1、 n蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。n自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。 第1頁(yè)/共31頁(yè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定是一項(xiàng)非常復(fù)雜的工作第2頁(yè)/共31頁(yè)A. 樣品必需純（樣品必需純（97%以上）；以上）；B. 知道蛋白質(zhì)的分子量；知道蛋白質(zhì)的分子量；C. 知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；D. 測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。E. 測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。（1）測(cè)定蛋白

2、質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求第3頁(yè)/共31頁(yè)（2 2）蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法氨基酸組成分析氨基酸末端分析蛋白質(zhì)中肽鏈的拆離肽鏈的部分降解及肽片斷的分離肽段氨基酸順序測(cè)定及肽段重疊二硫鍵與酰胺基的定位 第4頁(yè)/共31頁(yè)測(cè)定蛋白質(zhì)氨基酸殘基組成n根據(jù)蛋白質(zhì)分子量，計(jì)算出構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨基酸的數(shù)量；n 采用經(jīng)典的陽(yáng)離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生法，對(duì)蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分含量進(jìn)行分析。第5頁(yè)/共31頁(yè)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。 第6頁(yè)/共31頁(yè)n由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分單獨(dú)分離出來(lái)；n幾

3、條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一 起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的 -巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基；n用過(guò)氧酸氧化或巰基化合物還原二硫鍵斷裂，用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止其重新被氧化； n如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基)。 二硫健的斷裂及多肽鏈的拆分第7頁(yè)/共31頁(yè)巰基的保護(hù)-OOCCHCH2SHNH3+ICH2CNH2OCH2OCClOCH2Cl-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基

4、，以防止它重新被氧化第8頁(yè)/共31頁(yè)n用酶溴化氫選擇性降解多肽鏈產(chǎn)生的肽段用酸水解、堿水解（針對(duì)色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定；n測(cè)定并計(jì)算出蛋白質(zhì)的氨基酸種類和數(shù)量；用Edman反應(yīng)分析各肽段氨基酸順序；多肽鏈的選擇性降解及肽段的氨基酸組成和順序的測(cè)定第9頁(yè)/共31頁(yè)p獲得的各肽段的氨基酸順序彼此間的交替重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序；確定多肽鏈中二硫鍵的位置。利用酶選擇性降解和溴化氰選擇性降解第10頁(yè)/共31頁(yè)2、多肽鏈氨基酸順序分析 多肽鏈降解必須滿足兩個(gè)條件：n選擇性強(qiáng)、反應(yīng)產(chǎn)率高n主要方法包括酶解法和化學(xué)法第11頁(yè)/共31頁(yè)n某些蛋白水解酶能夠選擇性的水解多肽鏈中

5、的某一類肽鍵；n主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；n糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸；n胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性強(qiáng)酶解法第12頁(yè)/共31頁(yè) 特點(diǎn)：專一性較強(qiáng)，水解速度快 斷裂位點(diǎn)：賴氨酸或精氨酸殘基的羧基參與形成的肽鍵 R1=Lys（賴、K）和Arg（精、R） R2=Pro（抑制）NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶（trypsin）第13頁(yè)/共31頁(yè) 特點(diǎn)：專一性稍弱，Leu、Met和

6、His稍慢 斷裂位點(diǎn)：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵 R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA R2=Pro（抑制） NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關(guān): 酸性：-/堿性：+第14頁(yè)/共31頁(yè) 特點(diǎn)專一性與糜蛋白酶相似，較弱； 斷裂位點(diǎn)：兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸 R1和/或R2Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快 R1=Pro（抑制） pH2.0NHCHC

7、OR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶 Pepsin第15頁(yè)/共31頁(yè)特點(diǎn)：專一性較差斷裂位點(diǎn)：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏水性強(qiáng)氨基酸殘基的羧 基端肽鍵 R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)第16頁(yè)/共31頁(yè)木瓜蛋白酶： 專一性差 斷裂位點(diǎn)：對(duì)Arg和Lys殘基的羧基端肽鍵敏感葡萄球菌蛋白酶： 高專一性 斷裂位點(diǎn)：Glu和Asp殘基的羧基端肽鍵 磷酸緩沖液 Glu殘基的羧基端肽鍵 碳酸氫銨

8、、醋酸銨緩沖液）梭菌蛋白酶： 高專一性 斷裂位點(diǎn)：Arg殘基的羧基端肽鍵第17頁(yè)/共31頁(yè)n溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。化學(xué)法第18頁(yè)/共31頁(yè)-選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內(nèi)酯溴化氰水解法(Cyanogen bromide)第19頁(yè)/共31頁(yè)N末端的測(cè)定二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；異硫氰

9、酸苯脂法（PITC 法）；C末端的測(cè)定羧肽酶法；硼氫化鋰法；肼解法（2）多肽鏈的末端氨基酸測(cè)定第20頁(yè)/共31頁(yè)nN末端測(cè)定方法比較C末端更加成熟、可靠和準(zhǔn)確，主要的方法有：二硝基氟苯法（DNFB法） 肽鏈N末端氨基與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)，生成二硝基苯的衍生物（DNP-肽），其經(jīng)酸水解后生成的DNP-氨基酸可用有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）抽提，再與其他氨基酸分開(kāi)，鑒定得知N末端的氨基酸。N末端的測(cè)定第21頁(yè)/共31頁(yè)二硝基氟苯法(FDNB,DNFB): 1945年Sanger提出此方法。第22頁(yè)/共31頁(yè)n熒光劑二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-chloride, DNS-Cl）可以作為

10、標(biāo)記試劑專一地與肽鏈N末端氨基反應(yīng)生成DNS-肽；n同樣，酸水解后可得DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用層析法鑒定；nDNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)的位置，確定N末端的氨基酸。此方法反應(yīng)原理同DNFB法，但其靈敏度比DNFB法高約100倍，用于層析分析的樣品只需1nmol。二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法） 第23頁(yè)/共31頁(yè)二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光,靈敏性是DNFB法的100倍.第24頁(yè)/共31頁(yè) 基本原理：偶聯(lián)-環(huán)化-轉(zhuǎn)化n異硫氰酸苯酯能與N末端氨基偶聯(lián)生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-肽）異硫氰酸苯酯法（PITC法）第2

11、5頁(yè)/共31頁(yè)n 在酸性溶液中，PTC-肽經(jīng)環(huán)化裂解生成PTC-氨基酸和N末端少一個(gè)氨基酸的剩余多肽，前者可用于N末端氨基酸鑒定，但是該產(chǎn)物不穩(wěn)定，很快進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成3-苯基-2-乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸（PTH-氨基酸）。第26頁(yè)/共31頁(yè)n 生成的PTH-氨基酸非常穩(wěn)定，它在268nm處有強(qiáng)吸收峰。剩余多肽鏈的N末端仍是自由的，可以進(jìn)一步與異硫氰酸苯酯反應(yīng)進(jìn)行第二步降解。這樣就可以從N末端開(kāi)始逐次降解下去，進(jìn)行順序測(cè)定。該方法也稱Edman順序降解，它是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。第27頁(yè)/共31頁(yè)一般說(shuō)來(lái)，C末端測(cè)定較N末端分析的誤差大?？刹捎玫姆椒ㄓ校?羧肽酶法：羧肽酶能特異地水解C末端氨基酸形成的肽鏈，而用于測(cè)定C末端氨基酸。羧肽酶分A、B、C、Y4種，羧肽酶A使用最多，但對(duì)C末端的Pro、Arg、Lys及Hyp不起作用。羧肽酶B，只釋放C末端的Lys和Arg，可以和羧肽酶A互補(bǔ)使用。羧肽酶C的作用范圍寬。但對(duì)C末端的Hyp或連續(xù)幾個(gè)甘氨酸（-Gly-Gly-Gly）無(wú)作用。羧肽酶Y也具很寬的作用范圍。2硼氫化鋰法（LiBH4法，也稱“還原法”）：硼氫化鋰可以與C末端氨基反應(yīng)生成相應(yīng)的-氨基醇，水解后