1、發(fā)酵培養(yǎng)基的要求 培養(yǎng)基能夠滿足產物最經濟的合成。 發(fā)酵后所形成的副產物盡可能的少。 培養(yǎng)基的原料應因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源 豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能保證生產上的 供應。 所選用的培養(yǎng)基應能滿足總體工藝的要求，如不應該影響 通氣、提取、純化及廢物處理等。第1頁/共57頁一。 培養(yǎng)基的類型及功能培養(yǎng)基按其組成物質的純度、狀態(tài)、用途可分為三大類型 1、按純度 合成培養(yǎng)基 : 原料其化學成分明確、穩(wěn)定 q 適合于研究菌種基本代謝和過程的物質變化規(guī)律 q 培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè) 生產 天然培養(yǎng)基: 采用天然原料 q 原料來源豐富(大多為農副產品)、價格

2、低廉、適于工業(yè) 化生產 q 原料質量等方面不加控制會影響生產穩(wěn)定性 第2頁/共57頁M培養(yǎng)基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10, pH 7.0 YPS培養(yǎng)基：酪蛋白胨（日本大五營養(yǎng)）10g，酵母提取物（英國Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2 培養(yǎng)大腸桿菌常用兩種培養(yǎng)基第3頁/共57頁2、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基 :適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產 半固體培養(yǎng)基: :即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊

3、脂，一般用量為0.5%0.8% ,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。 3、按用途（從發(fā)酵生產應用考慮） 培養(yǎng)基按其用途可分為孢子（斜面）培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種 第4頁/共57頁二、 發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源 1、碳源1)、作用提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分 提供合成目的產物所必須的碳成分2）、來源糖類、油脂、有機酸、正烷烴第5頁/共57頁3）、工業(yè)上常用的糖類 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖 但是會引起葡萄糖效應q 工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達到一定的質 量指標

4、第6頁/共57頁不同的制糖工藝生產的糖液質量差別很大第7頁/共57頁 糖蜜糖蜜是制糖生產時的結晶母液，它是制糖工業(yè)的副產物。 糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。第8頁/共57頁不用加工方法對甘蔗糖蜜的影響第9頁/共57頁糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產生不利的影響，需要進行預處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結晶）、鈣鹽（結晶） 生物素（發(fā)酵控制）預處理：澄清脫鈣脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）預處理：黃血鹽第10頁/共57頁 淀粉、糊精使用條件：微生物

5、必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、 發(fā)酵液比較稠、一般2.0%時加入一定的-淀粉酶 成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格底 難利用，可以解除葡萄糖效應第11頁/共57頁例：地衣牙孢桿菌生產-淀粉酶碳源對生長和產酶的影響碳源 細胞量 -淀粉酶葡萄糖 4.2 0 蔗糖 4.02 0糊精 3.06 38.2淀粉 3.09 40.2第12頁/共57頁李江華，無錫輕工大學學報，2004(半纖維素酶)(1.5g麩皮)第13頁/共57頁嗜堿芽胞桿菌(AC-2)中碳源對堿性纖維素酶分泌的影響結果：各種碳源相差不大推論：該菌種的堿性纖維素酶為組成型蘇勤，林業(yè)化學與工業(yè)，2004

6、第14頁/共57頁2、氮源 氮源主要用于構成菌體細胞物質（氨基酸，蛋白質、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。 1）、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 第15頁/共57頁 無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質，這種經微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質的無機氮源叫生理酸性物質，如硫酸胺，若菌體代謝后能產生堿性物質的則此種無機氮源稱為生理

7、堿性物質，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質，對穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。 所以選擇合適的無機氮源有兩層意義： q 滿足菌體生長q 穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程中的pH第16頁/共57頁毛霉產蛋白酶的研究陳濤，中國釀造，2004初始pH的影響:pH偏酸比較好，中性蛋白酶影響大第17頁/共57頁無機氮源的影響：硫酸銨硝酸銨硝酸鈉尿素第18頁/共57頁2）、有機氮源來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅 粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒 糟。成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機 鹽及生長因子。例 玉米漿： 可

8、溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸 較多的乳酸 硫、磷、微量元素等第19頁/共57頁 有機氮源成分復雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響第20頁/共57頁氮源使用的一些相關問題：q 有機氮源和無機氮源應當混合使用早期：容易利用易同化的氮源無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質q 有些產物會受氮源的誘導和阻遏例： 蛋白酶的生產q 有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力q 開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣 的課題第21頁/共57頁3、無機鹽的微量元素1）、作用：各種不一樣

9、2）、來源：C、N源，以鹽的形式補充3）、用量：根據具體的產品，以實驗決定，P1044）、使用注意點A. 對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和 微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮第22頁/共57頁例：鐵離子 青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20g/ml 發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產-淀粉酶，P對酶活的影響 pH 酶活不加 4.25 120分鐘加 K2HPO4 5.45 30分鐘加 KH2PO4 4.62 75分鐘第23頁/共57頁4、生長因子、前體和產物促進劑 從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤

10、、嘧啶、維生素等均稱生長因子。 1）、生長因子 如以糖質原料為碳源的谷氨酸生產菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子, ,生長因子對發(fā)酵的調控起到重要的作用 。 有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數有機氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子 第24頁/共57頁 前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產物物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而有較大的提高。2）、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第25頁/共57頁作用：前體有助于提高產量和組份 P107用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體

11、使用有個轉化 率的問題例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實際使用時的轉化率在46-90%之間 例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素） 轉化率為：0.6/(0.337*36/13.8)=68%第26頁/共57頁用法：前體使用時普遍采用流加的方法 前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利 苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07% 前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化， 流加也有利于提高前提的轉化率第27頁/共57頁3）、產物促進劑 所謂產物促進劑是指那些非細

12、胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加劑。 第28頁/共57頁 促進劑提高產量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。 有些促進劑本身是酶的誘導物； 有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善 細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產， 也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用； 有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。第29頁/共57頁5、水 對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。 水源質量的主要考慮參數包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。 對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對于常

13、規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第30頁/共57頁三、 發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化 目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經驗配方，再結合所用菌種和產品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。 第31頁/共57頁1、培養(yǎng)基成分選擇的原則 q 菌種的同化能力q 代謝的阻遏和誘導 q 合適的C、N比100 0.22.0q pH的要求 第32頁/共57頁（1）、理論轉化率與實際轉化率 理論轉化率是指理想狀態(tài)下根據微生物

14、的代謝途徑進行物料衡算，所得出的轉化率的大小。 實際轉化率是指實際發(fā)酵過程中轉化率的大小 如何使實際轉化率接近于理論轉化是發(fā)酵控制的一個目標 2、成分含量的確定第33頁/共57頁例: 如在酒精生產中葡萄糖轉化為酒精的理論轉化率計算如下 葡萄糖轉化為酒精的代謝總反應衡算式為 C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 葡萄糖轉化為酒精的理論得率為 2*46 Y = = 0.57 162第34頁/共57頁第35頁/共57頁（2）、實驗設計q 培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的q 合理的實驗方法多因子實驗：均勻設計、 正交實驗設計、 響應面分析等。多因子實驗第36頁/共57頁 當培養(yǎng)基成分確定

15、后，剩下的問題就是各成分最適 的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數常采 用一些合理的實驗設計方法。 3、培養(yǎng)基設計的步驟 根據前人的經驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮 的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分； 通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；第37頁/共57頁類胡蘿卜素高產菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健第38頁/共57頁原培養(yǎng)基:第39頁/共57頁 初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)第40頁/共57頁 通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好第41頁/

16、共57頁結果：碳源：乙酸鈉 0. 2%氮源：氯化銨 0.2% 酵母膏0.03%無機鹽: 復合無機鹽0.05%第42頁/共57頁 正交設計確定優(yōu)化的配方第43頁/共57頁第44頁/共57頁改進后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基第二節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結果第45頁/共57頁4、搖瓶水平到反應器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應器培養(yǎng)基研究的兩個層次q 搖瓶培養(yǎng)基設計的第一步q 反應器最終的優(yōu)化的基礎配方第46頁/共57頁例： 青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8% 輕質碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8% 補加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎培養(yǎng)

17、差別很大第47頁/共57頁搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應器研究的基礎第48頁/共57頁發(fā)酵罐：反應器水平, 可以得出最 終優(yōu)化的基 礎配方第49頁/共57頁pH控制搖床：反應器水平上的搖瓶研究第50頁/共57頁5、培養(yǎng)基設計時注意的一些相關問題 q 原料及設備的預處理 q 原材料的質量 q 發(fā)酵特性的影響 在抗生素發(fā)酵生產中往往喜歡所謂的“稀配方”，因為它既降低成本、滅菌容易、且使氧傳遞容易而有利于目的產物的生物合成。如果營養(yǎng)成分缺乏，則可通過中間補料方法予以彌補。 第51頁/共57頁q 滅菌 在大規(guī)模發(fā)酵中應該盡可能的采取連續(xù)滅菌的操作，而且保證滅菌條件的穩(wěn)定是保證發(fā)酵穩(wěn)定的前提 有時避免營養(yǎng)物質在加熱的條件下，相互作用，可以將營養(yǎng)物質分開消毒。 有些物質由于揮發(fā)和對熱非常敏感，就不能采用濕熱的滅菌方法 Na2HPO4+CaCO3CaHPO4+Na2CO3第52頁/共57頁四、重組產品培養(yǎng)基的介紹q 大腸桿菌高密度度培養(yǎng)：碳源：葡萄糖、甘油氮源：胰蛋白胨、酵母粉