1、全長(zhǎng)cDNA在功能基因組學(xué)中的意義cDNA (complementary DNA )是指從 mRNA 反轉(zhuǎn)錄而得到的 DNA ,是 mRNA 的一個(gè)可靠的拷貝。 由于cDNA已經(jīng)經(jīng)過(guò)了剪接，而且含有完整的CDS,因此cDNA是研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)的重要資源。采用一般的方法構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，其全長(zhǎng)的比例往往比較低，主要是因?yàn)樵赾DNA第一鏈的生成過(guò)程中，反轉(zhuǎn)錄酶在還沒(méi)有生成完整的第一鏈的情況下就脫離了反應(yīng)，以致得到不完整的 cDNA o CDNA第一鏈的生成一般使用 polyT作引物，因此，一般 cDNA文庫(kù)中，含有大量的 3'端 EST,而mRNA5 '端的信息較少。但在

2、功能基因組的研究中，5'端序列更有意義。因此，構(gòu)建富含全長(zhǎng)的cDNA克隆的文庫(kù)顯得更加重要。1富含全長(zhǎng)cDNA勺文庫(kù)的構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA就是含有完整的 3'和5'端白cDNA ,mRNA的3'端具有polyA作為“標(biāo)簽序列"(sequence tag)用于辯別mRNA或cDNA是否含有完整的3'端。在生成第一鏈cDNA的過(guò)程中一般采用 polyT 作引物，所以，得到的 cDNA克隆一般都含有完整的 3'端。mRNA的5'端與3'端不同，它沒(méi)有 高度保守的序列可用作“標(biāo)簽序列”來(lái)通過(guò) DNA/DNA 或DNA/RNA 雜交進(jìn)

3、行5'端鑒定，只有帽 子結(jié)構(gòu)(CAP)。因此為了分離到全長(zhǎng) cDNA克隆，研究者一般利用“帽子結(jié)構(gòu)”在 mRNA的5' 端加上一段序列或者其他標(biāo)記物。1.1.1常規(guī)方法這里說(shuō)的常規(guī)方法，也就是夠建一般的 cDNA文庫(kù)所采用的方法。分離出 mRNA后，以mRNA為 模板、帶接頭的polyT作引物合成第一鏈 cDNA ,再以用第一鏈作模板合成雙鏈 cDNA ,加上5'端 接頭，便可連到載體上。1.1. 2 Oligo CAP勺方法Oligo-CAP的方法是在 mRNA的5'端加上一段寡核甘酸取代5' CAP。具體過(guò)程如圖1所示。其原理是在 BAP (bact

4、erial alkaline phosphatase)和 TAP ttobacco acid pyrophosphatase)的作用下，完 整的mRNA (含CAP)的5'端的G被切除，剩下一個(gè)一個(gè)磷酸基團(tuán)，可以在 RNA連接酶的作用 下與Oligo adapter連接；而不含 CAP的mRNA的5'端則是一個(gè)羥基，無(wú)法與 Oligo adapter連接。 這樣，mRNA的5'端也有了可識(shí)別的“標(biāo)簽序列”。1.1. 3 CA- Select 的方法如圖2所示，在生成cDNA第一鏈時(shí)，引物中帶錨定序列，同時(shí)加入 MnCl2。在MnCl2存在時(shí)，反 轉(zhuǎn)錄酶會(huì)在有 CAP的m

5、RNA為模板的第一鏈 cDNA的3'端加上三至四個(gè) dCMP ,然后在末端轉(zhuǎn) 移酶的作用下加上三到四個(gè) dAMP ,在3'端形成一粘端。這樣，在 RNA連接酶的作用下加上 3' 接頭。這樣，在 5'和3'端都有特異白序列用于 PCR擴(kuò)增及全長(zhǎng)cDNA的篩選。1.1.4 CAP Traper select的方法Zy iA；rM Tg上 MI I-riawPdEK W”Adifiiir lifflua口*，二爐%打'心內(nèi)：1 "7.： 田 &i iiUh,.LfewmirtiE- nJ.-k-MJiiil TImAh髀刎HJffAI

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8、lccc (c2. J.rifl I ：., 'f' I ： I i nlzi A 1 ! - 31 f'：.rlAAA (A)CCC(C>3. Selective libation of ful1 length cdnaaaa(a)ccc(c>1. IJCE? imp I i f icctL ionadapter primerunch'irriraier圖2 CAP SELECT法獲得全長(zhǎng) cDNA要過(guò)程如圖3所示。它采用的策略就是 cDNA第一鏈生成，DNA/RNA復(fù)合物未分離時(shí)，用生物素 標(biāo)記RNA的5'端，再用 Rnase I處理。如果形成的第一鏈 cDNA不完整，那在 Rnase I的作用下， 突出的單鏈RNA被降解，5'端的生物素標(biāo)記也隨之失去。生物素與磁珠偶聯(lián)的親和素吸附，這樣， 經(jīng)過(guò)層析，便可把全長(zhǎng)與非全長(zhǎng)的cDNA分離開(kāi)。1 . 2文庫(kù)中全長(zhǎng)cDNA的識(shí)別以上介紹的幾種方法可得到含有一定比例全長(zhǎng)cDNA的文庫(kù)。但并非所有的克隆都是全長(zhǎng)cDNA克隆，因此還