1、巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的降解機理及其控制策略1.巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的降解機理在外源蛋白的表達過程中，宿主菌畢赤酵母的胞內(nèi)和胞外均有一定量的蛋白酶的表達， 因此，不論是胞內(nèi)表達亦或是分泌表達，大多數(shù)外源蛋白均面臨著被降解的問題，這也是影響表達量的一個重要因素，同時，還增加了純化目的蛋白的難度。近年來，蛋白酶的研究是P.pastoris表達系統(tǒng)一個重點和熱點。越來越多的蛋白酶的遺傳背景和生理生化性質(zhì)得到深 入的研究。P.pastoris能根據(jù)細胞生長環(huán)境(碳源的改變以及細胞或細胞器的脅迫)來調(diào)整 自身酶系，以合成與降解不同的蛋白和細胞器，液泡是蛋白質(zhì)降解最主要的場所，另一降解場所是細胞

2、基質(zhì)蛋白酶體中。但是，對于外源蛋白來說，其降解常在表達和分離純化的第一步，主要是由培養(yǎng)基中胞外蛋白酶，細胞外膜結合蛋白酶( cell-bound proteases)和細胞自 噬或裂解釋放的胞內(nèi)蛋白酶降解的。胞內(nèi)蛋白酶主要涉及降解蛋白質(zhì)前體產(chǎn)生活性蛋白； 切除轉運出膜后的蛋白質(zhì)信號肽；使調(diào)控蛋白失活；降解變異或不需要的蛋白質(zhì)；提供營養(yǎng)， 前體和能量。胞外蛋白酶分泌較少，主要降解部分蛋白質(zhì)提供氨基酸和多肽等營養(yǎng)。根據(jù)蛋白酶的分泌和作用地點，P.pastoris的胞內(nèi)蛋白酶可以分為三種類別，即液泡蛋白酶(vacuolar proteases)，細胞基質(zhì)蛋白酶體(the cytosolic prot

3、eosome)以及分泌途徑的蛋 白酶(proteases located along the secretory pathway)。表1.2畢赤酵母液泡蛋白酶和分泌途徑蛋白酶Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathwayEnzymeTypeGeneZymogen formVacuolePrAAsparticPEP4YesPrBSerinePRB1YesCpYSerinePRC1YesCpSMetallo-( Zn2+)CPS1UnknownApIMetallo-( Zn2+)LAP4YesApCoMeta

4、llo-(Co2+)DAP2NoDPAP-B Serine SEC11 UnknownSecretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 YesKex1 carboxypeptidase Serine KEX1 NoDPAP-A Serine STE13 Unknown,predict noYeast aspartyl proteaselAsparticYAP3 Unknown,predict yes酵母液泡位于基質(zhì)中，一方面是維持胞內(nèi)pH和鹽離子平衡，儲藏鹽離子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特異性的水解酶，較寬底

5、物范圍的內(nèi)生和異源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至細胞器的一個重要場所，大約80%的蛋白在液泡中降解。在P.pastoris生長和表達外源蛋白過程中，由于碳源從葡萄糖或甘油到甲醇的改變，甲 醇代謝酶系(AOX,FAD,DHAS 等)和過氧化氫體逐步積累，同時，相應的蛋白酶也產(chǎn)生了。由于細胞器脅迫的影響，過氧化氫體一部分在基質(zhì)中自噬降解，大部分過氧化氫體轉運到液泡中得到降解。P.pastoris中位于與細胞膜結合的胞內(nèi)蛋白酶類可分為蛋白質(zhì)水解酶(內(nèi)切酶)和多肽 外切酶，由蛋白酶，愈肽酶，氨肽酶類組成。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前體經(jīng)過酶切活化而成，按照其作用活性位點又分為4類，絲氨酸類蛋白酶、金屬蛋白

6、酶、半胱氨酸類蛋白酶和天冬氨酸類蛋白酶。絲氨酸類蛋白酶最適pH值比較高，又叫堿性蛋白酶，而天冬氨酸類蛋白酶需要低的 pH范圍，又叫酸性蛋白酶。主要的液泡內(nèi)蛋白酶有以下幾種：蛋白酶 A(proteinaseA , PrA),蛋白酶 B ( proteinase B, PrB),愈肽酶 Y (carboxypeptidases Y, CpY ), 愈肽酶 S (carboxypeptidases S, CpS),氨肽酶 I (aminopeptidases I, Apl )，氨肽酶 Co (aminopeptidase Co , ApCo), 二肽氨肽酶 B ( Dipeptidyl aminop

7、eptidase B , DPAP-B )。蛋白酶A,分子量約42kDa,是天冬氨酸類蛋白酶，由基因 PEP4表達，其前體能自身催化而 形成成熟的蛋白酶，并催化愈肽酶Y前體和蛋白酶B前體形成愈肽酶 丫和蛋白酶B;蛋白酶B,分子量約32kDa，絲氨酸類蛋白酶，由基因 PRB1表達，對基因PRB1克隆和測序發(fā) 現(xiàn)是一個很大閱讀框， 編碼一個最少69 kDa的前提，其前體有50%的自身催化成蛋白酶 B, 另一部分由蛋白酶 A催化；蛋白酶 A和蛋白酶B是液泡中最基本的蛋白酶，是其他蛋白質(zhì) 水解酶的激活劑。愈肽酶 Y,是絲氨酸類蛋白酶，由基因PRCl編碼，其生物合成，液泡內(nèi)分揀和CPY的加工成熟目前研究

8、很清楚。PRCI基因編碼的愈肽酶 Y前體包含一個 N-端信號肽，一個含90個氨基酸的前肽和一個含421個氨基酸的酶活區(qū)域。愈肽酶Y前體經(jīng)過高爾基體后切除糖鏈得到一個69kDa的中間體，然后在液泡中切除前肽形成61 kDa成熟的愈肽酶Y。愈肽酶Y前體(67kDa)沒有生物活性，必須在蛋白酶B作用下或蛋白酶 A與蛋白酶B共同作用才能形成成熟的愈肽酶Y。愈肽酶S,是一個由基因CPSI編碼，依賴于金屬離子的愈肽酶，分子量 7377kDa,其合成與膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關。氨肽酶I,由基因LAP4編碼，是一個含有12個亞基分子量為 640 kDa的金屬多肽，氨肽酶 Co是一個分子量為100kDa的Co2+金屬多肽

9、，其機理目前不清楚。二肽氨肽酶B ,由基因DAP2編碼的膜接合液泡蛋白酶，在傳遞到液泡前沒有蛋白酶活性。酵母液泡中的各種蛋白酶量會隨著發(fā)酵過程中營養(yǎng)條件的改變發(fā)生變化，如發(fā)酵過程中的饑餓脅迫、碳源改變、熱和pH變化及有毒有害產(chǎn)物的形成等。分泌到胞外的重組蛋白降解有可能是由于蛋白酶的過表達而部分分泌到胞外所致和高密度培養(yǎng)時細胞自溶造成膜破 裂而釋放出蛋白酶兩種因素引起。在Sinha的研究中發(fā)現(xiàn)當P. pastoris從甘油生長階段轉為以甲醇為碳源誘導表達階段時，培養(yǎng)基中的各種蛋白酶量明顯增加，遠高于一直以甘油作為碳源的實驗對照組。基質(zhì)蛋白酶體，又稱蛋白體，多蛋白酶復合體，多催化功能蛋白酶，存在于

10、真核細胞內(nèi)， 主要完成蛋白酶水解途徑的中間過程，其中20S的蛋白酶體，位于所有真核生物的細胞核和細胞間質(zhì)中，是一個分子量為700 kDa圓柱形顆粒，由14個不同的亞基折疊纏繞而成。26S蛋白酶體是一個巨型蛋白酶復合物，分子量高達 1700 kDa,主要降解依賴 ATP的泛醍 類蛋白質(zhì)，它是由2個19S蛋白酶體連接到20S蛋白酶體兩端構成，它們主要負責短周期 的蛋白質(zhì)的分揀和快速降解，包括某些對細胞有害的蛋白質(zhì)。液泡和蛋白酶體降解的互作是 調(diào)節(jié)細胞過程的一個重要方式，特別是對細胞脅迫的響應方面。分泌途徑的蛋白酶主要分布在高爾基體和細胞質(zhì)膜上，其功能是去處去除蛋白酶前體上的多肽，主要的蛋白酶有信號

11、肽(Signal peptidase), Kex2 蛋白酶(Kex2 Endoproteas ), Kexl 愈肽酶(Kexl carboxypeptidase ) 二肽氨肽酶 A ( Dipeptidyl Aminopeptidase A , DPAP-A)，酵母天冬酰胺蛋白酶 III (Yeast Aspartyl Protease III , Yap3 Protease)。信號肽是一個最少包含 4個亞基的完整的膜蛋白。 Kex2 蛋白酶，由基因KEX2編碼，其功能是切除 COOH-端的Lys-Arg or Arg-Arg 鍵殘基。Kexl狡 肽酶，由基因KEXl編碼，是一個特異性的絲氨酸

12、類蛋白酶，二肽氨肽酶A ,由基因STE13編碼的膜蛋白，酵母天冬酰胺蛋白酶III，其功能是在Kex2蛋白酶的作用下，切除受體COOH- 端a因子前體。 在發(fā)酵過程中，由于高密度細胞的影響以及部分細胞的裂解，液泡中的蛋白酶常釋放到培養(yǎng)基中，導致目的蛋白的降解。在發(fā)酵的過程中，隨著外源蛋白在培養(yǎng)基中的濃度不斷提高， 蛋白水解酶濃度也隨著升高，對外源蛋白產(chǎn)生降解作用。因此，防止蛋白水解酶的水解作用， 提高外源蛋白的穩(wěn)定性，減少外源蛋白的損失，也就相對地提高了外源蛋白的產(chǎn)量。2.巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的降解控制策略蛋白酶降解是酵母表達系統(tǒng)的共有一個缺陷，降解不僅能引起目的蛋白的產(chǎn)率下降，降解形成的

13、片斷還能造成分離純化極大困難，特別是與目的蛋白分子量大小相差很小的降解產(chǎn)物，由于它們的理化性質(zhì)接近，常規(guī)的分離方法很難將它們分離開來，導致產(chǎn)品收率大大下降，產(chǎn)品純度低，蛋白的比活性降低。幾乎所有在酵母中表達的重組蛋白都或多或少地存在表達蛋白降解問題，只是程度不同而已。而表達蛋白發(fā)生降解的不同程度往往是由于發(fā)酵培 養(yǎng)條件和發(fā)酵控制方式不同所致。盡管降解程度有所不同，但引起蛋白降解的直接原因是酵母細胞自身存在的各種蛋白酶。蛋白質(zhì)的降解常引起目的蛋白產(chǎn)率的減少，生物活性的降低，并在分離純化過程中降解產(chǎn)物由于類似的物化或親和性質(zhì)而造成產(chǎn)物污染。P. pastoris表達外源蛋白時的蛋白降解控制策略日益

14、受到重視。為避免蛋白酶的降解，不同的策略得到應用，如2使用蛋白酶缺陷菌株(protease deficient strains),對蛋白質(zhì)結構進行修飾(modification of the protein structure ),添加蛋白酶抑制劑(addition of protease inhibitors )，改變培養(yǎng)基 pH ( changing the pH of the culture medium )以及添加在培養(yǎng)基中補加，如酪蛋白水解物 (Casamino acids)、蛋白月東(yeastpeptone)等一些富含氨基酸和多肽的組分。歸納起來可以分為三種水平策略：培養(yǎng)水平 (

15、cultivation-level strategies),細 胞水平(cellular-level strategies )和蛋 白質(zhì)水 平策略 (protein-level strategies)。 2.1培養(yǎng)水平策略提高分泌蛋白的穩(wěn)定性可通過改變培養(yǎng)基的pH來加以改善。P. pastoris的pH適應范圍比較廣，可以在pH 2.87的范圍內(nèi)生長。不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范圍，選擇適當?shù)陌l(fā)酵pH可以不影響細胞的生長，但可降低蛋白酶活性，減少目的蛋白的降解。P. pastoris在pH 3.0條件下發(fā)酵重組水蛭素比pH 5.0下的降解少。pH 6.0最適人表皮生長因子和白蛋白的表達，

16、在pH 3.0最適人胰島素樣生長因子、CD4蛋白的V1亞基表達，而咖啡豆半乳糖昔酶在pH45不降解，pH高或低均降解，pH 3.0最嚴重。低溫能影響目的蛋白的產(chǎn)量，主要是由于溫度較高時，重組蛋白不穩(wěn)定，以及死細胞釋放的蛋白酶的活性增強。Li等實驗說明將培養(yǎng)溫度從30C降低到23C時，畢赤酵母表達鮮魚抗凍蛋白從5.3mg/升到18.0mg/L,同時也發(fā)現(xiàn)活細胞率 (cell viability )增加。Hong et al.通過降低發(fā)酵溫度(從30C降到20C)使表達的laccase活性增強。Jahic et al應用溫度限制流 加發(fā)酵技術(a temperature-limited fed-b

17、atch technique , TLFB)獲得了更高濃度的融合蛋白， 同時細胞死亡率和蛋白酶活性都降低。通過添加特異性蛋白酶抑制劑也可減少目的蛋白的降解。Shi et al利用畢赤酵母表達抗Mamestra configurata serpin單鏈抗體(scFv)時候，鑒定到存在三種蛋白酶類，即天冬氨酸型 蛋白酶、半胱氨酸型蛋白酶及絲氨酸型蛋白酶。通過添加絲氨酸蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液總蛋白酶活性下降 53%，添加天冬氨酸蛋白酶抑制劑，總蛋白酶活性下降 30%。不過，大 規(guī)模表達外源蛋白時添加特異性蛋白酶抑制劑使生產(chǎn)成本大幅度上升。另外，盡管特異性蛋白酶抑制劑可提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性，但必須注意的

18、問題是蛋白酶抑制劑與培養(yǎng)基的結合能顯著 改變部分蛋白組成。例如加入5mM EDTA到畢赤酵母發(fā)酵液培養(yǎng)時會引起一個分子量近50kDa的蛋白分子在發(fā)酵液中的積累，該蛋白序列與S.cerevisiae和Candida albilabs的exo-B-1,3-glucanase序列很接近。在培養(yǎng)基中補加一些富含氨基酸和多肽的組分，如酪蛋白 水解物(Casamino acids)、蛋白月東(yeast peptone)、胃蛋白酶水解物等，為蛋白水解酶提供 過量的底物，以減少目的蛋白的降解。加入Casamino acid或YP到培養(yǎng)基中，進一步提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性。把培養(yǎng)基中的pH從5.2增加到6.0,則可顯

19、著提高分泌的rHSA產(chǎn)量，再加入YP又可提高其表達的產(chǎn)量。通過添加1% Casamino acids, mouse epidermal growth factor(mEGF)表達量顯著提高。對于是加入Casamino acid還是加入 YP ,通常認為最好加入Casamino acid，因為YP的肽組成會影響產(chǎn)物的分析和提取。直接添加氨基酸也能有效防止 目的蛋白被降解。 Won-A Choi等認為0.3M L-Arg和L-Lys能夠有效地防止目的蛋白被胞內(nèi) 蛋白酶酶解。發(fā)酵時控制一定的比生長速率，或利用連續(xù)培養(yǎng)的發(fā)酵方式。細胞比生長速率同樣可影響目的蛋白的降解。通過控制誘導相比生長速率為0.02 - 0.047h-1,即相應的甲醇濃度為 3.09g/L時候，畢赤酵母表達水蛭素的降解可控制到最小程度。2.2細胞水平策略產(chǎn)物的穩(wěn)定性也可通過改造畢赤酵母表達宿主的蛋白酶缺陷型菌株來提高。如SMD1168(his4,pep4)、SMD1165(his4,prb1)和 SMD1163(his4,pe