1、RNA沉默機(jī)制研究進(jìn)展 RNA沉默機(jī)制的研究主要集中在遺傳和生化方面。遺傳方面，各研究小組選擇遺傳突變子的篩選策略，即篩選RNA干涉功能喪失的突變基因。目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了SGS1、SGS2、SGS3以及SDE1、SDE2、SDE3和SDE4等多個(gè)參與RNA干涉作用的基因，（Elmayan,1998;Dalmay,2000）而在鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生基因消除所必需的基因QDE1、QDE2和QDE3（Tijsterman,2002）基因序列分析發(fā)現(xiàn)，不同生物中RNA干涉相關(guān)的必需基因互為同源基因。生化方面，Hamilton 等人率先在發(fā)生PTGS的西紅柿中檢測(cè)到了與被沉默基因同源的、大小約為25nt

2、的小片段RNA分子，而未發(fā)生PTGS的西紅柿卻沒(méi)有檢測(cè)到這種小分子。（Hamilton，1999）。Zamore等在果蠅RNA干涉實(shí)驗(yàn)中觀察到，雙鏈RNA首先被降解成2123nt的小片段，然后相應(yīng)的mRNA也在與雙鏈RNA同源的區(qū)段內(nèi)，按照同樣的間隔被降解成2123nt的小片段（Zamore，2000）。 RNAi作用分子 目前對(duì)于RNA干涉中起作用的RNA小分子已有了比較透徹的研究，這些小分子目前被分為以下幾類：一種是小干涉RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）；另一種是微RNA分子（MicroRNAs，miRNAs）；這是兩種最主要的作用小分子；最近又有兩

3、類參與RNA干涉作用的小分子被發(fā)現(xiàn)，分別是微小非編碼RNA（Tiny non-coding RNAs,tncRNAs）和小調(diào)控RNA分子（Small modulatory RNA,smRNAs）(Victor Ambros,2003; Kuwabara,2004)。tncRNAs是線蟲(chóng)基因組中編碼的一類約在20-22nt的RNA分子，它們?cè)谶M(jìn)化上并不保守，功能上可能與發(fā)育調(diào)控有關(guān)，具體功能目前還未有報(bào)道(Victor Ambros,2003)。smRNAs是2004年初報(bào)道的在老鼠中發(fā)現(xiàn)的一種RNA小分子，只在成熟神經(jīng)細(xì)胞中調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞特異基因表達(dá)。（Kuwabara,2004) siRNAs

4、小分子 和miRNAs小分子是RNA干涉作用中兩種主要的小分子。兩者既有不同點(diǎn)，又有許多相似之處。siRNAs是由于Dicer酶類酶切長(zhǎng)的雙鏈RNA前體產(chǎn)生的，前體來(lái)源于病毒復(fù)制本、細(xì)胞RNA-依賴的RNA聚合酶(cellular RNA-dependent RNA polymerases,RDRPs)作用的結(jié)果或者是基因組內(nèi)反向重復(fù)片段轉(zhuǎn)錄的結(jié)果,5端帶磷酸基團(tuán)、3端帶羥基、大小約為21-25nt的RNA分子；miRNAs分子在存在形式上基本與siRNAs分子相同，大小約為19-25nt的RNA分子；但其與siRNAs的關(guān)鍵不同點(diǎn)在于它的來(lái)源，它是Dicer酶類加工RNA聚合酶II從內(nèi)源非編

5、碼蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的高度結(jié)構(gòu)化的RNA前體分子而成。但兩者均依賴于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complexes,RISC）中的Argonaute蛋白的活性進(jìn)行（He，2004）。兩者的區(qū)別： 1）siRNAs以雙鏈形式存在，而成熟的miRNAs是以單鏈形式存在的； 2）miRNAs參與正常情況下的生長(zhǎng)發(fā)育基因調(diào)控，在大多數(shù)的多細(xì)胞生物基因組中都有編碼，它們沉默蛋白合成階段的基因，而siRNAs不參與生物體的正常生長(zhǎng)，只有在病毒或其它雙鏈RNA誘導(dǎo)的情況下才產(chǎn)生，它們通過(guò)與互補(bǔ)序列的精確配對(duì)而促進(jìn)mRNA的切割或招募抑制蛋白、或直接指導(dǎo)DNA的修飾而起作

6、用； 3）Dicer酶對(duì)兩類RNA分子的加工過(guò)程不同；多細(xì)胞動(dòng)物的miRNAs分子是通過(guò)Drosha 和Dicer RNase III在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)分兩步分別發(fā)生的；而siRNAs則是僅由Dicer酶類作用，而且是在細(xì)胞質(zhì)中加工完成的。 4）miRNAs在多細(xì)胞動(dòng)物界或在有關(guān)的植物品種中是保守的，而siRNAs序列是完全多樣的，在作用方式上，miRNAs并不需要與它們的靶目標(biāo)完全匹配，而siRNAs則需要與它們的靶目標(biāo)完美匹配。（Dmitry ,2004；Michael,2005） 所有的證據(jù)均支持兩種小分子是以雙鏈生成的，但在功能復(fù)合體中以單鏈形式集累，最有說(shuō)服力的證據(jù)表明miRNAs分子

7、最初含有兩條鏈的證據(jù)是miRNAs的生物合成在植物及多細(xì)胞動(dòng)物中均可被病毒蛋白p19所阻斷，而p19蛋白結(jié)合雙鏈的RNA小分子結(jié)構(gòu)但并不結(jié)合單鏈的RNA小分子（Ye，2003；Lakatos，2004），那么p19蛋白抑制miRNAs功能的最簡(jiǎn)單解釋就是miRNAs分子最初是以雙鏈形式短暫存在的。 RNAi效應(yīng)復(fù)合體的組裝 RISC組裝的關(guān)鍵步驟是將siRNAs和miRNAs小分子兩條鏈中的一條選擇進(jìn)入該復(fù)合體，目前RISC復(fù)合體的體外研究只在Drosohaila得到研究。（Lee，2004） 果蠅中，siRNAs和miRNAs小分子是由不同的Dicer酶類進(jìn)行加工的，Dcr-1酶產(chǎn)生miRN

8、As小分子而 Dcr-2酶產(chǎn)生siRNAs小分子，Dcr-2酶還指導(dǎo)siRNAs小分子的一條鏈進(jìn)入RISC復(fù)合體。人類中的Dicer酶也可能有指導(dǎo)siRNAs小分子進(jìn)入RISC復(fù)合體的功能，因?yàn)镈icer酶缺失的人類細(xì)胞中siRNAs小分子并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNA沉默。（Doi，2003）不同的是，siRNAs小分子可以在Dicer酶敲除的ES 細(xì)胞中行使降低靶基因表達(dá)的功能。（Kanellopoulou,2005）      目前提出兩條類似的Drosohaila RISC組裝步驟（Pham,2004;Tomari,2004），而Tomari,2005將兩

9、條類似途徑整合，如圖1-1。 Tomari,2004a提出，RISC的組裝開(kāi)始于雙鏈siRNAs小分子整合到未確定的蛋白形成復(fù)合體B，在體外，復(fù)合體B是RISC裝載復(fù)合體（RISC-loading complex,RLC;formerly “complex A”）的動(dòng)力學(xué)前體，盡管復(fù)合體B作為RISC組裝的早期中間體的途徑還不是很完整，但RLC在將siRNAs小分子裝載到RISC中的關(guān)鍵作用已得到有力支持 (Tomari,2004b) 。 RLC含有Dcr-2蛋白和它的合作者R2D2蛋白,而后者具有前后相近的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而這兩個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)于體內(nèi)的RNA沉默中的RLC的形成及siRNAs

10、小分子解鏈都是必需的。（Liu，2003）RLC既含有雙鏈的siRNAs小分子，也含有小量的單鏈siRNAs小分子，這說(shuō)明雙鏈siRNAs小分子的解鏈?zhǔn)加谶@個(gè)復(fù)合體。RLC中的siRNAs小分子通過(guò)Dcr-2蛋白和RICS前體（holo-RISC）的Ago蛋白的相互作用而將RICS前體征募過(guò)來(lái)形成RISC復(fù)合體。Pham,2004提出的途徑與此類似。 RISC功能   小RNA分子進(jìn)入RISC復(fù)合體后，小RNA分子至少有三種不同的沉默方式。在RNAi途徑中，小RNA分子介導(dǎo)RISC切割靶RNA，RISC的切割需要Mg2+存在，但此反應(yīng)可被硫代磷酸酯在易斷裂的磷酸基團(tuán)處抑制，

11、切割產(chǎn)物具有5端磷酸基團(tuán)、3端羥基。該反應(yīng)被認(rèn)為是通過(guò)Argonaute蛋白的亞家族的Piwi結(jié)構(gòu)域催化的，該結(jié)構(gòu)域是Mg2+依賴的RNase H的結(jié)構(gòu)同系物，而RNase H切割RNA-DNA雜合體中的RNA鏈（Song，2003；2004）。不同于RNase H，每一個(gè)具有切割能力的RISC只在其靶RNA目標(biāo)的唯一磷酸二酯鍵處進(jìn)行斷裂（即易斷裂的磷酸基團(tuán)處）（Elbashir，2001）。RISC是一種多轉(zhuǎn)換酶類（multiple turnover enzyme），Argonaute蛋白質(zhì)是RISC中的核心組分。小RNA分子將RISC引導(dǎo)到靶RNA分子，靶目標(biāo)被切割后，小RNA分子完封不動(dòng)

12、地離開(kāi)RISC（Martinez and Tuschl,2004）。       目前研究表明將RISC綁定到靶RNA分子上的能量來(lái)源于小RNA分子5'端（Haley,2004; Doench,2004），這是siRNAs小分子和miRNAs小分子與反義寡核苷酸的本質(zhì)不同之處，后者所有的堿基對(duì)特異性具有相等的貢獻(xiàn)。倘若多個(gè)小RNA分子結(jié)合到靶目標(biāo)上，siRNAs小分子和miRNAs小分子的3'端與靶RNA分子的完全配對(duì)對(duì)于翻譯抑制及靶mRNA破壞并不是必需的，從技術(shù)角度說(shuō)，絕大多數(shù)小RNA分子不但下調(diào)它們的目標(biāo)靶mRN

13、A分子，而且減少其它與小RNA分子有部分互補(bǔ)序列的mRNA分子的表達(dá)。(Jackson,2003)     在翻譯抑抑制途徑，小RNA分子介導(dǎo)RISC結(jié)合到mRNA分子并抑制其翻譯成蛋白質(zhì)而不是切割mRNA分子。多細(xì)胞動(dòng)物中的miRNAs小分子主要是，當(dāng)然并不總是，介導(dǎo)翻譯抑制而不是切割它們。相對(duì)而言，大多數(shù)植物miRNAs小分子直接指導(dǎo)靶mRNA分子的切割。在很多詳細(xì)研究的多細(xì)胞動(dòng)物翻譯抑制例子中，翻譯抑制是靶mRNA分子的3'端非翻譯區(qū)位點(diǎn)對(duì)小RNA分子指導(dǎo)的RISC結(jié)合的反應(yīng)。實(shí)際上，mRNA分子3'端非翻譯區(qū)的多個(gè)候選結(jié)合位點(diǎn)可以

14、作為預(yù)測(cè)mRNA分子是否受小RNA分子調(diào)控的指示標(biāo)記。（Lewis，2003）     小RNA分子還可以指導(dǎo)抑制性異染色質(zhì)的形成。到目前為止，對(duì)這條途徑相關(guān)的唯一復(fù)合體的描述是關(guān)于Schizosaccharomyces pombe 的RITS（ a RISC like complex that contains siRNA），關(guān)于RITS如何指導(dǎo)組蛋白的修飾從而促進(jìn)抑制性異染色質(zhì)的形成的機(jī)制還不清楚。小RNA分子通過(guò)DNA甲基化而抑制翻譯目前在多細(xì)胞動(dòng)物中也有報(bào)道。（Kawasaki，2004）植物中至少有三種RNA沉默途徑（ David Baulco

15、mbe,2004），在這些途徑中，沉默信號(hào)可以在細(xì)胞間擴(kuò)增及傳導(dǎo)，甚至可以通過(guò)反饋機(jī)制自我調(diào)控。這些途徑的不同生物學(xué)作用已經(jīng)建立，包括防御病毒、調(diào)控基因表達(dá)以及與染色質(zhì)異縮為異染色質(zhì)有關(guān)。三種途徑均包括通過(guò)具有RNase III結(jié)構(gòu)域的Dicer酶將雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）剪切成21-26 nt RNA分子。這些小RNA分子被稱為小干涉RNA(short interfering RNAs,siRNA)或微RNA分子(microRNAs,miRNAs)。 三種途徑之一是細(xì)胞質(zhì)siRNA沉默（Hamilton,1999）。這條途徑可能在病毒感染植物細(xì)胞中起

16、重要作用，其中dsRNA可能作為復(fù)制媒介（replication intermediate）或具有單鏈病毒RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在植物DNA病毒中，dsRNA可能通過(guò)重疊互補(bǔ)轉(zhuǎn)錄本的退火而形成。 第二個(gè)途徑是通過(guò)miRNAs沉默內(nèi)源mRNA。這些miRNAs分子通過(guò)與特異mRNA的堿基配對(duì)而負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，導(dǎo)致RNA剪切或蛋白翻譯的停滯。miRNAs可能來(lái)源于具有部分雙鏈區(qū)域的反向重復(fù)前體RNA分子，它們通過(guò)與互補(bǔ)的單鏈mRNA相互作用而起作用。 植物中RNA沉默的第三條途徑是通過(guò)DNA甲基化抑制轉(zhuǎn)錄而起作用。這條途徑的最初證據(jù)是在植物中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因及病毒RNA指導(dǎo)特異的核苷酸DNA甲基化（Me

17、tte，2000；Jones，2001）。最近研究發(fā)現(xiàn)植物中siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化與組蛋白修飾有關(guān)。（Zilberman，2003） Rrgonaute(Ago)蛋白質(zhì)參與RNA沉默的所有三種途徑。擬南芥中，AGO1突變體對(duì)細(xì)胞質(zhì)siRNA沉默和miRNAs沉默這兩個(gè)途徑是缺失的，而AGO4突變體則對(duì)染色質(zhì)沉默途徑有所傷害。（Zilberman，2003）AGO蛋白的中心作用可能作為沉默效應(yīng)復(fù)合體(silencing effector complexes)的成員而發(fā)揮作用，而后者結(jié)合siRNA和 miRNAs分子。 Dicer 基因家族在擬南芥中只有四處成員（Schauer，2002），

18、其中的兩個(gè)成員的功能已得到較好的確定。DCL1(Dicer-like 1)與miRNAs的生物合成有關(guān)。（Papp，2003；Finnegan，2003；Xie，2004）DCL3產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)座子，與染色質(zhì)沉默有關(guān)。（Xie，2004）DCL3的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于與一類轉(zhuǎn)座子相關(guān)的siRNA，而且產(chǎn)物相對(duì)于典型的DCL1產(chǎn)物而言較長(zhǎng)（24個(gè)核苷酸而不是通常的21個(gè)核苷酸）（Hamilton，2002；Tang，2002）家族中的另外兩個(gè)成員的功能目前還沒(méi)有得到很好的鑒定。 在C.elegans,fungi和植物中，RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase

19、s ,RDRs or RDRP）在細(xì)胞質(zhì)及染色質(zhì)沉默途徑中發(fā)揮作用（Sijen，2001；Smardon，2000；Cogoni，1999；Dalmay，2000）。擬南芥中沉默轉(zhuǎn)基因和病毒的細(xì)胞質(zhì)RNA沉默途徑要求RDR1和RDR6兩個(gè)直向同源基因，然而這兩個(gè)蛋白對(duì)不同的病毒RNA有特異性，RDR6突變體對(duì)黃瓜花葉病毒超敏感而對(duì)煙草花葉病毒并不敏感（Dalmay，2001），而降低RDR1表達(dá)水平的煙草植株表現(xiàn)出對(duì)煙草花葉病毒敏感。（Xie，2001） 植物和多細(xì)胞動(dòng)物的miRNA途徑基本上是一致的；都是由Dicer產(chǎn)生的20-22 nt單鏈miRNAs分子作用，兩者都依賴于Ago蛋白的作用

20、。然而多細(xì)胞動(dòng)物的miRNAs分子是通過(guò)Drosha 和Dicer RNase III在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)分兩步分別發(fā)生的。（Bartel，2004）而植物中的miRNAs分子只是由Dicer酶加工的，并且可能該步驟只是在細(xì)胞核中發(fā)生。（Papp，2003）與這兩種加工形式不同相對(duì)應(yīng)的是，一種dsRNA結(jié)合蛋白，HYL1，只對(duì)植物miRNA途徑特異。（Han，2004；Vazquez，2004）兩者更主要的不同點(diǎn)在于：植物的miRNA分子與它們的靶RNA分子完美配對(duì)并且用RNA剪切而不是翻譯抑制（translation suppression）作為主要的沉默機(jī)制。(Rhoades,2002; Jo

21、nes-Rhoades,2004; Llave,2002) 動(dòng)物的miRNA分子通常是靶向到mRNA分子的3非翻譯區(qū)（untranslated regin ,UTR）,而植物miRNA分子則是靶向到編碼區(qū)甚至在5非翻譯區(qū)。（Sunkar，2005）轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS， post- transcriptional gene silencing）-最初被認(rèn)為僅限于矮牽牛花和其它一些植物中的奇異現(xiàn)象，是目前分子生物學(xué)研究中一個(gè)最熱門(mén)的話題。過(guò)去幾年中，科研工作者已明確轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象普遍存在于動(dòng)、植物中，在機(jī)體防御病毒入侵和轉(zhuǎn)座子沉默效應(yīng)中起著重要作用。但是最激動(dòng)人心的是轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象的

22、技術(shù)應(yīng)用，即在多種有機(jī)體中應(yīng)用核糖核酸干擾（RNA interfere ,RNAi）技術(shù)進(jìn)行特異性的基因剔除以研究相應(yīng)的基因功能。那么核糖核酸干擾現(xiàn)象是如何被發(fā)現(xiàn)？它是怎樣工作的？科研工作者怎樣把它應(yīng)用到功能基因組學(xué)的研究中呢？ 10多年前，Rich Jorgensan和他的同事在矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)一種奇怪的現(xiàn)象。他們嘗試把由一強(qiáng)有力啟動(dòng)子控制的基因pigment-produing導(dǎo)入矮牽?；ㄒ约由罨ǖ淖仙Y(jié)果不但顏色未加深，許多花呈現(xiàn)雜色甚至白色。Rich Jorgensan把這種現(xiàn)象稱為"共抑制"，因?yàn)橥庠葱詫?dǎo)入基因和內(nèi)源性具有相似功能基因的表達(dá)都被抑制了。當(dāng)時(shí)人們不知道

23、這是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默。雙鏈核糖核酸能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默首先來(lái)自于對(duì)線蟲(chóng)的研究。1995年Guo和Kewphues試圖用反義核糖核酸來(lái)阻斷Par-1基因的表達(dá)以研究其功能。確實(shí)反義核糖核酸抑制了基因表達(dá)，出乎意料的是用作陰性對(duì)照的正義核糖核酸也抑制了基因表達(dá)。該結(jié)果一直讓人迷惑不解，直至三年后Fire和Mello進(jìn)行了另一實(shí)驗(yàn)才真正提出雙鏈核糖核酸能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的理論。Fire和Mello發(fā)現(xiàn)把反義核糖核酸和正義核糖核酸的混合物導(dǎo)入線蟲(chóng)后，其抑制效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于單獨(dú)導(dǎo)入反義核糖核酸或正義核糖核酸的抑制效應(yīng)。再后來(lái)Baulcomb和Hamilton首先發(fā)現(xiàn)是25nt的核糖核酸能特異性抑制具有相

24、應(yīng)互補(bǔ)序列的基因表達(dá)。那么核糖核酸干擾（RNAi）是怎樣工作的呢？首先外源導(dǎo)入的雙鏈核糖核酸(dsRNA)被切割為2123nt的小分子干擾核糖核酸(siRNA)。Dicer, 作為特異性核糖核酸酶家族的一個(gè)成員，切割雙鏈核糖核酸為1923nt小分子干擾核糖核酸（siRNA），這是一個(gè)依賴ATP的耗能過(guò)程. 切割后的 siRNA具有3'兩個(gè)核苷酸TT突出末端。然后siRNA結(jié)合到核糖核酸酶復(fù)合物上形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RISC，RNA-induced silencing complex）。該復(fù)合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC?；罨腞ISC通過(guò)由siR

25、NA決定的堿基互補(bǔ)配對(duì)原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，最終導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)。目前具體的切割機(jī)制還不明了，研究表明每個(gè)RISC包括單鏈siRNA和核糖核酸酶RNase。.由于RNAi強(qiáng)大的基因沉默效應(yīng)，有人提出了RNAi通路的效應(yīng)擴(kuò)增問(wèn)題。RNAi通路的效應(yīng)擴(kuò)增可能是通過(guò)細(xì)胞復(fù)制外源導(dǎo)入的dsRNA或siRNA本身而實(shí)現(xiàn)的。另外，RISC的多次反復(fù)使用也能擴(kuò)增RNAi的基因沉默效應(yīng)。 科研工作者已開(kāi)始RNAi效應(yīng)增強(qiáng)子和效應(yīng)抑制子的研究，認(rèn)為RNAi是機(jī)體細(xì)胞一種強(qiáng)有力的基因調(diào)控機(jī)制。但是在哺乳細(xì)胞中外源導(dǎo)入大分子dsRNA（>30nt）常常導(dǎo)致非特異性的基因沉默效應(yīng)，因?yàn)樗せ盍撕颂呛?/p>

26、酸酶RNaseL而導(dǎo)致非特異性的RNA降解。相反，siRNA（<30nt）不激活RNaseL，而是通過(guò)序列特異性的方式誘導(dǎo)基因沉默效應(yīng)。該序列特異性方式非常嚴(yán)格，一個(gè)堿基的錯(cuò)配會(huì)顯著降低基因沉默效應(yīng)。所以siRNA可以解釋如下，它是一種具有3'兩個(gè)核苷酸TT突出末端的2123nt大小的雙鏈核糖核酸，作為RNAi的中介分子，通過(guò)序列互補(bǔ)配對(duì)法則特異性降解目的基因。siRNA可以經(jīng)化學(xué)合成，比如著名生物學(xué)公司Proligo、Orbigen在siRNA合成方面處于世界領(lǐng)先水平，它們既提供即用型siRNA，也提供標(biāo)記生物素、熒光素和磷酸等的siRNA更方便監(jiān)測(cè)其抑制特異基因表達(dá)的效果si

27、RNA也可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲取。它相對(duì)便宜，尤其適合于同時(shí)合成多個(gè)siRNA。雖然理論上說(shuō)，任何一個(gè)具有3'兩個(gè)核苷酸TT突出末端的1923nt小分子干擾核糖核酸 siRNA都具備序列特異性的基因沉默效應(yīng)，但是由于位置效應(yīng)，比如某些序列，尤其是調(diào)控序列易被蛋白質(zhì)附著而阻止RISC的抑制效應(yīng)，所以科研工作者首先合成24個(gè)siRNA進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以選定作用最佳者。RNA專家Ambion公司提供通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲取siRNA的商品化試劑盒，使這一選擇過(guò)程簡(jiǎn)單方便。 目前外源注射和轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA到細(xì)胞或機(jī)體的主要途經(jīng)，之后基因沉默效應(yīng)可以持續(xù)數(shù)天，同時(shí)傳至下一代細(xì)胞，但終將短時(shí)間內(nèi)消失，因此，最近

28、許多科研小組開(kāi)發(fā)了siRNA的表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以達(dá)到在細(xì)胞內(nèi)不斷表達(dá)siRNA的目的。有些質(zhì)粒是表達(dá)小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNAs（shRNAs, small hairpin RNAs）, 在細(xì)胞內(nèi)它被加工處理為siRNA樣分子，誘導(dǎo)基因沉默。該質(zhì)粒是在polyMerase啟動(dòng)子和45個(gè)堿基T轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)中插入shRAN。由于polyMerase的特性，轉(zhuǎn)錄常常在第二個(gè)T終止，插入序列折疊成step-loop結(jié)構(gòu)并帶有3'-UU突出末端。該質(zhì)粒設(shè)計(jì)是基于線蟲(chóng)、果蠅等中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因?yàn)槠渲械幕虺聊?yīng)就是通過(guò)step-loop而誘導(dǎo)。另外一種siRNA表達(dá)質(zhì)粒是把編碼正義和反義的s

29、iRNA分別受控于各自的polyMerase啟動(dòng)子。兩種質(zhì)粒的基因沉默效應(yīng)相當(dāng)。Invivogen公司和Imgenex公司都有操作簡(jiǎn)單、作用有效的商品化試劑盒提供。而Gene Therapy System 公司的siRNA構(gòu)建試劑盒則完全采用了不同的機(jī)制。該試劑盒首先PCR合成目標(biāo)序列，然后由T7RNA多聚酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，經(jīng)退火和純化處理的體外轉(zhuǎn)錄dsRNA模板被重組的Dicer酶切割，從而快速、高效地產(chǎn)生大量小分子干擾RNA（siRNAs）。產(chǎn)生的siRNAs混合物，比單一形式的siRNA更可能導(dǎo)致基因表達(dá)沉默?；谀壳暗陌l(fā)表文獻(xiàn)和一些實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，siRNA的設(shè)計(jì)可遵循以下幾點(diǎn)進(jìn)行1）選擇以堿

30、基A或G開(kāi)始的1921nt大小的目的mRNA。因?yàn)镽NA polyMerase啟動(dòng)子只有在第一個(gè)轉(zhuǎn)錄堿基是嘌呤時(shí)才能有效作用。2）針對(duì)目的mRNA一般選擇24個(gè)不同序列，GC含量為3050%，避免四個(gè)堿基T或A的連續(xù)序列，避免選擇起始MM下游50100nt、終止MM上游100nt以及5'和3'的非編碼區(qū)域，BLAST檢查設(shè)計(jì)序列的特異性。3）設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照，比如設(shè)計(jì)有12個(gè)堿基錯(cuò)配的序列，或者是隨機(jī)變更siRNA的堿基排列順序。RNAi的研究刮起了科學(xué)界的風(fēng)暴，siRNA迅速有效抑制特異基因功能的性質(zhì)促使科研工作者不斷深入完善該領(lǐng)域的研究。RNAi可能是未來(lái)發(fā)展基因治療策略

31、的新希望所在。RNAi技術(shù)必將帶來(lái)功能基因組學(xué)的革命在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行RNA干擾:設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)和分析siRNA效應(yīng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，也稱為RNA干擾，是指雙鏈RNA分子阻斷或者降低同源基因的表達(dá)的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象可能是作為一種抑制病毒感染和轉(zhuǎn)座子跳躍的細(xì)胞防御機(jī)制(Ketting et. al., 1999; Tabara et. al., 1999; Jensenet. al., 1999; Ratcliff et. al., 1999)。在體內(nèi)，雙鏈RNA被內(nèi)源的核糖核酸酶降解為21-23個(gè)堿基大小的小分子干擾RNA（small interfering RNAs ，siRNAs)。這種2123

32、堿基大小的雙鏈RNA被認(rèn)為是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)RNAi反應(yīng)的效應(yīng)物。     RNAi技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于線蟲(chóng)和果蠅中基因功能的鑒定。通常將體外轉(zhuǎn)錄得到的長(zhǎng)雙鏈RNA引入這類生物中來(lái)誘導(dǎo)RNAi，但是這種方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中行不通，因?yàn)殚L(zhǎng)片斷的雙鏈RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘發(fā)強(qiáng)烈的抗病毒反應(yīng)，導(dǎo)致整體基因表達(dá)模式的改變，而非特異的基因沉默反應(yīng)。最新的實(shí)驗(yàn)表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入小分子雙鏈RNA則不會(huì)引發(fā)類似的抗病毒反應(yīng)，而能夠有效的找到特異的目標(biāo)靶RNA而介導(dǎo)基因沉默。實(shí)驗(yàn)范例實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：    選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的3

33、個(gè)基因：GAPDH, c-myc, 和一個(gè)RNA結(jié)合蛋白基因La作為研究的目標(biāo)靶。相應(yīng)的mRNAs序列進(jìn)行分析來(lái)確定siRNA設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行siRNA制備，選擇合適方法檢測(cè)基因抑制的效果。根據(jù)基因的不同區(qū)域，每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)4組不同的siRNAs。分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并檢測(cè)目標(biāo)靶基因表達(dá)抑制的程度。siRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制的程度分別通過(guò)mRNA和蛋白表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)。    超過(guò)一半以上的siRNAs對(duì)目的基因的抑制程度超過(guò)50%。siRNAs在目標(biāo)靶mRNA上不同位置并沒(méi)有顯著影響siRNA的活性，最有效的 GAPDH siRNA被用于在不同哺乳動(dòng)物

34、細(xì)胞類型中評(píng)估siRNA的活力。轉(zhuǎn)錄方法制備的siRNA被證實(shí)是一種性價(jià)比高的方法，通過(guò)酶的方法制備的siRNAs至少比化學(xué)合成的siRNAs有效10倍。siRNAs的設(shè)計(jì)：siRNAs的設(shè)計(jì)根據(jù) Elbashir et. al. (2001)描述的方法，帶3突出的兩個(gè)U。候選的siRNAs序列分別位于mRNA靶的3 5以及中部，從而驗(yàn)證不同的區(qū)域是否對(duì)siRNA介導(dǎo)的降解更為敏感。候選序列在人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast以避免和其他基因的同源性，最后每個(gè)目標(biāo)靶基因選出對(duì)應(yīng)4個(gè)siRNAs。 siRNA合成：分別用化學(xué)合成的方法和試劑盒(酶法)制備siRNAs并用常規(guī)方法定量。 轉(zhuǎn)染：哺乳動(dòng)物細(xì)

35、胞（Hela）在不含抗生素的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至 40-70%匯片，分別將每個(gè)siRNAs（分別以不同的濃度），轉(zhuǎn)染試劑和Opti-MEM (Invitrogen)混合，室溫下孵育1520分鐘，加入siRNAs轉(zhuǎn)染混合物并適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的體積。溫育48小時(shí)后后收獲細(xì)胞，分別進(jìn)行RNA水平分析和蛋白表達(dá)分析。 RNA純化和分析：常規(guī)試劑盒抽提總RNA，以分光光度劑定量。目標(biāo)靶mRNA的表達(dá)水平通過(guò)Northern或者是定量RT-PCR（ ABI7700）雙標(biāo)探針檢測(cè)。蛋白表達(dá)分析：目標(biāo)靶基因和無(wú)關(guān)對(duì)照的蛋白表達(dá)水平通過(guò)Western方法檢測(cè)?；蛘哂妹庖邿晒夥z測(cè)。對(duì)照：對(duì)于全部樣品，在分析目標(biāo)靶m

36、RNAs和蛋白表達(dá)水平的同時(shí)，至少有一個(gè)不相關(guān)基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平同時(shí)進(jìn)行分析作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表一：siRNAs誘導(dǎo)的目標(biāo)mRNA和蛋白水平的下降     對(duì)不同的siRNA的效果分析可以得到一些有趣的結(jié)論：1）設(shè)計(jì)siRNA看起來(lái)比較容易成功，12個(gè)siRNAs中有7個(gè)siRNAs對(duì)基因表達(dá)的抑制效果超過(guò)50%。而參照以前的實(shí)驗(yàn)，8個(gè)反義RNA中只有1個(gè)有效(Stein, 2001)。2）針對(duì)mRNA上不同位點(diǎn)的siRNAs抑制基因表達(dá)的效果各不相同，也沒(méi)有明顯的位置效應(yīng)。相比對(duì)照有的siRNA抑制基因表達(dá)高達(dá)到94%。3) siRNA

37、s抑制mRNA水平和抑制蛋白表達(dá)的程度顯著相關(guān)。這個(gè)結(jié)果支持“哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNAi誘導(dǎo)基因沉默是通過(guò)降低mRNA的量來(lái)減少目的蛋白的表達(dá)”的推論。4）siRNAs的專一性非常高，siRNAs特異抑制基因表達(dá)，但不會(huì)對(duì)非相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生特別的影響。這個(gè)結(jié)論使得siRNA成為研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞中鑒定基因功能的有力工具，潛在價(jià)值不可估量。 Real-Time RT-PCR檢測(cè)siRNA效果：用傳統(tǒng)方法的real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)并不支持免疫熒光法得到的基因沉默的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，比如免疫熒光法顯示c-myc蛋白水平下降了65%，而用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行real-time PCR的結(jié)果

38、和對(duì)照并沒(méi)有區(qū)別。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄操作過(guò)程中存在Endogenous random Priming（內(nèi)源隨機(jī)引導(dǎo)）的現(xiàn)象，雖然這種現(xiàn)象不影響一般的RT-PCR反應(yīng)，但是對(duì)定量分析卻可能會(huì)造成嚴(yán)重影響。采用改良的高嚴(yán)謹(jǐn)性的逆轉(zhuǎn)錄方法進(jìn)行RT反應(yīng)，對(duì)cDNA濃度進(jìn)行real-time PCR，這樣得到的結(jié)果顯示同一個(gè)樣品c-myc mRNA的水平實(shí)際下降了90-95%，這個(gè)結(jié)果和免疫熒光法的結(jié)果比較吻合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行real-time RT-PCR分析，是一種檢測(cè)siRNA效果的有效工具。體外轉(zhuǎn)錄制備的siRNA效果更好： 早前的實(shí)驗(yàn)表明化學(xué)合成的siRNA的有效轉(zhuǎn)

39、染濃度至少要比體外轉(zhuǎn)錄制備的siRNA高10倍以上。為了證實(shí)這個(gè)結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)中分別用化學(xué)法和體外轉(zhuǎn)錄法合成被認(rèn)為最有效的同一個(gè)GAPDH siRNA，并用同樣的方法進(jìn)行純化。兩種siRNAs分別以不同的濃度轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。和早前的結(jié)果一致，化學(xué)法合成的siRNA的最有效濃度是100200nM，而只需要5nM的體外轉(zhuǎn)錄制備siRNA就可以達(dá)到同樣的沉默效果。 圖一：用化學(xué)合成法和體外轉(zhuǎn)錄法制備的 siRNAs的活性比較。用兩種方法分別制備同一siRNA序列并按照不同濃度分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。收集純化各樣品的GAPDH mRNA并用Northern分析。GAPDH信號(hào)用cyclophilin探針

40、平衡化，用磷感屏定量。用siRNA在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)基因沉默。    siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)基因沉默需要一系列的內(nèi)源蛋白效應(yīng)分子，為了研究不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)siRNA的敏感性是否有特定的規(guī)律，實(shí)驗(yàn)選擇8種細(xì)胞株：HeLa S3, COS7, 293, NIH/3T3, A549, HT-29, CHO-KI, 和 MCF-7，選擇同源序列部分最有效的siRNA，分別轉(zhuǎn)染這8個(gè)細(xì)胞株。用Northern分析GAPDH和兩個(gè)負(fù)對(duì)照(cyclophilin 和 28S rRNA)mRNA。結(jié)果顯示，GAPDH siRNA對(duì)所有細(xì)胞株都表現(xiàn)出某

41、種程度的基因沉默效果，說(shuō)明基因沉默通路在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是普遍存在的。圖二：不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)siRNA誘導(dǎo)的基因沉默的易感性。 如圖所示的細(xì)胞株分別用化學(xué)合成和體外轉(zhuǎn)錄制備的siRNA轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后收獲細(xì)胞，分離純化RNA，變性膠電泳，Northern分析GAPDH探針和 cyclophilin, 和28S rRNA對(duì)照。 討論    siRNA是對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行遺傳分析的一種重要工具。siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)的基因沉默能有效的抑制特定基因的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中制備并檢測(cè)了3個(gè)目標(biāo)基因各自分別對(duì)應(yīng)的4個(gè)siRNAs，引人注目的是超過(guò)一半以上的s

42、iRNAs能非常有效的抑制目標(biāo)基因的表達(dá)（抑制效果超過(guò)50%以上）。進(jìn)一步的研究將著力于為什么有的siRNA效果不佳，這將有助于得到更加可靠的有效siRNA的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。RNA和蛋白分析提示：只有目標(biāo)蛋白收到對(duì)應(yīng)的siRNA的影響。綜合以上結(jié)果，只要很少一點(diǎn)功夫，就可以得到高效專一的抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞某個(gè)特定基因表達(dá)的有效工具。    體外轉(zhuǎn)錄法制備的siRNA比化學(xué)合成法更為有效。體外轉(zhuǎn)錄法可以有效將一對(duì)29mer或者以上的DNA序列制備成為siRNA。由于體外轉(zhuǎn)錄不能有效轉(zhuǎn)錄小于29mer的序列，所以siRNA設(shè)計(jì)時(shí)要在5端加上引導(dǎo)序列，在轉(zhuǎn)錄后去除，這

43、樣就可以制備任何一種siRNAs。DNA模版只需要少至25nmol的合成量，以及簡(jiǎn)單的脫鹽純化。實(shí)驗(yàn)表明體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNA至少比化學(xué)合成的有效10倍以上。由于比較實(shí)驗(yàn)是基于用相同的純化和定量方法，因此這種區(qū)別可能是由于化學(xué)合成和酶法之間的內(nèi)源的區(qū)別而造成的。    一種新的分析siRNA現(xiàn)象的方法。實(shí)驗(yàn)表明siRNA誘導(dǎo)的目標(biāo)基因沉默中mRNA和蛋白水平的下降顯著正相關(guān)，這個(gè)結(jié)果支持以下推論：哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的RNAi是由于目標(biāo)基因的mRNA水平下降而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白翻譯水平下降。RNA水平分析提供一種簡(jiǎn)單方便的方法去比較同一目標(biāo)基因的不同siRNAs的

44、效果1995年，康乃爾大學(xué)的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)（C. elegans）中的par-1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。她們本是利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲(chóng)注射正義RNA（sense RNA）以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反的。該研究小組一直沒(méi)能給這個(gè)意外以合理解釋。直到1998年2月，華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Craig Mello才首次揭開(kāi)這個(gè)懸疑之謎。通過(guò) 大量艱苦的工作，他們證實(shí)，Su Guo博

45、士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過(guò)去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲(chóng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過(guò)純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference ,簡(jiǎn)稱RNAi）。在隨后的短短一年中，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時(shí)作為功能基因組研

46、究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來(lái)越為人們所重視。RNAi的作用機(jī)制RNAi作用機(jī)制圖解（以線蟲(chóng)中的三種不同形式為例） 體外實(shí)驗(yàn)表明：RNAi反應(yīng)中，加入的dsRNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的RNA片段，后者會(huì)使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的片段。從已經(jīng)發(fā)生RNAi的果蠅S2細(xì)胞中，Hammond等人部分純化了一種核酸酶，該核酸酶具有序列特異性，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么這種核酸酶是如何確定哪些mRNA該降解而哪些不該呢？由于在純化該核酸酶時(shí)，可以共分離出21-23核苷酸長(zhǎng)的 dsRNA 片段，這暗示該核酸酶對(duì)mRNA的切割有可能是以這些片段作模

47、板指導(dǎo)進(jìn)行的。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人們提出一種RNAi作用的簡(jiǎn)單模型。當(dāng)dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別，切割成21-23核苷酸長(zhǎng)的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且作為模板識(shí)別目的mRNA；識(shí)別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來(lái)，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對(duì)mRNA進(jìn)行切割，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長(zhǎng)的dsRNA小片段，與核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對(duì)目的mRNA進(jìn)行切割，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。通過(guò)遺傳分析的方法，目前

48、已從線蟲(chóng)中已分離到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相關(guān)的基因。RNA干擾文庫(kù)及其在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用人類基因組大規(guī)模測(cè)序已經(jīng)基本完成。但破解基因組的序列只是一個(gè)起點(diǎn)，目前多數(shù)基因的功能還不清楚，因此基因功能的研究是今后 的發(fā)展趨勢(shì)。傳統(tǒng)研究基因功能的最有效技術(shù)之一是細(xì)胞和小鼠的基因敲除技術(shù)。但該技術(shù)存在技術(shù)復(fù)雜、周期長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，極大地 限制了它的應(yīng)用。應(yīng)用物理和化學(xué)突變技術(shù)可以誘導(dǎo)基因的隨機(jī)突變，導(dǎo)致細(xì)胞或動(dòng)物表型的缺陷，直接進(jìn)行基因功能的篩選。但由于該方法 通常需要兩個(gè)等位基因同時(shí)突變才會(huì)出現(xiàn)明顯的表型，成功的機(jī)會(huì)比較低。而RNA干擾(RNA interferenc

49、e，RNAi)文庫(kù)有希望成為一種簡(jiǎn)單、高 效、大規(guī)模、高通量的功能基因組學(xué)研究的工具。 1 RNAi及RNAi文庫(kù) RNAi是近年來(lái)的重大發(fā)現(xiàn)，是動(dòng)物和植物界普遍存在的一種防御反應(yīng)。RNAi被細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的雙鏈RNA(dsRNA)所激活，可以高度特異地抑 制同源基因的表達(dá)。根據(jù)目前的研究，RNAi的可能機(jī)制如下：長(zhǎng)片段dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被型RNA酶Dicer切成長(zhǎng)度大約為1923 nt的小片段干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)，由siRNA參與構(gòu)成復(fù)合物RISC(RNA-induced silence complex)。 siRNA通過(guò)與同源mRNA的特異配對(duì)

50、，引 導(dǎo)RISC特異地降解同源mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制。因此小片段的siRNA也可以誘導(dǎo)高效的基因沉默。 在線蟲(chóng)，注射或喂食dsRNA能引起特異基因在動(dòng)物各器官的沉默，而且該抑制作用可以持續(xù)到第一代的子代動(dòng)物。但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ，通過(guò)長(zhǎng)片段dsRNA直接轉(zhuǎn)染會(huì)引起細(xì)胞的毒性反應(yīng)，基因沉默效果差。近年來(lái)，陸續(xù)有用體外合成的 siRNA，或用質(zhì)粒、病毒等載體在細(xì)胞內(nèi) 表達(dá) siRNA達(dá)到在細(xì)胞和小鼠抑制特定基因表達(dá)的報(bào)道。 RNAi文庫(kù)(RNAi library)是人工構(gòu)建的能通過(guò)誘導(dǎo)RNAi抑制眾多不同基因表達(dá)的混合文庫(kù)，可以用于建立功能缺陷(loss offunction) 的生物或細(xì)胞

51、庫(kù)，進(jìn)行表型的篩選。該技術(shù)在線蟲(chóng)的應(yīng)用最為成功。在線蟲(chóng)等模式生物的研究中，應(yīng)用RNAi文庫(kù)建立隨機(jī)基因抑制的線蟲(chóng)，再 進(jìn)行表型的篩選，已在其胚胎發(fā)育等領(lǐng)域取得了重要的發(fā)現(xiàn)。該文庫(kù)用含方向相對(duì)的兩個(gè)T7啟動(dòng)子的載體，可從一個(gè)隨機(jī)克隆的cDNA模板分別 轉(zhuǎn)錄出長(zhǎng)片段的正義和反義RNA，形成dsRNA，在體內(nèi)被Dicer切割成小片段的siRNA，特異地抑制靶基因的表達(dá)。由于細(xì)胞外dsRNA不能在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞有效地誘導(dǎo)RNAi，另外，長(zhǎng)鏈dsRNA(>30nt)可導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性反應(yīng)，出現(xiàn)非特異的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡，上述轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片段dsRNA 建立RNAi文庫(kù)的方法不能應(yīng)用于哺乳動(dòng)物及其細(xì)

52、胞。 線蟲(chóng)等模式生物與人的差距較大，從模式生物獲得的研究結(jié)果雖然有比較重要的意義，但不能取代在人和其他高等動(dòng)物的直接研究。因 此建立可以用于人的細(xì)胞以及其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi文庫(kù)有非常重要的意義。RNAi文庫(kù)將為研究基因功能、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶基因、發(fā)現(xiàn)疾病 相關(guān)基因、探索腫瘤治療新途徑等提供重要的方法。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞建立RNAi文庫(kù)的方案有兩類。我們將對(duì)這兩類建 庫(kù)方案及其在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用作一介紹。 2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞已知基因RNAi文庫(kù) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞已知基因RNAi文庫(kù)構(gòu)建的方法如下：首先選定靶基因，根據(jù)靶基因的DNA序列和siRNA設(shè)計(jì)原則，合成siRNA，

53、或合成寡核 苷酸序列并克隆到表達(dá)載體，或用PCR的方法擴(kuò)增為siRNA表達(dá)盒。眾多針對(duì)不同基因的siRNA或 siRNA表達(dá)載體或表達(dá)盒即構(gòu)成有限的RNAi文庫(kù) 。應(yīng)用該文庫(kù)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以特異地抑制不同基因的表達(dá)，通過(guò)表型的篩選來(lái)發(fā)現(xiàn)功能基因，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路新分子的篩選、與腫瘤細(xì) 胞存活或轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選等。 Aza-Blanc等應(yīng)用Dharmacon公司生產(chǎn)的針對(duì)510個(gè)基因(包括了大多數(shù)激酶基因)的siRNA文庫(kù)，通過(guò)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞篩選了對(duì)TRAIL誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡有調(diào)控作用的基因。TRAIL是TNF家族的一員，具有抗腫瘤的功能。實(shí)驗(yàn)證明，TRAIL蛋白能同DR4和DR5受體結(jié)合，

54、誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋 亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。Aza-Blanc等的篩選既發(fā)現(xiàn)了一些能增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，也發(fā)現(xiàn)了一些具有抑制作用的基因。這些基因包括以前已知對(duì)TRAIL功能有調(diào)控作用的基因如 GSK30和SRP72，也包括一些未知的調(diào)控 基因如 DOBI、MIRSA等，對(duì)了解TRAIL的作用機(jī)制和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)有重要的意義。 Berns等構(gòu)建了針對(duì)7914個(gè)基因的人RNAi文庫(kù)。他們應(yīng)用了shRNA(short hairpin RNA)反轉(zhuǎn)錄病毒載體，每一個(gè)基因構(gòu)建了3個(gè)不同的 shRNA載體，共有23742個(gè)不同的載體。用該 RNAi文庫(kù)進(jìn)行基因功能的篩選，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)已知

55、、5個(gè)未知的在p53依賴的增殖阻滯中起調(diào)控作用的 基因。進(jìn)一步的研究證明，抑制這些基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)p53和p19ARF依賴的增殖阻滯以及對(duì) DNA破壞誘導(dǎo)的G1細(xì)胞周期阻滯均 不敏感。 Paddison等應(yīng)用shRNA病毒載體，構(gòu)建了針對(duì)9610個(gè)人基因和5563個(gè)小鼠基因的shRNA表達(dá)文庫(kù)。在26S蛋白酶系統(tǒng)的功能基因篩選中 ，證實(shí)該RNAi文庫(kù)的實(shí)用性和可靠性。 Zheng等構(gòu)建了一個(gè)雙啟動(dòng)子載體pDual。該載體包含兩個(gè)方向相對(duì)的聚合酶啟動(dòng)子，分別為小鼠的U6啟動(dòng)子和人的H1啟動(dòng)子，中間插 入能轉(zhuǎn)錄siRNA的DNA序列(圖1)。該載體的優(yōu)點(diǎn)是，正義和反義RNA從同一DNA序列轉(zhuǎn)錄

56、，減少了合成DNA序列的長(zhǎng)度，降低了費(fèi)用和工作量。他 們巧妙地設(shè)計(jì)了能用PCR擴(kuò)增的含雙啟動(dòng)子的 siRNA表達(dá)盒，并證實(shí)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效地抑制基因的表達(dá)。應(yīng)用這一技術(shù)，他們構(gòu)建了針 對(duì)8000個(gè)基因的siRNA表達(dá)盒，在大規(guī)模的功能基因篩選中發(fā)現(xiàn)了一些已知和未知的在NF-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用的基因。 Silva等將siRNA和siRNA表達(dá)載體與轉(zhuǎn)染試劑混合后以微陣列的形式點(diǎn)在細(xì)胞培養(yǎng)板上，可以轉(zhuǎn)染在板上生長(zhǎng)并與之接觸的活細(xì)胞。該 技術(shù)為應(yīng)用RNAi文庫(kù)進(jìn)行細(xì)胞的基因功能篩選提供了一個(gè)簡(jiǎn)單有效的方法。 上述研究均證明了有限的已知基因RNAi文庫(kù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能研究中的可行

57、性，為哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞大規(guī)模功能基因組學(xué)的研究 提供了一個(gè)重要的技術(shù)。 已知基因RNAi文庫(kù)存在以下缺陷：a不是隨機(jī)RNAi文庫(kù)，必須知道靶基因的序列，細(xì)胞基因的覆蓋面窄；b針對(duì)每一個(gè)基因必須合成 2條以上寡核苷酸，才能確保從中選出干擾效果較好的；C需要合成眾多的不同siRNA，或構(gòu)建眾多的不同載體；d所需費(fèi)用高，篩選的工作 量巨大。 3 晡乳動(dòng)物細(xì)胞隨機(jī)RNAi文庫(kù) 隨機(jī)RNAi文庫(kù)(random RNAi library)是人工構(gòu)建的可能針對(duì)任何基因的RNAi文庫(kù)。目前已報(bào)道的方法有兩種，一是通過(guò)化學(xué)合成隨機(jī) DNA序列的方法，二是通過(guò)cDNA酶切并克隆到載體的方法。隨機(jī)RNAi文庫(kù)不需要

58、知道靶基因的序列，因此理論上講可以構(gòu)成抑制任何基因表達(dá)的 干擾文庫(kù)，克服已知基因RNAi文庫(kù)細(xì)胞基因覆蓋面窄的缺陷。該文庫(kù)同常用的基因表達(dá)文庫(kù)一樣，為不同 siRNA載體的混合物，因此易于保存 ，顯著地減少了篩選的工作量。 化學(xué)合成隨機(jī)DNA序列構(gòu)成隨機(jī)RNAi文庫(kù)的方法是應(yīng)用以下原理。在化學(xué)合成寡核苷酸時(shí)，如果堿基選為N，則DNA合成儀在合成DNA片段 時(shí)將隨機(jī)選擇A、T、G、C中的任何一種。1921 nt的寡核苷酸如果部分或全部選為N時(shí)，則形成了眾多不同隨機(jī)序列寡核苷酸的混合物。在進(jìn) 行互補(bǔ)鏈合成并克隆到雙啟動(dòng)子RNAi載體(見(jiàn)圖1的載體)后，就形成了隨機(jī)RNAi文庫(kù)。限制性內(nèi)切酶Mme

59、I的特點(diǎn)是在DNA識(shí)別序列(TCCGAC)下游2021 bp處切開(kāi)DNA片段。 Luo等巧妙地應(yīng)用Mme I的獨(dú)特特性，設(shè)計(jì)了將長(zhǎng) cDNA片段酶切為202l nt小DNA片段，克隆于siRNA表達(dá)載體構(gòu)成隨機(jī)RNAi文庫(kù)的方案，稱為SPEED。首先將隨機(jī)cDNA片段與含Mme I酶切位點(diǎn)發(fā) 夾結(jié)構(gòu)的DNA接頭(linker)連接，再用 Mme I消化，獲得2021 bp與接頭連接的cDNA小片段。將形成的雙鏈DNA打開(kāi)成單鏈，合成互補(bǔ)鏈，形成 方向相對(duì)的兩個(gè)小片段cDNA的拷貝，中間為不配對(duì)的形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA序列。再克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，構(gòu)成隨機(jī)RNAi文庫(kù)。利用小鼠胚胎 cDNA文庫(kù)

60、，他們建立了含3×106克隆、可以抑制眾多不同基因的隨機(jī)RNAi文庫(kù)，證明該方法的可行性。 Shirane等應(yīng)用同Luo等基本相同的思路獨(dú)立地設(shè)計(jì)了構(gòu)建隨機(jī)RNAi文庫(kù)的方法，稱為 EPRIL。應(yīng)用鼠源FL5.12細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，他們建 立了隨機(jī)RNAi文庫(kù)。對(duì)240個(gè)不同克隆的隨機(jī)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，215個(gè)克隆含有正確的能表達(dá)siRNA的 DNA片段。BLAST分析顯示，165個(gè)克隆的插入片段 與己知基因或EST的順序相吻合，絕大多數(shù)分屬不同的基因。這一結(jié)果說(shuō)明，EPRIL可以用于復(fù)雜基因的隨機(jī)RNAi文庫(kù)的構(gòu)建。 Sen等獨(dú)立地設(shè)計(jì)了相似的建庫(kù)方案，稱為 REGS(restriction enzyme-generated siRNA)。為了測(cè)試該技術(shù)的效果，他們檢測(cè)了對(duì)轉(zhuǎn)基 因和內(nèi)源基因的作用。實(shí)驗(yàn)證明，用該技術(shù)制備的RNAi文庫(kù)可以有效地抑制GFP、Oct-34和MyoD的表達(dá)。他們應(yīng)用