1、假單胞菌的防治植物真菌性病害應(yīng)用研究進(jìn)展摘要:假單胞菌種類多、繁殖快。它們能通過產(chǎn)生多種抗生素及有效的根際定殖防治植物病害,促進(jìn)植物生長成為植物生防控制的重要研究對象。本文主要論述了假單胞菌對植物真菌性病害生物防治應(yīng)用的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞:假單胞菌;PGRR;生防應(yīng)用;植物病害Abstract Pseudomonas spp. is abundant and have a rapid reproduction, It can produce many kinds of antibiotics , rhizosphere colonization efficiently , promote the

2、 plant growth,in this way ,it become an important object in the study of biological control. This paper mainly discuss the biological control of Pseudomonas spp. in plant fungal disease.Key words Pseudomonad , PGPR , Biocontrol function;plant disease1 假單胞菌概況假單胞菌是一類直或微彎的桿菌,不呈螺旋狀,沒有菌柄也沒有鞘,不產(chǎn)芽孢,需氧型,廣泛分

3、布于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌。它是植物根際較普遍的微生物類群之一,此類細(xì)菌的多數(shù)種類能產(chǎn)生株系具有拮抗或促生作用1?，F(xiàn)已證實(shí)假單胞菌能產(chǎn)生有效鐵載體、抗生素、胞外水解酶和HCN等抑菌代謝產(chǎn)物,有效地保護(hù)植物根系免受病原微生物侵害2。目前關(guān)于假單胞菌屬的分類應(yīng)用廣泛的是pallernoi根據(jù)DNA-rRNA同源性研究提出的組群3。其將假單胞菌分為20個種59個致病變種。分為rRNA、五個同源群。在rRNA群中主要包含4個DNA同源群,本文主要研究rRNA群中熒光假單胞菌DNA同源群,熒光假單胞菌DNA同源群包括銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌3個種4。假單胞菌的生防作用一直是研究的熱點(diǎn),其

4、生防作用機(jī)制包括抗生作用、嗜鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、生態(tài)位競爭、誘導(dǎo)植物抗性和分泌降解病原微生物的酶等。2 假單胞菌對植物真菌性病害的生物防治作用2.1 抗生素介導(dǎo)的抑制在抗生素產(chǎn)生菌中,熒光假單胞菌屬在人工培養(yǎng)條件下產(chǎn)抗生素的能力最強(qiáng),目前有關(guān)假單胞菌屬拮抗作用機(jī)理方面的研究也最多。熒光假單胞菌通過產(chǎn)生多種抗生素對植物病害病原物產(chǎn)生抑制。熒光假單胞菌產(chǎn)生的抗生素有1 - 羧基吩嗪(phenazin - e - 1 - carboxylic acid, PCA 、藤黃綠膿菌素(pyoluteorin, Plt 、吡咯菌素(pyrrolnitrin, Pln 、2, 4 -二乙酰藤黃酚( 2, 4

5、- diacetylphloroglucinol, DAPG 、綠膿菌素(pyocyanin 、脂多肽、氫氰酸以及它們的衍生物等?？股? - 羧基吩嗪(PCA 和2 ,42二乙酰滕黃酚(DAPG 是假單胞菌產(chǎn)生的2 種最典型的次生代謝產(chǎn)物, PCA為吩嗪類抗生素,在細(xì)胞內(nèi)作為電子載體傳遞電子到靶細(xì)胞,通過增加胞內(nèi)超氧化物自由基,使靶細(xì)胞中毒死亡; DAPG為聚酮類抗生素,具有廣譜抗菌活性,在低濃度下可阻礙病原微生物的生長5。小麥全蝕病是一種真菌性病害,由禾頂囊殼菌Ggt ( Gaeamuuomyces gramiais var. t ritici 引起,禾頂囊殼菌屬子囊菌亞門真菌,是一種土壤

6、寄居菌,假單胞菌產(chǎn)生的PCA和DAPG 能夠限制禾頂囊殼菌的生存或活動,對小麥全蝕病有重要防治作用6。近年來開發(fā)了許多除草農(nóng)用抗生素,由假單胞菌產(chǎn)生的硝吡咯菌素、PCA、和DAPG 具有光譜抑真菌作用,對于草坪病害具有顯著地生物防治作用7,8。藤黃綠膿菌素則用于由卵菌屬真菌等引起的黃瓜、番茄等“根腐病”的防治9。2.2 嗜鐵素嗜鐵素是微生物在低鐵條件下分泌的小分子量物質(zhì),具有特異性,可以鰲合環(huán)境中微量的鐵元素。在堿性的土壤環(huán)境中,許多微生物自身合成并且分泌嗜鐵素,釋放到土壤中的嗜鐵素通過配合基的螯合反應(yīng),形成Siderophore-Fe 螯合物,從而增加了土壤中的生物有效性,并以特異的轉(zhuǎn)動系統(tǒng)

7、將鐵轉(zhuǎn)移到體內(nèi),滿足微生物自身的生長需要,使環(huán)境中的鐵濃度被降低,這樣病原微生物由于缺乏鐵而不能生長繁殖,進(jìn)而達(dá)到控制植物病害的目的10,11。王平等 12 利用鉻天青(CAS檢測法和400 nm特異光譜吸收法測定了在無鐵條件下,熒光假單胞菌株P(guān)13通過大量分泌鐵載體抑制油菜菌核病菌的作用. 并且隨著鐵離子濃度的提高,熒光假單胞菌株P(guān)13分泌鐵載體減少,對油菜菌核病菌的抑制作用相應(yīng)減弱。Schippers 教授從馬鈴薯根際中分離出生防細(xì)菌假單胞桿菌( Pseudomonas putidaWCS358菌株,證明該菌通過產(chǎn)生嗜鐵素抑制病菌的生長 13 。陳旋、曹福祥通過測定了惡臭假單胞桿菌( Ps

8、eudomonas putidaWCS358 r菌株及其嗜鐵素缺失突變體JM218,轉(zhuǎn)基因菌株WCS358phl和WCS358phz對板栗疫病菌生長和分生孢子萌發(fā)的抑制作用等進(jìn)一步確定了假單胞菌防治板栗疫病的潛力 14。2.3 競爭作用與根際定殖微生物之間競爭包含空間、營養(yǎng)、位點(diǎn)等競爭作用,假單胞菌的強(qiáng)競爭能力是其發(fā)揮生物防治作用的關(guān)鍵, 而假單胞菌所有的疾病抑制機(jī)制只有當(dāng)它在根際成功定殖后才能真正起作用。岳東霞,張要武研究了番茄根際促生菌假單胞菌在在浸種和灌根兩種情況下均能夠定殖在黃瓜根部并對黃瓜灰霉病和枯萎病的生防作用 15,16?？蒂O軍等按照固氮、解磷、解鉀、拮抗將6 種常見病原真菌,同

9、時能在植物根際定殖為基本初篩標(biāo)準(zhǔn),篩選出菌株后在實(shí)驗(yàn)室條件下測定多項(xiàng)促生能力( PGP ,再通過生理生化試驗(yàn)和16S rRNA 基因序列分析對所篩菌株進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其中7株屬于假單胞菌 17。2.4 HCN與酶假單胞菌通過產(chǎn)生許多具有抗性的次生代謝物與植物病原菌具有拮抗作用。如許多假單胞菌產(chǎn)生的HCN能影響植物的病原菌。M. Nagara jkumar等發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌PfMDU2產(chǎn)生的乙二酸對植物病原菌產(chǎn)生的草酸具有解毒作用,能夠抑制由Rhizoctonia solani引起的水稻病害18 。Nielsen等發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌96. 578產(chǎn)生環(huán)形脂肽,對病原菌Rhizoctonia solin

10、i有拮抗作用19 。假單胞菌還能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、過氧化物酶、溶菌酶、木聚糖酶等對物質(zhì)進(jìn)行降解,既可給植物提供營養(yǎng),又可減少植物病害的發(fā)生。Wang San2Lang 等 20 報道, Pseudomonas aeruginosa K2187 能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和溶菌酶, 抑制36 株真菌的生長。Lee H1S1等 21對Pseudomonas sp. YHS2A2 產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究并將其基因?qū)氪竽c桿菌中。王欽宏等 22從土樣中分離到1 株產(chǎn)胞外殼聚糖酶能力較高的假單胞菌( Pseudomonas sp. 。蘇玉萍等 23從熒光假單胞菌中分離純化到單一組分的木聚糖酶。孔令營等在松材線

11、蟲攜帶的熒光假單胞菌GcM5-1A 的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)有木質(zhì)素過氧化物酶( LigninPeroxidase,LiP 的活性。LiP 可以直接在細(xì)胞壁的表面或進(jìn)入細(xì)胞壁的內(nèi)部產(chǎn)生具有攻擊木質(zhì)素結(jié)構(gòu)能力的反應(yīng)中間產(chǎn)物,間接地引起木質(zhì)素的氧化反應(yīng),導(dǎo)致木質(zhì)素的分解,對細(xì)胞壁造成損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡24-27。2.5 誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性一些熒光假單胞菌在根部的定殖能誘導(dǎo)某些植物例如煙草、黃瓜、擬南芥等對病毒、細(xì)菌和真菌葉部病原產(chǎn)生系統(tǒng)抗性( Induced Systemic Resistance, ISR ,水楊酸的積累被認(rèn)為是重要因素,而脂多糖和嗜鐵素也是重要的誘導(dǎo)物質(zhì)。誘導(dǎo)抗性的可能機(jī)制是產(chǎn)生抗微生

12、物的低分子量化學(xué)物質(zhì),如植物保護(hù)素、雙萜、多聚物、木質(zhì)素和糖蛋白,誘導(dǎo)一些水解酶和氧化酶類 28 。有報道表明用P. fluorcescens WSC417 處理康乃馨花,再接種鐮刀萎蔫病病原菌,明顯提高了康乃馨的植物保衛(wèi)素水平 29。2.6 分子生物學(xué)應(yīng)用隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,關(guān)于熒光假單胞菌特性的研究更加廣泛, 使其能更有效地抵抗植物病原菌。假單胞菌株( Pseudomonas sp. M218 是促進(jìn)植物生長的根際細(xì)菌,能同時分泌藤黃綠菌素(pyoluterion ,Plt 和吩嗪212羧酸(phenazine212carboxylic acid ,PCA。王沂等運(yùn)用同源重組技術(shù),構(gòu)

13、建了假單胞菌( Pseudomonas sp. M218 株的qscR 突變菌株M218Q。結(jié)果表明全局性調(diào)控因子qscR 基因作為一個全局調(diào)控基因區(qū)別性地調(diào)控PCA 和Plt的生物合成 30。朱棟華等利用大腸桿菌2熒光假單胞菌穿梭質(zhì)粒pME6032,將rpoD全長基因置于強(qiáng)啟動子Ptac的控制下,再導(dǎo)入生防菌株M18。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在熒光假單胞菌M18中,重組質(zhì)粒攜帶rpoD基因,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),能以直接或間接的方式增強(qiáng)PCA和Plt 編碼基因的表達(dá)和次生代謝物的生物合成 31。3 討論針對假單胞菌具有產(chǎn)生抗生素、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等生物防治作用,可利用其開發(fā)微生物活菌制劑、抗生

14、素及其基因等。但是開發(fā)和使用其活菌制劑過程中離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),生長速度慢時熒光假單胞菌類容易產(chǎn)生胞外酶和次生代謝產(chǎn)物,因此假單胞菌能夠在根際顯示出生物防治活性,必須達(dá)到相對較高水平的種群密度,這就對產(chǎn)品的活菌數(shù)提出了較高的標(biāo)準(zhǔn),在生產(chǎn)過程中增加了一定的難度。盡管熒光假單胞菌作為植物根際促生菌對多種植物病害具有防治作用,但在實(shí)際應(yīng)用上仍存在許多困難。熒光假單胞菌成功定殖于植物根部是其發(fā)揮生防作用的先決條件。根部定殖是一個復(fù)雜的過程,包括定殖在根圍、根內(nèi)、根表和根圍土壤,是在一個不斷變化的環(huán)境中生防因子、病原菌和根圍微生物群落之間的相互作用。不同的假單胞菌在不同的植物根際有不同的定殖能力,土壤結(jié)構(gòu),

15、土壤中溫度、濕度、pH值以及土壤中其他生物體的存在都可能影響假單胞菌的定殖。其次,在誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性方面,細(xì)菌誘導(dǎo)性能力也存在差異,在一些作物上具有誘導(dǎo)活性的細(xì)菌可能在其他作物上沒有誘導(dǎo)活性;作物種間也存在被誘導(dǎo)抗性的差異。目前還不完全知道細(xì)菌中能產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的所有因子。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在不同學(xué)科領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,通過對這些作用機(jī)制的遺傳性狀進(jìn)行分析,進(jìn)而采用遺傳工程加以改良已成為可能。4 參考文獻(xiàn)1李愛榮,安德榮. 兩株生防熒光假單胞桿菌的室內(nèi)篩選試驗(yàn)J. 微生物學(xué)雜志, 2003,23 (4 : 11 - 1343:606-6094譚周進(jìn),肖羅,謝丙炎等.假單胞菌的微生態(tài)調(diào)節(jié)作用J.核農(nóng)學(xué)

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