有的非共價(jià)鍵陰離子洗滌劑，幾乎能破壞天然蛋白質(zhì)中所有的非共價(jià)鍵，使，使亞基解聚亞基解聚( (巰基乙醇巰基乙醇) )，使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)構(gòu)，使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)構(gòu)形對遷移率（形對遷移率（migration ratemigration rate）的影響；）的影響； SDS SDS以以1:2 1:2 的比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)的比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負(fù)電荷帶上大量的凈負(fù)電荷，而且電荷量與蛋白質(zhì)分子量（即肽鏈長，而且電荷量與蛋白質(zhì)分子量（即肽鏈長度）成正比。所以度）成正比。所以分子量成為決定

13、蛋白質(zhì)遷移率的唯一因素。分子量成為決定蛋白質(zhì)遷移率的唯一因素。SDS -PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE 分離的蛋白分離的蛋白質(zhì)可以用質(zhì)可以用 Coomassie Coomassie blue blue 染色，也可銀染染色，也可銀染（silver stainsilver stain） SDS-PAGE SDS-PAGE 能分離能分離分子分子量差異小于量差異小于 10%10% 的蛋白的蛋白質(zhì)質(zhì)用于用于蛋白質(zhì)純化和分子蛋白質(zhì)純化和分子量近似值測定量近似值測定. .等電聚焦（等電聚焦（isoelectric focusing,IEFisoelectric focusing,IEF）在凝膠

14、上加入一種兩性電在凝膠上加入一種兩性電解質(zhì)（解質(zhì)（ampholyteampholyte），電泳），電泳時(shí)會(huì)形成連續(xù)的時(shí)會(huì)形成連續(xù)的 pH pH 梯度梯度電泳后，各種電泳后，各種蛋白質(zhì)停留蛋白質(zhì)停留在與其等電點(diǎn)（在與其等電點(diǎn)（pIpI）相同）相同的位置的位置IEF IEF 能分離能分離 pI pI 值僅相差值僅相差 0.01 0.01 的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)（即一個(gè)凈（即一個(gè)凈電單位）電單位）等電聚焦等電聚焦電泳過程中不連續(xù)電泳過程中不連續(xù)電泳的電泳的三種效應(yīng)三種效應(yīng)： 濃縮效應(yīng)，濃縮效應(yīng)， 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng). .雙向電泳（雙向電泳（two-dimensional two-dim

15、ensional gel electrophoresis gel electrophoresis） 分離分子量差異很小的蛋白質(zhì)分離分子量差異很小的蛋白質(zhì) 雙向電泳雙向電泳 = IEF + SDS-PAGE= IEF + SDS-PAGE 第一向：根據(jù)電荷差異用第一向：根據(jù)電荷差異用IEFIEF分離分離 第二向：根據(jù)分子量差異用第二向：根據(jù)分子量差異用SDS-PAGESDS-PAGE分離分離雙向電泳（雙向電泳（two-dimensional gel two-dimensional gel electrophoresiselectrophoresis）IEFSDS-PAGE雙向電泳（雙向電泳（tw

16、o-dimensional gel two-dimensional gel electrophoresiselectrophoresis）蛋白質(zhì)可用染色法（銀染、考馬斯藍(lán)蛋白質(zhì)可用染色法（銀染、考馬斯藍(lán) ）或放射自顯影進(jìn)行）或放射自顯影進(jìn)行檢測；斑點(diǎn)挖取做質(zhì)譜鑒定。檢測；斑點(diǎn)挖取做質(zhì)譜鑒定。. .脈沖電泳（脈沖電泳（pulsed-field gel pulsed-field gel electrophoresiselectrophoresis）用于分離大片段用于分離大片段 DNADNA（20 kb-10 Mb20 kb-10 Mb）在電場中，大片段在電場中，大片段 DNA DNA 以伸展的方式

17、以伸展的方式 進(jìn)行移動(dòng)進(jìn)行移動(dòng)斷斷電后，電后，DNA DNA 分子卷曲成不規(guī)則形狀。分子卷曲成不規(guī)則形狀。 DNA DNA 從伸展到卷曲所需要的時(shí)間與其長度成正比從伸展到卷曲所需要的時(shí)間與其長度成正比然后改變電泳方向然后改變電泳方向 9090或或 180180再次通電如此反復(fù)再次通電如此反復(fù)進(jìn)行，逐步把不同大小的進(jìn)行，逐步把不同大小的 DNA DNA 分開分開3.3.層析（層析（chromatographychromatography） 原理：原理：溶液中的分子能與固體表面進(jìn)行結(jié)合及解離，但溶液中的分子能與固體表面進(jìn)行結(jié)合及解離，但由于蛋白質(zhì)在分子量、帶電性和結(jié)合特異性方面的差異，由于蛋白質(zhì)在

18、分子量、帶電性和結(jié)合特異性方面的差異，導(dǎo)致與固體表面結(jié)合與解離的難易程度不一樣，所以流動(dòng)導(dǎo)致與固體表面結(jié)合與解離的難易程度不一樣，所以流動(dòng)的速度也不一樣。的速度也不一樣。 固定相的性質(zhì)決定被分離固定相的性質(zhì)決定被分離蛋白的分離效率蛋白的分離效率流動(dòng)相流動(dòng)相固定相固定相凝膠類型及型號與蛋白質(zhì)分子量凝膠類型及型號與蛋白質(zhì)分子量葡聚糖與多孔瓊葡聚糖與多孔瓊脂糖珠共價(jià)交聯(lián)脂糖珠共價(jià)交聯(lián)（吸水量是型號（吸水量是型號1/101/10）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 丙烯葡聚糖凝膠丙烯葡聚糖凝膠 層析（層析（chromatographychromatography）. .凝膠過濾層析（凝膠過濾層析（gel filtr

19、ation gel filtration chromatography chromatography ） . .離子交換層析（離子交換層析（ion-exchangeion-exchange chromatography chromatography）. .親和層析（親和層析（affinity affinity chromatography chromatography） . . 凝膠過濾層析（凝膠過濾層析（gel filtration gel filtration chromatography chromatography ） 分離分子量有差異的蛋白質(zhì)；分離分子量有差異的蛋白質(zhì)；多孔小珠由聚丙

20、烯酰胺（多孔小珠由聚丙烯酰胺（ polyacrylamidepolyacrylamide）、葡聚糖）、葡聚糖（dextrandextran）或瓊脂糖（）或瓊脂糖（agaroseagarose）組成；）組成；葡聚糖顆粒葡聚糖顆粒大分子大分子 小分子小分子凝膠過濾層析凝膠過濾層析小分子進(jìn)入顆粒凝膠內(nèi)部，而小分子進(jìn)入顆粒凝膠內(nèi)部，而大分子被排阻在外大分子被排阻在外，因此小分子，因此小分子在層析柱中流動(dòng)速度慢，從而把在層析柱中流動(dòng)速度慢，從而把混合物按不同分子量分開混合物按不同分子量分開可根據(jù)洗脫體積（可根據(jù)洗脫體積（elution elution volumevolume）估計(jì)蛋白質(zhì)分子量估計(jì)蛋白質(zhì)

21、分子量，分，分子量大子量大 洗脫體積小。洗脫體積小。 基本原理基本原理 凝膠上柱后，顆粒外的外水體積（凝膠上柱后，顆粒外的外水體積（VoVo），顆粒內(nèi)體積稱），顆粒內(nèi)體積稱內(nèi)水體積（內(nèi)水體積（ViVi），顆粒中膠的體積（），顆粒中膠的體積（VgVg），因而，總的柱），因而，總的柱床體積（床體積（VtVt），），Vt=Vo+Vi+VgVt=Vo+Vi+Vg，VgVg可忽略?？珊雎?。Vt=Vo+ViVt=Vo+Vi 。 當(dāng)進(jìn)行洗脫時(shí)，某一溶質(zhì)當(dāng)進(jìn)行洗脫時(shí)，某一溶質(zhì)的洗脫體積（的洗脫體積（VeVe）就取決于）就取決于VoVo，ViVi和在兩相中的分配系和在兩相中的分配系數(shù)（數(shù)（kdkd） Ve=Vo

22、+kdViVe=Vo+kdVi 當(dāng)當(dāng)kd=0kd=0時(shí)時(shí), ,Ve=VoVe=Vo，溶質(zhì)全從，溶質(zhì)全從VoVo 出來，無分配。出來，無分配。當(dāng)當(dāng)kd=1kd=1時(shí)時(shí), ,Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi, ,溶質(zhì)全進(jìn)溶質(zhì)全進(jìn) 篩子，各物質(zhì)盡管有分配，但篩子，各物質(zhì)盡管有分配，但 各物質(zhì)不能分開。各物質(zhì)不能分開。當(dāng)當(dāng)0kd10kdCMCCMC）時(shí)，與磷脂、膜蛋白一起）時(shí)，與磷脂、膜蛋白一起形成微團(tuán)形成微團(tuán). . 低濃度低濃度（CMCCMC）時(shí)，雖然不形成微團(tuán)，但仍能與大部）時(shí)，雖然不形成微團(tuán)，但仍能與大部 分膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合，起分膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合，起增溶作用增溶作用. .大部分大部分膜周邊蛋

23、白膜周邊蛋白（peripheral proteinperipheral protein）是）是可溶性。可溶性。它們借離子鍵或其他弱鍵與特定的膜它們借離子鍵或其他弱鍵與特定的膜蛋白結(jié)合，因此可用高濃度的鹽或能與二價(jià)陽蛋白結(jié)合，因此可用高濃度的鹽或能與二價(jià)陽離子（如離子（如 C Ca a2+2+）結(jié)合的試劑進(jìn)行分離。）結(jié)合的試劑進(jìn)行分離。開發(fā)既保持開發(fā)既保持膜蛋白的天然結(jié)構(gòu)，又高產(chǎn)和高純膜蛋白的天然結(jié)構(gòu)，又高產(chǎn)和高純度純化方法度純化方法是人們的期待。（是人們的期待。（NovagenNovagen新開發(fā)新開發(fā)TM-PEK:TM-PEK:ProteoExtractProteoExtract膜蛋白抽提試

24、劑盒膜蛋白抽提試劑盒）第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定一、分子量測定一、分子量測定二、等電點(diǎn)測定二、等電點(diǎn)測定三、末端氨基酸殘基測定三、末端氨基酸殘基測定四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈五、蛋白質(zhì)分子中的脂五、蛋白質(zhì)分子中的脂一、分子量測定一、分子量測定. .滲透壓（滲透壓（osmotic pressureosmotic pressure）. .沉降平衡（沉降平衡（sedimentation equilibriumsedimentation equilibrium）. .凝膠過濾層析（凝膠過濾層析（gel fitration gel fitration chromatogra

25、phychromatography）.SDS-PAGE.SDS-PAGE. .激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（LDI-TOF-MSLDI-TOF-MS）1.1.滲透壓（滲透壓（osmotic pressureosmotic pressure）同時(shí)測定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以同時(shí)測定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以/c/c對對c c作圖并外推到蛋白作圖并外推到蛋白質(zhì)濃度為零質(zhì)濃度為零, ,得截距得截距, ,從而求出從而求出M M。為為避免避免pHpH值的影響值的影響, ,在溶解度允許的范圍內(nèi)在溶解度允許的范圍內(nèi), ,盡量盡量采用等電點(diǎn)或采用等電點(diǎn)或接近等電點(diǎn)的緩沖液接近等電點(diǎn)的緩沖液

26、，并增加溶液中無機(jī)鹽的濃度。，并增加溶液中無機(jī)鹽的濃度?？梢詼y分子量在可以測分子量在1 11010萬范圍的蛋白質(zhì)萬范圍的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)裝置簡單，準(zhǔn)確度高。但實(shí)驗(yàn)裝置簡單，準(zhǔn)確度高。但不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一。均一。2. 2. 沉降平衡（沉降平衡（sedimentation sedimentation equilibriumequilibrium）用較低的速度離心（用較低的速度離心（8,000-20,000 r/min8,000-20,000 r/min）離心開始后，顆粒發(fā)生沉降，造成濃度梯度，同時(shí)產(chǎn)生離心開始后，顆粒發(fā)生沉降，造成濃度梯度，同時(shí)產(chǎn)生擴(kuò)散作用。擴(kuò)

27、散作用。擴(kuò)散力與離心力作用方向相反，相互平衡擴(kuò)散力與離心力作用方向相反，相互平衡公式公式：3.3.凝膠過濾層析（凝膠過濾層析（gel fitration gel fitration chromatographychromatography） 公式：公式：log log M M = = K K1 1- -K K2 2V Ve e V Ve e：洗脫體積：洗脫體積先測出先測出幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的V Ve e ，以它，以它們的們的 log log M M 對對 V Ve e 作圖作圖得一直線，得一直線，再測出待測樣品的再測出待測樣品的 V Ve e ，即可從圖，即可從圖中確定蛋白質(zhì)的分子

28、量中確定蛋白質(zhì)的分子量. .樣品可以是不純的。只要它具有專樣品可以是不純的。只要它具有專一的生物活性（或標(biāo)準(zhǔn)樣），借助一的生物活性（或標(biāo)準(zhǔn)樣），借助活性找出洗脫峰位置，確定它的洗活性找出洗脫峰位置，確定它的洗脫體積就能測定它的分子量脫體積就能測定它的分子量. .4. SDS-PAGE公式：公式：loglogM M = = K K1 1- -K K2 2 R R 以幾種以幾種標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白質(zhì)分子量的分子量的loglogM M 對其對其R R值作圖值作圖，根據(jù)待測樣品的根據(jù)待測樣品的R R ，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。SDS-PAGESDS-PAGE用以

29、分析蛋白質(zhì)的分子量用以分析蛋白質(zhì)的分子量5. 5. 激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（laserlaser desorption ionization-time of flight- desorption ionization-time of flight-massmass spectrometry ,LDI-TOF-MS spectrometry ,LDI-TOF-MS ）高純度蛋白質(zhì)與有機(jī)酸混合，在高純度蛋白質(zhì)與有機(jī)酸混合，在靶金屬表面干燥靶金屬表面干燥. .激光射線使蛋白質(zhì)離子化，激光射線使蛋白質(zhì)離子化，離子經(jīng)加速后，飛入自由漂移區(qū)，離子經(jīng)加速后，飛入自由漂移區(qū)，最后到

30、達(dá)檢測器。最后到達(dá)檢測器。飛行時(shí)間與分子量成反比，與電量成正比飛行時(shí)間與分子量成反比，與電量成正比?？蓽y定可測定1010-15 -15 -2-210105 5 的蛋白質(zhì)，誤差僅為的蛋白質(zhì)，誤差僅為 0.00010.0001。二、等電點(diǎn)測定二、等電點(diǎn)測定溶解度法溶解度法 等電聚焦（等電聚焦（IEFIEF） IEF IEF 原理原理IEF IEF 測測 pIpI三、末端氨基酸殘基測定三、末端氨基酸殘基測定 用于未知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究和基因工用于未知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究和基因工程表達(dá)產(chǎn)物的末端分析程表達(dá)產(chǎn)物的末端分析 N-terminus N-terminus 氨基酸殘基測定氨基酸殘基測定 C-ter

31、minus C-terminus 氨基酸殘基測定氨基酸殘基測定N-terminus N-terminus 氨基酸殘基測定氨基酸殘基測定化學(xué)法化學(xué)法二硝基氟苯法二硝基氟苯法（Sanger reaction） （DNFB+DNFB+肽肽DNP-DNP-肽肽 ）丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS-ClDNS-Cl）異硫氰酸苯酯法（異硫氰酸苯酯法（EdmanEdman降解法）（氨基末端（氨基末端苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物 ）酶法酶法氨肽酶法（氨肽酶法（amino peptidaseamino peptidase）氨基酸層析圖譜氨基酸層析圖譜C-terminus C-terminus 氨基酸殘基測

32、定氨基酸殘基測定 化學(xué)法化學(xué)法 肼解法肼解法（hydrazinolysishydrazinolysis） 無水肼無水肼 100 100 處理，釋放處理，釋放C C端端aaaa 酶法酶法 羧肽酶法羧肽酶法（carboxypeptidasecarboxypeptidase）選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時(shí)間選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時(shí)間, ,得單個(gè)得單個(gè)C C端端aaaa 四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈血球凝集反應(yīng)（植物凝結(jié)素）血球凝集反應(yīng)（植物凝結(jié)素）糖蛋白電泳（甲苯胺蘭、糖蛋白電泳（甲苯胺蘭、R R山蘭、山蘭、schiffschiff試劑）試劑）糖組分分析（薄層層析、液相色譜、紅外分析）糖組

33、分分析（薄層層析、液相色譜、紅外分析）五、蛋白質(zhì)分子中的脂五、蛋白質(zhì)分子中的脂蘇丹黑預(yù)染、電泳蘇丹黑預(yù)染、電泳第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的檢測蛋白質(zhì)的檢測一、一、 抗體檢測抗體檢測二、二、Western BlottingWestern Blotting三、放射性同位素標(biāo)記法三、放射性同位素標(biāo)記法 一、抗體檢測一、抗體檢測 多抗（多抗（polyclonal antibodiespolyclonal antibodies, , 通常以抗血清的形式存在）是通常以抗血清的形式存在）是指不同種類抗體的混合物，能指不同種類抗體的混合物，能識(shí)別抗原分子中的多個(gè)抗原決定識(shí)別抗原分子中的多個(gè)抗原決定簇簇（epitop

34、esepitopes）。）。單抗（單抗（monoclonal antibodiesmonoclonal antibodies）指的是同種抗體，）指的是同種抗體，識(shí)別抗原分識(shí)別抗原分子中的特定抗原決定簇。子中的特定抗原決定簇。單抗由一定數(shù)量的相同細(xì)胞產(chǎn)生單抗由一定數(shù)量的相同細(xì)胞產(chǎn)生。這。這些細(xì)胞來源于同一雜交瘤細(xì)胞（些細(xì)胞來源于同一雜交瘤細(xì)胞（hybridoma;hybridoma;脾脾: :瘤細(xì)胞融合）。瘤細(xì)胞融合）?？贵w可以檢測抗體可以檢測表面只相差一個(gè)殘基表面只相差一個(gè)殘基的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。借助借助特殊的分析試劑可對蛋白質(zhì)進(jìn)行特殊的分析試劑可對蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量或定位精確定量或定位（免疫

35、細(xì)免疫細(xì)胞化學(xué)、染色質(zhì)免疫共沉淀、胞化學(xué)、染色質(zhì)免疫共沉淀、 Western BlotWestern Blot ）。）。抗體檢測抗體檢測兩級抗體：一抗和二抗。兩級抗體：一抗和二抗。一抗一抗特異的與抗原結(jié)合，特異的與抗原結(jié)合，二二抗抗除了與一抗結(jié)合外，還帶有除了與一抗結(jié)合外，還帶有檢測標(biāo)記檢測標(biāo)記。檢測標(biāo)記：檢測標(biāo)記：如熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光、顯色基團(tuán)及如熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光、顯色基團(tuán)及酶（如酶（如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶，催化無色物質(zhì)堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶，催化無色物質(zhì)生成有色物質(zhì)）。生成有色物質(zhì)）。ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay EL

36、ISAELISAELISA 結(jié)果結(jié)果二、二、Western BlottingWestern Blotting 靈敏度高，用于檢測極微量的蛋白質(zhì)靈敏度高，用于檢測極微量的蛋白質(zhì)（Find a needle in a hastack .Find a needle in a hastack .大海撈針）大海撈針） 與與SDS-PAGESDS-PAGE、antibodyantibody、enzymeenzyme聯(lián)合使用聯(lián)合使用 Western Blotting三、放射性同位素標(biāo)記法三、放射性同位素標(biāo)記法放射性同位素的摻入放射性同位素的摻入不影響分子的性質(zhì)不影響分子的性質(zhì)。選擇合適的同位素：選擇合適的同

37、位素：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头派湫酝凰氐奶卣鞲鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头派湫酝凰氐奶卣鳎ㄈ绨胨テ凇⒎派洚a(chǎn)生的能量及能否進(jìn)入細(xì)胞等）進(jìn)行選擇。（如半衰期、放射產(chǎn)生的能量及能否進(jìn)入細(xì)胞等）進(jìn)行選擇。放射自顯影：放射自顯影：用感光材料進(jìn)行感光，用感光材料進(jìn)行感光， 如如 X X光膠片，液體乳膠。然后肉眼光膠片，液體乳膠。然后肉眼 或顯微鏡觀察，可半定量?；蝻@微鏡觀察，可半定量。定量測定：定量測定：用計(jì)數(shù)器（用計(jì)數(shù)器（countercounter），如蓋革計(jì)數(shù)器（），如蓋革計(jì)數(shù)器（Geiger Geiger countercounter）、液閃計(jì)數(shù)器（）、液閃計(jì)數(shù)器（scintillation counterscin

38、tillation counter）。）。分析分析生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的定位及運(yùn)動(dòng)生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的定位及運(yùn)動(dòng)。第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定二、已知序列肽鏈的人工合成二、已知序列肽鏈的人工合成三、蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定三、蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定一、一、 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 Edmam Edmam 降解法（降解法（PTHPTH法）法）N N末端氨基末端氨基與與苯異硫氰酸酯苯異硫氰酸酯(PITC)(PITC)在弱堿性條件下在弱堿性條件下, ,形成相應(yīng)形成相應(yīng)的的苯氨基硫甲酰衍生物苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用

39、，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)發(fā)生環(huán)化化，生成相應(yīng)的，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲苯乙內(nèi)酰硫脲(PTH)(PTH)AA,AA,而從肽鏈上降解而從肽鏈上降解, ,產(chǎn)產(chǎn)物可用氣物可用氣- -液色譜法進(jìn)行分離鑒定。液色譜法進(jìn)行分離鑒定。 HPLC HPLC 分析氨基酸分析氨基酸二、已知序列肽鏈的人工合成二、已知序列肽鏈的人工合成人工合成肽：人工合成肽：結(jié)構(gòu)分析、抗體制備、活性肽功能、新蛋白研究。結(jié)構(gòu)分析、抗體制備、活性肽功能、新蛋白研究。 抗體制備：抗體制備：在動(dòng)物體內(nèi)，在動(dòng)物體內(nèi)，10-15 10-15 個(gè)殘基的小肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗個(gè)殘基的小肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗 體。從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測及細(xì)胞內(nèi)定

40、位。體。從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測及細(xì)胞內(nèi)定位。新蛋白研究：新蛋白研究：分析末端分析末端AA,AA,反推核苷酸反推核苷酸, ,合成引物合成引物,PCR,PCR獲得基因或獲得基因或 ORF,BLASTORF,BLAST分析分析, ,同源性比對同源性比對; ;蛋白質(zhì)特征及功能分析蛋白質(zhì)特征及功能分析 。tBOC: tBOC: 叔丁氧羰基，叔丁氧羰基，保護(hù)氨基酸保護(hù)氨基酸 氨基端氨基端. .CFCF3 3COOH: COOH: 三氟乙酸，三氟乙酸，去保護(hù)去保護(hù)DCC: DCC: 二環(huán)己基碳二亞胺，二環(huán)己基碳二亞胺，縮合劑縮合劑HF:HF:氫氟酸，氫氟酸，把肽鏈從聚苯乙烯小把肽鏈從聚苯乙烯小 株上斷裂

41、下來株上斷裂下來掛接掛接去保護(hù)去保護(hù)縮合縮合去保護(hù)去保護(hù)斷裂斷裂肽鏈人工合成肽鏈人工合成三、三、 蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定1.X1.X射線結(jié)晶（射線結(jié)晶（X-Ray CrystallographyX-Ray Crystallography）2.2.冷凍電鏡術(shù)（冷凍電鏡術(shù)（Cryoelectron MicroscopyCryoelectron Microscopy）3.3.核磁共振（核磁共振（Nuclear magnetic resonance, NMRNuclear magnetic resonance, NMR）1.X1.X射線結(jié)晶學(xué)（射線結(jié)晶學(xué)（X-Ray CrystallographyX-Ray Crystallography）X X射線波長很短（射線波長很短（0.01-10nm0.01-10nm）。）。單色單色X X射線用于結(jié)構(gòu)分析射線用于結(jié)構(gòu)分析; ;2.2.冷凍電鏡術(shù)（冷凍電鏡術(shù)（Cryoelectron Microscop