1、純化分離的目的純化分離的目的l去除表達(dá)產(chǎn)物中非目的基因表達(dá)的雜蛋白以及非蛋白組分的雜質(zhì)，以得到單一條帶的目的蛋白。l去除內(nèi)毒素；蛋白酶；核酸等污染物。l濃縮目的蛋白至較高的濃度。l保存目的蛋白到合適的緩沖液中，去除對(duì)蛋白質(zhì)功能或保存有影響的試劑。純化的方法純化的方法l原則：利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。l常用方法：1. 色譜層析2. 沉淀3. 透析4. 電泳5. 差速離心色譜層析色譜層析l常用的色譜層析：1. 免疫親和色譜：蛋白質(zhì)與特異性配基配對(duì)到色譜基質(zhì)上，且蛋白質(zhì)與配基間具有可逆的相互作用。2. 離子交換色譜：利用不同的蛋

2、白質(zhì)表面凈電荷的差異進(jìn)行分離。3. 疏水相互作用色譜：蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白質(zhì)與疏水層析介質(zhì)疏表面可逆的相互作用來(lái)進(jìn)行分離。4. 凝膠過(guò)濾色譜：利用分子通過(guò)凝膠填料大小不同對(duì)其進(jìn)行分離。表達(dá)位置對(duì)層析的影響表達(dá)位置對(duì)層析的影響表達(dá)位置表達(dá)位置優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)分泌表達(dá)1. 樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單。2. 預(yù)處理過(guò)程短不會(huì)引入外源性?xún)?nèi)毒素，一般不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)造成破壞。3. 大量雜質(zhì)留在細(xì)胞內(nèi)，樣品成分相對(duì)純凈。1. 某些蛋白可能會(huì)受到培養(yǎng)基成分的影響。2. 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分未完全消耗，長(zhǎng)時(shí)間放置容易感染細(xì)菌。3. 樣品體積較大，需要較長(zhǎng)的濃縮時(shí)間。胞內(nèi)表達(dá)1. 樣品可以選擇合適的緩沖體系。2. 完

3、全去除培養(yǎng)基成分的影響，可以保存較長(zhǎng)時(shí)間。3. 細(xì)胞破碎后體積較小，回收時(shí)間短。1. 需要細(xì)胞破碎，離心等處理。2. 細(xì)胞破碎過(guò)程中易引入外源性?xún)?nèi)毒素，破碎過(guò)程比較劇烈，可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。3. 細(xì)胞破碎后釋放較多雜質(zhì)，增大純化難度。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A層析色譜層析色譜l常用的親和色譜層析：蛋白質(zhì)A(Protein A Sepharose Fast Flow)l原理：蛋白質(zhì)A來(lái)自金黃色葡萄球菌屬，包含5個(gè)區(qū)域，可以用來(lái)結(jié)合IgG的Fc區(qū)域。作為一個(gè)親和配基，蛋白質(zhì)A偶聯(lián)到Sepharose上，使得這些區(qū)域可以結(jié)合游離的IgG分子。一分子的蛋白質(zhì)A可以至少結(jié)合兩分子的IgG。*蛋白蛋白A的分子結(jié)構(gòu)的

4、分子結(jié)構(gòu)*典型的典型的IgG結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A層析色譜層析色譜l分離操作結(jié)合緩沖液：20mM磷酸納，pH7.0洗脫緩沖液：100mM甘氨酸/100mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH3.0中和緩沖液：1M Tris-HCl，pH9.0 1.用5倍柱體積的蒸餾水沖洗柱子。2.用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子。 3.上樣，流速為0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。4.用5-10倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡分離柱，直到基線(xiàn)，即所有未結(jié)合物質(zhì)都被沖洗出柱子（紫外檢測(cè)器在280nm波長(zhǎng)檢測(cè)）。5.用5倍柱體積的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。洗脫液立即用中和緩沖液（0.06ml0.2ml 1M Tris-HCl

5、，pH9.0每毫升餾分）中和至中性。6.立即用5-10倍體積的結(jié)合緩沖液重新平衡柱子 。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A層析色譜層析色譜l純化示例結(jié)合緩沖液：PBS,pH7.4洗脫緩沖液：0.1M Glycine,pH3.0樣品：ANTPD-A/ANTPD-B層析柱：Protein A Sepharose Fast Flow細(xì)胞培養(yǎng)液 MK 流穿樣品 洗脫樣品60KD120KD20KD14KD90KD40KD30KD蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)A層析色譜層析色譜l注意事項(xiàng)1.樣品需要離心（10000g/20min）去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。離心下來(lái)的上清經(jīng)過(guò)一個(gè)0.45m的濾膜過(guò)濾。2.來(lái)自多數(shù)物種的IgGs和亞類(lèi)，在接近生理pH值

6、和離子強(qiáng)度的條件下，可以結(jié)合到蛋白質(zhì)A上。如果蛋白質(zhì)和配基之間的互相作用較弱，應(yīng)該避免過(guò)度沖洗，因?yàn)檫@樣可能會(huì)減少最終的產(chǎn)量。3.對(duì)于一些抗體，比如小鼠IgG，當(dāng)使用蛋白質(zhì)A進(jìn)行純化時(shí)，可能需要向結(jié)合緩沖液中加入3M的氯化鈉，達(dá)到最有效的結(jié)合，例如1.5M的甘氨酸和3M的氯化鈉，pH為8.9。 4.洗脫完成后，立即用5-10倍體積的結(jié)合緩沖液重新平衡柱子避免柱子保存在低pH的環(huán)境中。金屬螯合層析色譜金屬螯合層析色譜l常用的親和色譜層析：金屬螯合層析（Chelating Sepharose Fast Flow）l原理：螯合的Sepharose，當(dāng)帶有Ni2+離子時(shí)，如果形成氨基酸殘基的復(fù)合物，特

7、別是組氨酸殘基被暴露在蛋白質(zhì)表面時(shí)，可以選擇性的結(jié)合蛋白質(zhì)。(His)6融合蛋白可以很容易的結(jié)合到親和柱上，然后用含有咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫。 *組氨酸融合蛋白與組氨酸融合蛋白與Ni2+螯合后填料的結(jié)合示意螯合后填料的結(jié)合示意金屬螯合層析色譜金屬螯合層析色譜l分離操作鎳溶液：0.1M Ni2SO4結(jié)合緩沖液：20mM磷酸納，0.25M NaCl，pH7.4洗脫緩沖液：20mM磷酸納，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.41.用5倍柱體積的蒸餾水沖洗柱子。2.加入0.5個(gè)柱體積的0.1M Ni2SO4。3.用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子。 4.上樣，流速為1-4ml/min（1ml的

8、柱子），收集流穿片段。5.用510倍柱體積的結(jié)合緩沖液平衡分離柱，直到基線(xiàn)，即所有未結(jié)合物質(zhì)都被沖洗出柱子。6.用5倍柱體積的較低咪唑濃度（50mM）的洗脫緩沖液進(jìn)行預(yù)洗脫。7.重復(fù)步驟6，使用更高的咪唑濃度直到目的蛋白都被洗脫下來(lái)。8.用10倍體積的結(jié)合緩沖液沖洗柱子，親和柱可以進(jìn)進(jìn)行新一輪的純化，并且?guī)缀醪恍枰俅渭虞d金屬，如果是純化用同樣的HIS6標(biāo)記的融合蛋白。金屬螯合層析色譜金屬螯合層析色譜l純化示例60KD120KD20KD14KD90KD40KD30KD金屬螯合層析色譜金屬螯合層析色譜l純化示例1結(jié)合緩沖液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4洗脫緩沖液：20mM P

9、B，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4樣品： OTIG細(xì)胞培養(yǎng)上清層析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow MK 培養(yǎng)上清 流穿樣品 洗脫樣品1 洗脫樣品2 60KD120KD20KD90KD40KD30KD金屬螯合層析色譜金屬螯合層析色譜l純化示例2結(jié)合緩沖液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4洗脫緩沖液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4樣品： 2SXA細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞破碎層析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow破碎上清 流穿樣品 洗脫樣品1 MK 洗脫樣品2 洗脫樣品3 洗脫樣品4

10、 60KD120KD20KD14KD90KD40KD30KD金屬螯合層析色譜金屬螯合層析色譜l注意事項(xiàng)1.咪唑在280nm處有吸收，當(dāng)監(jiān)測(cè)吸光度時(shí)，需要以洗脫緩沖液作為空白。2.在較低的pH值的條件下，金屬離子的丟失是非常明顯的。如果是對(duì)同樣的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，在每次純化之間沒(méi)有必要將柱子剝離，進(jìn)行510次純化后，需要對(duì)色譜柱進(jìn)行剝離和再充電。3.NaOH和Ni2SO4會(huì)反應(yīng)發(fā)生沉淀，需注意剝離Ni離子后才能沖洗NaOH。重力柱的應(yīng)用重力柱的應(yīng)用l裝柱和分離過(guò)程1.裝入下篩板并用去離子水潤(rùn)洗空柱體。2.接好下堵頭，取合適體積的填料并用移液器吹打均勻，加入空柱體。3.繼續(xù)加入去離子水讓填料沉降完全

11、，裝入上篩板。4.保持一定的液面高度，蓋上蓋子完成裝柱。 1 2 3 4重力柱的應(yīng)用重力柱的應(yīng)用l分離操作SOPFC親和標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)流程樣品預(yù)處理： 20ml培養(yǎng)上清補(bǔ)加20mMPB，調(diào)pH至7.4.Buffer A：PBS, pH7.4Buffer B：0.1M Glycine，pH3.0Protein A填料載量比較低，1ml填料可以結(jié)合2mg左右FC標(biāo)簽蛋白，根據(jù)表達(dá)量選用合適的Protein A親和柱。（不可用NaOH來(lái)控內(nèi)毒或者清洗）PBS平衡后上樣，收集流出液。上樣完畢，再用平衡液平衡親和柱（盡可能提高平衡體積，至少10ml）。平衡后用buffer B洗脫，分別收集洗脫液。洗脫液的收集

12、管預(yù)先加入一定量的1M Tris，pH9.0調(diào)節(jié)pH值，洗脫完成后用Buffer A重新平衡柱子。收集方法：0.2ml重力柱：每個(gè)梯度分開(kāi)收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每個(gè)梯度分開(kāi)收集：0.5ml，1.5ml，1ml重力柱的應(yīng)用重力柱的應(yīng)用l分離操作SOPHis親和標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)流程樣品預(yù)處理：20ml培養(yǎng)上清加入20mM PB,500mM NaCl調(diào)節(jié)pH至7.5。Buffer A：20mM PB,500mM NaCl, pH7.5Buffer B：20mM PB,500mM NaCl,500mM Imizadole,pH7.5根據(jù)樣品中含有目標(biāo)蛋白的量來(lái)確定使用的H

13、is柱類(lèi)型（理論上1mlHis填料至少可以結(jié)合10mg蛋白）：通常20ml細(xì)胞液用0.2ml填料的重力柱，如果目標(biāo)表達(dá)很好，可以增加填料體積，或改用1ml預(yù)裝柱。用buffer A平衡緩沖液處理。上樣，收集流出液。上樣完畢，再用平衡buffer平衡柱子（至少10ml）。平衡后用含有50mM、500mM的咪唑緩沖液洗脫，并分別收集洗脫液。收集方法：0.2ml重力柱：每個(gè)梯度分開(kāi)收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每個(gè)梯度分開(kāi)收集：0.5ml，1.5ml，1ml重力柱的應(yīng)用重力柱的應(yīng)用l注意事項(xiàng)1.細(xì)胞項(xiàng)目進(jìn)行重力柱實(shí)驗(yàn)時(shí)可能會(huì)同時(shí)進(jìn)行多根，為避免弄混樣品，一定要做好相應(yīng)標(biāo)記，擺放重力柱和