1、五、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)操規(guī)目的確定重復(fù)接觸化妝品及其原料對(duì)哺乳動(dòng)物是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其程度。范圍 本操規(guī)用于動(dòng)物皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的基本方法。 本操規(guī)適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測(cè)。1 依據(jù) 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部化妝品衛(wèi)生規(guī)范第二部分第 6 章：皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn) 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T16886.10-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第 10 部分：刺激 與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)。2 設(shè)備與耗材2,4- 二硝基氯代苯， 肉桂醛， 2- 巰基苯并噻唑或?qū)Π被剿嵋阴ィ?弗氏完全佐劑、 無(wú)菌水、80比醇、丙酮、刮毛器、脫毛膏、EP管外科手套、口罩、手術(shù)服、不同規(guī)格無(wú)菌注射器、一次性無(wú)菌紗

2、布等。3 受試動(dòng)物3.1 來(lái)源：西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心3.2動(dòng)物種類：白化豚鼠 20只：300500 g , 23月齡，雌雄兼半，雌鼠無(wú)孕。3.3飼養(yǎng)條件：全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂食，自由采食，自由飲水，室溫21戈C，相對(duì)濕度4070% 。4 試驗(yàn)步驟4.1 材料制備受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度。 水溶性受試物可用水或用無(wú)刺激性表 面活性劑作為賦形劑，其它受試物可用 80%乙醇 （誘導(dǎo)接觸）或丙酮（激發(fā)接觸）作賦形 劑。4.2 試驗(yàn)方法4.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備a. 取白化豚鼠20只，隨機(jī)分成2組，對(duì)照組（10只），試驗(yàn)組（10只）、。適應(yīng)環(huán)境一周后，正式試驗(yàn)前一天，每只豚鼠背前區(qū)備皮4c

3、m>6cm。b. 無(wú)論在誘導(dǎo)階段或激發(fā)階段均應(yīng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行全面觀察包括全身反應(yīng)和局部反應(yīng)，并 作完整記錄。c. 試驗(yàn)方法可靠性的檢查：實(shí)驗(yàn)開始前選兩只備用豚鼠，使用的局部誘導(dǎo)階段方 法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)的可行性。4.2.1 試驗(yàn)過程（1 ）試驗(yàn)前約24h，將豚鼠背部 左側(cè)去毛，去毛范圍為 4cm26cmf。（2）局部誘導(dǎo)階段對(duì)去毛區(qū)域采用75%酉精消毒，覆蓋5層約8cm2的滴加適量樣品浸提液的擦鏡紙，使其貼敷在肩胛骨內(nèi)側(cè)皮膚上，再依次覆蓋3*3cm大小的塑料薄膜、 紗布，再用醫(yī)用無(wú)刺激膠帶固定使其不脫落封閉固定 6h。觀察記錄敷貼后動(dòng)物異常情況，第7d和第14d以同樣方法重復(fù)一次。（對(duì)照組

4、按照同樣方法進(jìn)行 ）（3 ）激發(fā)階段末次誘導(dǎo)后14d28d ,將約0.2mL的受試物涂于豚鼠背部 右側(cè)2cm x 2cm去毛區(qū)（接 觸前24h脫毛），然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無(wú)刺激膠布固定 6h。（對(duì)照組按照同樣方法進(jìn)行）（4 ）動(dòng)物觀察激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應(yīng)，按照表1給出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每一激發(fā)部位和每 一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述和分級(jí)，將觀察結(jié)果填寫至表2.表1變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)皮膚反應(yīng)評(píng)級(jí)皮膚反應(yīng)積分紅斑和焦痂形成無(wú)紅斑0輕微紅斑（勉強(qiáng)可見）1明顯紅斑（散在或小塊紅斑）2中度重度紅斑3嚴(yán)重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4水腫形成無(wú)水腫0輕微水腫（勉強(qiáng)可見）1中度水

5、腫（皮膚隆起輪廓清楚）2重度水腫（皮膚隆起 1mm或超過1mr）3最高積分7表2試驗(yàn)結(jié)果組別動(dòng)物號(hào)碼時(shí)間24h48h試驗(yàn)組12345678910對(duì)昭八、組111213141516171819205結(jié)果判定當(dāng)受試物組動(dòng)物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分 2時(shí)，判為該動(dòng)物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性，按表3判定受試物的致敏強(qiáng)度。按表 3判定受試物的致敏強(qiáng)度。如激發(fā)接觸所得結(jié)果仍不能確定，應(yīng)于第一次激發(fā)后一周， 給予第二次激發(fā)，對(duì)照組作同步處理表3致敏強(qiáng)度致敏率（%致敏強(qiáng)度08弱928輕2964中6580強(qiáng)81100極強(qiáng)注：當(dāng)致敏率為0時(shí)，可判斷為未見皮膚變態(tài)反應(yīng)6.豚鼠最大值試驗(yàn)6.1采用完全福氏佐劑（FCA皮內(nèi)注射方法

6、檢測(cè)致敏的可能性。6.2實(shí)驗(yàn)方法6.2.1 試驗(yàn)過程（1）動(dòng)物數(shù)試驗(yàn)組至少用10只，對(duì)照組至少5只。如果試驗(yàn)結(jié)果難以確定受試物的致敏性，應(yīng)增加動(dòng)物數(shù)，試驗(yàn)組 20只，對(duì)照組10只。（2 ）劑量水平誘導(dǎo)接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的最高濃度，激發(fā)接觸受試物濃度為不能（3）皮內(nèi)誘導(dǎo)階段按下圖所示（A B、C）,在每只動(dòng)物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)從頭向尾成對(duì)皮內(nèi)注射0.1mL,共注射6個(gè)點(diǎn)。1* 頭部j 2 -C.lm注射點(diǎn)* 3 -去毛的蠹M鶯股側(cè)都險(xiǎn) 4庵部"*圈皮商莊艸點(diǎn)部位界三個(gè)對(duì)稱點(diǎn)，每點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1mL下述溶液。試驗(yàn)組：A點(diǎn)1 : 1 （v/v）FCA冰或生理鹽水的混合物。

7、B點(diǎn)耐受濃度的受試物。C點(diǎn) 用1： 1（v/v）FCA冰或生理鹽水配制的受試物，濃度與第2點(diǎn)相同。對(duì)照組：注射部位同實(shí)驗(yàn)組。A點(diǎn)1 : 1（ v/v）FCA冰或生理鹽水的混合物。B點(diǎn)未稀釋的溶劑。C點(diǎn)用1: 1 (v/v ) FCA冰或生理鹽水配制的濃度為50% (w/v)的溶劑。(4) 局部誘導(dǎo)階段將涂有0.5g ( mL受試物的2cmX 4cm濾紙敷貼在上述再次去毛的注射部位，然后用兩 層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無(wú)刺激膠布封閉固定48h。對(duì)照組僅用溶劑作誘導(dǎo)處理。(5 )激發(fā)階段將豚鼠軀干部去毛，用涂有 0.5g ( mL受試物的2cmx 2cm濾紙片敷貼在去毛區(qū)，然后 再用兩層紗布，一層玻

8、璃紙覆蓋，無(wú)刺激膠布封閉固定24h。對(duì)照組動(dòng)物作同樣處理。如激發(fā)接觸所得結(jié)果不能確定，可在第一次激發(fā)接觸一周后進(jìn)行第二次激發(fā)接觸。對(duì)照組作同步處理。(6 )動(dòng)物觀察激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應(yīng)，按照表 1給出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每一激發(fā)部位和每一 觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述和分級(jí)，將觀察結(jié)果填寫至表 4,當(dāng)試驗(yàn)組動(dòng)物皮膚反應(yīng)積分1時(shí)，應(yīng)判為變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性。應(yīng)判為變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性，按表3對(duì)受試物進(jìn)行致敏強(qiáng)度分級(jí)。表1變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)皮膚反應(yīng)評(píng)級(jí)皮膚反應(yīng)積分紅斑和焦痂形成無(wú)紅斑0輕微紅斑(勉強(qiáng)可見)1明顯紅斑(散在或小塊紅斑)2中度重度紅斑3嚴(yán)重紅斑(紫紅色)至輕微焦痂形成4水腫形成無(wú)水腫0輕微水腫(勉強(qiáng)可見)1中度水腫(皮膚隆起輪廓清楚)2重度水腫(皮膚隆起 1mm或超過1mr)3最高積分7表3致敏強(qiáng)度致敏率（%致敏強(qiáng)度08弱928輕2964中6580強(qiáng)8