1、小鼠胰島分離純化及體外功能檢測實驗探作者：宋科瑛王瑞濤盧列盛 董維平李克【摘要】 目的：探討獲得高質(zhì)量小鼠胰島的分離純 化方法，評價其功能。方法：采用膽總管內(nèi)膠原酶灌注膨脹 消化胰腺的方法分離小鼠胰島，不連續(xù)密度梯度離心法純化 胰島，用雙硫腺(dithizone, dtz)對胰島進(jìn)行特異性染色 計算胰島產(chǎn)量及純度，以葡萄糖和茶堿刺激胰島素釋放檢測 胰島功能。結(jié)果：胰島的產(chǎn)量和活性主要與胰腺均勻膨脹和 膠原酶的消化時間有關(guān)。平均每個小鼠胰腺能得到150250 個高質(zhì)量胰島，活性&gt；95%,純度&gt；90%o葡萄糖及茶堿 (carbachol, cch)刺激后胰島素釋放量明顯

2、增加。結(jié)論: 改良的膽總管內(nèi)膠原酶灌注膨脹消化小鼠胰腺及不連續(xù)密 度梯度ficoll-400純化胰島的方法，可獲得產(chǎn)量較高、純 度及功能較好的胰島?！娟P(guān)鍵詞】胰島分離純化小鼠isolation ,purification and functionalassessment of islets in miceabstract objective： the technical difficulty in mouse islets isolation and purification restricts its wide use in diabetes and islet transplantatio

3、n field here we reported and discussed a modified method with which to isolate and purify high quality islets in mice methods: intraductal collagenase-p perfusion and uniform distention of the gland were applied to digest mice pancreas a ficoll gradient solution (25%, 23%, 20%, and 11%) was applied

4、to make the purifica.tiori. islets were then tested for their specificity by dithiozine (dtz) staining the islet function was assessed by the glucose- and carbachol-stimulated insulin secretion test results： the yield and viability of the islets were closely associated with good gland distention and

5、 collagenase digestion timing. we used the method discussed here, each mouse pancreas could yield 150250 islets, with viability &gt；95% and purity &gt；90%. the insulin release from the in vitro islets fed with high concentration glucose and carbachol stimuli raised to a significantly higher

6、level conclusion： the above-mentioned method of mice isolation and purification might yield high quality islets for further scientific use【keywords】islets isolation purification mice胰島移植被認(rèn)為是有望治愈胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus)的新型治療方 法。小鼠品系純正，可重復(fù)性好，可進(jìn)行基因調(diào)控，自身繁 殖力強(qiáng)，可縮短科研周期，已在國外胰島移植和糖尿病研究

7、 領(lǐng)域，尤其是基因治療領(lǐng)域，得到越來越廣泛的應(yīng)用1- 5 o但由于小鼠體積小，胰腺相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)細(xì)微，胰島的 分離純化操作有一定的難度。本研究參考學(xué)術(shù)交流中獲得的 紐約西奈山醫(yī)學(xué)院和美國康奈爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院的小鼠胰島分 離純化方案，結(jié)合國內(nèi)實驗條件，對小鼠胰島的分離、純化、 培養(yǎng)作了改進(jìn)。體外功能檢測證實，該方法分離純化的小鼠 胰島可用于胰島移植的相關(guān)后續(xù)研究。1材料與方法1. 1材料812周齡的雄性c57bl/6小鼠，購自中國科 學(xué)院上海實驗動物中心，在清潔環(huán)境下喂養(yǎng)。nagashima no. 5304型手術(shù)顯微鏡由日本永島醫(yī)療器械株式會社制造。膠 原酶-p為roche公司產(chǎn)品，ficoll-4

8、00為pharmacia公司 產(chǎn)品，超靈敏胰島素elisa試劑盒購自crystal chemical公 司，dna酶i購自sigma公司，rpmi 1640培養(yǎng)基、小牛血 清和胎牛血清由gibc0公司提供。1.2方法1. 2. 1分離液和消化液的配制分離液(dissociationbuffer)的配制：hanks 液 500 ml 加入 50 mg dna 酶 i 和 12. 5 ml、1 mol/l 餐乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid, hepes),0.22 u m 孑l徑濾膜過濾，調(diào)節(jié)ph值至7.27.4,4 

9、6;c保存。消化液的配置臨用時新鮮配置，采用分離液溶解膠原酶-p,濃度為1mg/mlo1.2.2 ficoll-400濃度梯度溶液的配制 ficoll-400 108 g,加324 ml分離液，配成25% ficoll-400溶液；充 分混勻后量取25% ficoll-400溶液91. 20 ml用分離液定容 到 100 ml,配成 23% ficoll-400 溶液；取 23% ficoll-400 溶液80. 52 ml分離液定容到100 ml,配成20% ficoll-400 溶液；取20% ficoll-400 44. 12 ml用分離液定容到100 ml, 配成11% ficoll-

10、400溶液。全部配制完成后0.22 um孔徑 濾膜過濾，液體ph值均調(diào)至7. 27. 4,4 °c保存。1.2.3小鼠胰島的分離1%戊巴比妥鈉按照40 mg/kg 劑量對小鼠行腹腔注射麻醉。75%乙醇消毒皮膚，打開腹腔,肝臟外展暴露胰腺及膽總管,在膽總管進(jìn)入十二指腸處將其夾閉。按每個胰腺5 ml配制膠原酶-p溶液(1 g/l, 4 °c), 置于50 ml離心試管中備用。體視顯微鏡下采用30 g規(guī)格針頭穿刺膽總管，緩慢注入膠原酶-p溶液23 ml,使溶液逆行進(jìn)入胰腺導(dǎo)管，均勻膨脹胰腺。剪心放血處死小鼠。剪 除胃與橫結(jié)腸之間的大網(wǎng)膜及脾臟，沿十二指腸邊緣自十二 指腸向小腸方向

11、剝離胰腺組織。剩余部分沿胰腺邊緣完整取 出，所取組織置于備好的50ml離心試管中，4 °c保存。37£ 水浴靜止消化1020 min,振蕩使其呈細(xì)砂狀，加入4 £含 10%小牛血清的hanks液至50 ml,終止消化，35目不銹鋼 濾網(wǎng)（孔徑400 u m）過濾，1 000 r/min離心2 min,棄去 上清，4 °c、1%小牛血清的hanks液清洗離心2遍，收集 沉淀。1.2.4胰島的純化 將分離的胰腺組織沉淀混懸于10 ml、25%的ficoll-400溶液中，依次加入23%、20%和11%的 ficoll-400 溶液各 5 ml, 1 500

12、r/min 水平離心 20 min （或 1 800 r/min水平離心15 min）,采用5 ml 一次性吸管收集 20%11%界面上的細(xì)胞層，此層一般含有大量的胰島；同時 保留23%20%界面細(xì)胞層（在胰腺組織消化不完全的情況 下，胰島可能存留于該層面，可在確認(rèn)胰島存在20%11%界 面后棄置）。含10%小牛血清hanks液洗滌1次，1%小牛血 清hanks液洗滌2次。每次洗滌后1 000 r/min離心1 min 保留沉淀。沉淀懸浮于六孔板中，倒置顯微鏡下觀察胰島的 產(chǎn)量及質(zhì)量。10卩1移液器吸取形態(tài)完整的胰島至另外的含 10%胎牛血清的rpmi 1640培養(yǎng)基的孔中，置于37 

13、6;c、5% co2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，備試驗。1.2.5胰島活性鑒定和特異性染色 以臺盼藍(lán)染色判斷 胰島細(xì)胞活性，死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞不著色。用 雙硫腺（dithizone, dtz）對胰島細(xì)胞進(jìn)行特異性染色，倒 置顯微鏡下胰島細(xì)胞為猩紅色，非胰島細(xì)胞不著色，計算胰 島產(chǎn)量及純度（計數(shù)視野內(nèi)染色細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目及未染色細(xì)胞 團(tuán)數(shù)目）。1.2.6體外胰島素釋放實驗 新鮮游離的胰島經(jīng)過夜培 養(yǎng)短暫的自我修復(fù)后應(yīng)用于本研究。實驗前，所有胰島均在 37 9、5% c02培養(yǎng)箱中孵育60 min,使胰島適應(yīng)實驗用培 養(yǎng)基的改變。顯微鏡下仔細(xì)選取包膜完整、形態(tài)正常的胰島 用于功能檢測。24孔培養(yǎng)板中每

14、孔加入1 ml rpmi 1640培 養(yǎng)液、10個胰島和不同濃度的葡萄糖和茶堿，分為低糖（葡 萄糖3 mmol/l）.高糖（葡萄糖20 mmol/l）,低糖茶堿（葡 萄糖3 mmol/l加茶堿10 mmol/l）,高糖茶堿（葡萄糖10 mmol/l加茶堿10 mmol/l） 4組，每組至少4孔。作用60 min 后吸取上清檢測胰島素水平。1. 3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用excel軟件t檢驗統(tǒng)計學(xué)方法 進(jìn)行處理，pw0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果分離純化的小鼠胰島雜質(zhì)少，外膜完整，形態(tài)正常。 倒置顯微鏡下觀察，胰島細(xì)胞團(tuán)呈圓形或卵圓形，大小不一 （圖1）。臺盼藍(lán)染色顯示，細(xì)胞存活率&gt；9

15、5%o dtz染色 顯示絕大部分細(xì)胞呈特征性紅染，獲取的胰島純度>90%, 每個小鼠的胰腺可以獲得400個左右胰島，其中150250個 高質(zhì)量的胰島可用于體外功能檢測實驗。體外胰島素釋放實驗結(jié)果顯示，低糖組胰島素釋放 量為(0. 435±0. 175) ng/islet,高糖組胰島素釋放量明 顯增加，達(dá)到(1.866±0. 321) ng/islet；茶堿能夠增強(qiáng)胰 島素釋放，低糖茶堿組胰島素釋放量為(0. 880±0. 150) ng/islet,高糖茶堿組胰島素釋放量達(dá)到(2. 728±1.399) ng/isleto4組間兩兩比較，差

16、異均有統(tǒng)計學(xué)意義,p&lt； 0. 01 (圖 2)o3討論胰島移植是一種治療胰島素依賴型糖尿病的新型手 段，胰島的體外分離、純化培養(yǎng)是有效治療的前提和關(guān)鍵。 標(biāo)準(zhǔn)組織切碎消化技術(shù)(切碎法)在1965年由moskalevski 首創(chuàng),隨后被lacy和kostianovsky改良6。但是此方法 很大程度上依賴操作技術(shù)，缺乏一致性，而且對胰島的破壞 較大。據(jù)文獻(xiàn)報道，應(yīng)用切碎法，供體胰腺中至多保留50% 的胰島7o 1996年，shapiro提出了 一種改良型靜止消化 技術(shù)，并將其與標(biāo)準(zhǔn)化組織切碎消化技術(shù)進(jìn)行了嚴(yán)格的雙盲 比較，結(jié)果顯示膽總管內(nèi)膠原酶注射靜止法胰島產(chǎn)量高出切 碎法47.5%

17、,且胰島功能保留方面亦優(yōu)于切碎法8。隨著分離純化技術(shù)不斷成熟，胰島移植實驗研究及 臨床應(yīng)用得到了飛速發(fā)展，然而胰島移植療效并不十分滿 意。除了與移植后誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)和免疫抑制劑損傷有關(guān) 外，移植前的體外培養(yǎng)、移植后微環(huán)境改變以及炎癥因子的 釋放等均能促進(jìn)移植的胰島細(xì)胞凋亡?；蛑委熂夹g(shù)發(fā)展使 基因治療改良胰島移植受到廣泛關(guān)注。胰島移植作為一種組 織移植，可以安全方便地在體外進(jìn)行基因修飾，從而降低免 疫排斥，提高移植胰島的存活率，減少細(xì)胞凋亡。制作轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠已經(jīng)成為成熟的技術(shù)， 在移植免疫領(lǐng)域的基因治療方面有廣泛的應(yīng)用。然而由于小 鼠體積小，胰腺及導(dǎo)管系統(tǒng)細(xì)微，胰島的提取需要在解剖顯

18、 微鏡下進(jìn)行精細(xì)操作，限制了其在實驗研究的應(yīng)用。膽總管穿刺灌注使小鼠胰腺完全充分?jǐn)U張是獲得髙 質(zhì)量胰島的關(guān)鍵，實驗發(fā)現(xiàn)未擴(kuò)張的胰腺組織中分離胰島的 產(chǎn)量明顯減少。操作過程應(yīng)輕柔，防止膽總管痙攣。有學(xué)者 提出從小鼠膽囊穿刺灌注9,但因為小鼠膽道系統(tǒng)變異較 多，有時膽囊管開口較低，夾閉膽總管時可能同時夾閉膽囊 管開口，膠原酶溶液無法逆行至胰腺；小鼠膽囊頸較為狹窄 彎曲，灌注時無法達(dá)到有效的壓力，胰腺充盈并不理想。分 離胰腺時，預(yù)先將脂肪雜質(zhì)多的網(wǎng)膜組織棄除，完整剝離胰 腺也是提高胰島產(chǎn)量和質(zhì)量的重要步驟。選擇合適的酶濃度并控制消化時間非常重要。由于 實驗室實驗條件不同、實驗動物的個體差異和膠原酶類

19、型的 不同，最佳消化時間也不相同。消化時間過短，胰島未能從 外分泌腺泡中釋放出來；消化時間過長，胰島易破碎，活性 受損，且常形成一種黏稠的膠狀物(主要是脂肪組織所致), 影響胰島分離。本實驗采用roche公司生產(chǎn)的膠原酶-p,在 1 mg/ml濃度下，消化1020 min能獲得最大產(chǎn)量且純度高 的胰島。純化過程中的每一步預(yù)先用含血清的培養(yǎng)液濕潤瓶 壁，可以有效的防止胰島貼壁，增加最終的胰島產(chǎn)量。經(jīng)清 洗純化后，雖然可以直接采用11%遼0%界面細(xì)胞層作為胰島 進(jìn)行培養(yǎng)，但是此層內(nèi)仍然存在部分外分泌腺細(xì)胞，外分泌 腺的消化作用對胰島的消化損傷較重。為此推薦使用移液器 再次手工挑揀的方法，由此獲得的

20、胰島外膜完整，邊界光滑, 結(jié)構(gòu)致密，產(chǎn)量也較多。用移液器挑選胰島時先用10%小牛 血清濕潤一下槍頭，以減少胰島附著和損傷。經(jīng)體外功能測定，本實驗方法純化分離的小鼠胰島, 能夠感受葡萄糖濃度的變化和茶堿的刺激，調(diào)整胰島素的釋 放，接近正常胰島功能，完全可以用于后續(xù)實驗?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 plum l, wunderlich ft, baud 1 er s, et al. transgenic and knockout mice in diabetes research： novel insights into pathophysiology, limitations, and perspectiv

21、esj. physiology ( bethesda ) ,2005,20(6) ：152-161.2 smith sj, zhang h, clermont ao, et al. in vivo monitoring of pancreatic beta-cells in a transgenic mouse modelj. mol imaging, 2006, 5 (2) :65-753 nyqvist d , mattsson g , kohler m , et al. pancreatic islet function in a transgenic mouse expressing fluorescent proteinj j endoerinol, 2005,186 (2) ：333-341