1、第三代測序技術（單分子實時dna測序）與第二代測序技術（高通量測序技術）簡介第三代測序技術簡介 如果有人告訴你用顯微鏡實時觀測單分子dna聚合酶復制dna，并用它來測序，你一定會認為他異想天開，沒有一點生物的sense。我最初就是這樣認為的，然而它不僅可以實現(xiàn)，而且已經實現(xiàn)了！這個就是被稱為第三代的測序技術，pacific biosciences公司推出的“single molecule real time (smrt) dna sequencing”（單分子實時dna測序）。我有幸在nih聽到了這個技術發(fā)明人stephen turner博士的講座，根據自己粗淺的理解記錄整理一下。要實現(xiàn)單分子

2、實時測序，有三個關鍵的技術。第一個是熒光標記的脫氧核苷酸。顯微鏡現(xiàn)在再厲害，也不可能真的實時看到“單分子”。但是它可以實時記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入dna鏈的時候，它的熒光就同時能在dna鏈上探測到。當它與dna鏈形成化學鍵的時候，它的熒光基團就被dna聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記的脫氧核苷酸不會影響dna聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的dna鏈和天然的dna鏈完全一樣。第二個是納米微孔。因為在顯微鏡實時記錄dna鏈上的熒光的時候，dna鏈周圍的眾多的熒光標記的脫氧核苷酸形成了非常強大的熒光背景。這種強大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。pacifi

3、c biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔zero-mode waveguides (zmws)，單分子的dna聚合酶被固定在這個孔內。在這么小的孔內，dna鏈周圍的熒光標記的脫氧核苷酸有限，而且由于a，t，c，g這四種熒光標記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進入到孔內又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當某一種熒光標記的脫氧核苷酸被摻入到dna鏈時，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時間，直到新的化學鍵形成，熒光基團被dna聚合酶切除為止（見圖）。第三個是共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時進行記錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而pacific

4、biosciences公司又沒有非常強調在這方面的發(fā)明，不做進一步探討。他們還對這一技術進行進一步的優(yōu)化。第一個是把雙鏈dna環(huán)化反復測序。人們可以在雙鏈dna的兩頭連上發(fā)夾結構的dna adaptor，從而使dna環(huán)化。而dna聚合酶就能夠以環(huán)化的dna作為模板滾環(huán)復制，反復測一段dna序列。這種反復測序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復制錯誤，從而使測序精度非常高。第二個是激發(fā)光中斷測序法。dna聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強大的激發(fā)光作用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光中斷一段時間，在這段時間內dna聚合酶繼續(xù)復制dna，當激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測到長dna鏈后面的序列。第三代測序技術非?？膳?。

5、1、它實現(xiàn)了dna聚合酶內在自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學法測序的2萬倍。2、它實現(xiàn)了dna聚合酶內在自身的processivity（延續(xù)性，也就是dna聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達到99.9999%。此外，它還有兩個應用是二代測序所不具備的。第一個是直接測rna的序列。既然dna聚合酶能夠實時觀測，那么以rna為模板復制dna的逆轉錄酶也同樣可以。rna的直接測序，將大大降低體外逆轉錄產生的系統(tǒng)誤差。

6、第二個是直接測甲基化的dna序列。實際上dna聚合酶復制a、t、c、g的速度是不一樣的。正常的c或者甲基化的c為模板，dna聚合酶停頓的時間不同。根據這個不同的時間，可以判斷模板的c是否甲基化。pacific biosciences公司預計2010年或者2011年就會推出商業(yè)化的測序儀器。在不遠的將來，如果他們能和二代測序一樣集成100萬個納米微孔，那么一臺儀器15分鐘就能夠準確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組測序成本將變成100美元，人人都可以消費得起。想想人類基因組計劃耗資30億美元，費時十幾年，無數(shù)科學家參與其中，技術的革新意義是多么重大??！高通量測序技術第二代測序技術 高通量測

7、序技術是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條dna分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。自從2005年454lifesciences公司（2007年該公司被roche正式收購）推出了454flx焦磷酸測序平臺（454flxpyrosequencingplatform）以來，曾推出過3730xldna測序儀（3730xldnaanalyzer）的applied bi

8、osystem（abi）這家一直占據著測序市場最大份額的公司的領先地位就開始動搖了，因為他們的拳頭產品毛細管陣列電泳測序儀系列（seriescapillaryarrayelectrophoresissequencingmachines）遇到了兩個強有力的競爭對手，一個就是羅氏公司(roche)的454 測序儀(roch gs flx sequencer)，另一個就是2006年美國illumina公司推出的solexa基因組分析平臺（genomeanalyzer platform），為此，2007年abi公司推出了自主研發(fā)的solid 測序儀(abi solid sequencer)。這三個測序

9、平臺即為目前高通量測序平臺的代表。（見表一）公司名稱技術原理技術開發(fā)者商業(yè)模式apply biosystems(abi)基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接dna測序法美國agencourt私人基因組學公司（apg）上市公司：銷售設備和試劑獲取利潤illumina合成測序法英國solexa公司首席科學家david bentley上市公司：銷售設備和試劑獲取利潤roche大規(guī)模并行焦磷酸合成測序法美國454 life sciences公司的創(chuàng)始人jonathan rothberg上市公司：銷售設備和試劑獲取利潤helicos大規(guī)模并行單分子合成測序法美國斯坦福大學生物工程學家stephen quake上

10、市公司：2007年5月首次公開募股（ipo）complete genomicsdna納米陣列與組合探針錨定連接測序法美國complete genomics公司首席科學家radoje drmanac私人公司：投資額為4650萬美元表一：主流測序平臺一覽這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對于傳統(tǒng)測序的96道毛細管測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到400萬條序列。讀取長度根據平臺不同從25bp到450bp，不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取1g到14g不等的堿基數(shù)，這樣龐大的測序能力是傳統(tǒng)測序儀所不能比擬的。盡管如此，在這項新的劃時代的測序技術剛出現(xiàn)的時候，科學界對這項新技術卻并不熱衷。

11、許多習慣用桑格技術的科學家懷疑新技術的準確度、閱讀能力、成本消費、實用性。代理sanger型測序硬件的經銷商害怕其投資失敗而首先提出了這些懷疑。圖一：在芯片上進行的測序：illumina測序平臺然而大多數(shù)人卻忽略了一個事實，即桑格技術的普及最初也遇到同樣的阻礙。桑格技術剛開發(fā)出來時，閱讀能力很難超過25bp，即使在fred sanger雙脫氧終止法發(fā)明后也只達到80bp，如今卻達到了750bp；而新發(fā)展的合成測序技術，應用焦磷酸測序方法，其閱讀能力最初只有100bp，推向市場16個月后增加至250bp，隨著技術的不斷完善，目前已達到了400bp，很快就接近桑格技術目前的水平。除了閱讀能力外，能

12、否以有限的成本用一臺儀器產生足夠數(shù)量的序列標記也是另一個需要改善的重要問題。這個問題已經被roche公司解決了，應用他們的系統(tǒng)，僅花費閱讀35bp或者更小片段的成本就能產生比35bp多10倍的序列標記。 圖二：gs flx 高通量測序方法原理示意圖 一、高通量測序的應用高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構建這一實驗步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差。 依靠后期強大的生物信息學分析能力，對照一個參比基因組(reference genome)高通量測序技術可以非常輕松完成基因組重測序(re-sequence)，2007年van orsouw等人結合改進的aflp 技術和454 測序技術對玉米基因組進

13、行了重測序，該重測序實驗發(fā)現(xiàn)的超過75%的snp位點能夠用snpwave技術驗證，提供了一條對復雜基因組特別是含有高度重復序列的植物基因組進行多態(tài)性分析的技術路線。2008年hillier對線蟲cb4858 品系進行solexa重測序，尋找線蟲基因組中的snp位點和單位點的缺失或擴增。但是也應該看到，由于高通量測序讀取長度的限制，使其在對未知基因組進行從頭測序(novo sequencing)的應用受到限制，這部分工作仍然需要傳統(tǒng)測序(讀取長度達到850 堿基)的協(xié)助。但是這并不影響高通量測序技術在全基因組mrna表達譜，microrna表達譜，chip-chip以及dna甲基化等方面的應用。

14、2008年mortazavi等人對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進行了rna 深度測序，這項工作展示了深度測序在轉錄組研究上的兩大進展，表達計數(shù)和序列分析。對測得的每條序列進行計數(shù)獲得每個特定轉錄本的表達量，是一種數(shù)碼化的表達譜檢測，能檢測到豐度非常低的轉錄本。分析測得的序列，有大于90%的數(shù)據顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過數(shù)據分析展示的是從未被報道過的rna剪切形式，3端非翻譯區(qū)，變動的啟動子區(qū)域以及潛在的小rna 前體，發(fā)現(xiàn)至少有3500個基因擁有不止一種剪切形式。而這些信息無論使用芯片技術還是sage文庫測序都是無法被發(fā)現(xiàn)的。高通量測序另一個被廣泛應用的領域是小分子rn

15、a或非編碼rna(ncrna)研究。測序方法能輕易的解決芯片技術在檢測小分子時遇到的技術難題(短序列，高度同源)， 而且小分子rna的短序列正好配合了高通量測序的長度，使得數(shù)據“不浪費”，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子rna。在衣藻、斑馬魚、果蠅、線蟲、人和黑猩猩中都已經成功地找到了新的小分子rna。在線蟲中獲得了40 萬個序列，通過分析發(fā)現(xiàn)了18個新的小rna分子和一類全新的小分子rna。在dna蛋白質相互作用的研究上，染色質免疫沉淀深度測序(chip-seq)實驗也展示了其非常大的潛力。染色質免疫沉淀以后的dna 直接進行測序，對比ref seq可以直接獲得蛋白與dna結合的位點信

16、息，相比chip-chip，chip-seq可以檢測更小的結合區(qū)段、未知的結合位點、結合位點內的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。 圖三: independent flow cells（solidtm system）二、高通量測序的前景目前，大多分析家都無法相信新一代測序技術能完全取代目前的芯片測序技術。不過，有些分析家也的確認為芯片測序技術正面臨著挑戰(zhàn)，他們認為到了2012年新一代的測序技術將會帶來高達2。15億美元的產值。2006年，整個芯片測序市場大概價值8億美元，其中65%的市場份額都是有關基因表達譜分析產品的，剩下35%的市場份額則由基因型分析芯片占據。不過美國哈佛大學（harvard

17、university）遺傳學教授george church認為，這部分市場也會受到新一代測序技術的沖擊。重測序芯片（resequencingarrays）、單核苷酸多態(tài)性分析芯片以及基因拷貝數(shù)目變異分析芯（copynumbervariantarray）市場也會受到影響。也有分析家不贊同這個觀點，他們認為即使新一代測序技術很便宜，還是有不少人會選擇傳統(tǒng)的測序儀的。新一代測序技術相對傳統(tǒng)芯片測序技術的優(yōu)勢，最終還得依靠廣告和市場營銷手段的推廣才能獲得大眾的認可。去年夏天，由frost&sullivan公司對學術科研機構和私人研究團體進行的一項調查研究結果表明，在實際應用領域，例如進行表達譜分析時，

18、人們還是傾向于選擇傳統(tǒng)的芯片產品，而并非青睞新一代的測序產品。新一代測序儀推廣困難可能由其價格昂貴導致。平均采購一臺新一代測序儀大約要花費50萬美元，除非該實驗室測序的工作量非常大，否則是不會考慮購買的。即使像polonator這樣的新一代測序儀也需要花費15萬美元左右，這筆費用對于一個小實驗室來說是無法承受的。這時，只需要150美元一塊的芯片就非常有競爭力了。以基因芯片產品享譽業(yè)界的美國affymetrix公司市場部副總裁jay kaufman認為，新一代測序技術對于芯片市場來說的確會帶來一定的沖擊，不過要完全取代表達譜分析芯片還需要一定的時間。但是，基因芯片也有其自身的缺點，就在于它是一個

19、“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)。而高通量測序的強項， 就在于它是一個“開放系統(tǒng)”， 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質上高于芯片技術。 研究者可以充分享受這兩個平臺的比較優(yōu)勢，在獲取新信息的基礎上，利用芯片的強項， 即對已知信息的高通量、低成本(相對)的檢測能力， 對大量樣品進行快速檢測，短時間內獲得有大量有效的數(shù)據。作為兩個高通量的基因組學研究技術，在應用的某些方面存在重疊和競爭，但是在更多方面是優(yōu)勢互補，兩種方法聯(lián)合使用，將解決以前的單種技術難以解決的問題。三、結語新一代測序已顯示出巨大的潛力。也正是因為科學的不斷進步，在給測序技術提出新要求的時候，也給這

20、項技術帶來了新的增長點：2008年4月helico bioscience公司的timothy等人在science上報道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術，也被稱為第三代測序技術，并利用該技術對一個m13病毒基因組進行重測序。這項技術之所以被稱為真正的單分子測序，是因為它完全跨過了上述3種高通量測序依賴的基于pcr擴增的信號放大過程，真正達到了讀取單個熒光分子的能力，向1000美元測定一個人類基因組的目標邁出了一大步?；诎雽w技術的納米孔測序技術技術在新型測序技術中的重要作用。新一代測序技術，即第三代測序技術，不同于前兩代測序，第一代測序技術是雙脫氧鏈末端終止法根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機

21、在某一個特定的堿基處終止，產生a，t，c，g四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的page膠上電泳進行檢測，從而獲得dna序列。第二代測序技術是焦磷酸測序法由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，適于對已知的短序列的測序分析。而第三代測序技術則是基于納米孔的單分子讀取技術，這種方法讀取數(shù)據更快、有望大大降低測序成本，改變個人醫(yī)療的前景。這一技術的研發(fā)是系統(tǒng)工程，涉及生物、半導體、計算機、化學、光學等多個領域，需要不同學科頂尖力量的合作。science文章重點提到了其中的半導體技術，離子激流公司（ion torrent）的測序儀就是一種硅芯片，是利用與半導體一樣的方式構建的，利用這種技術，科學家們在science雜志上公布了三個低成本的完整人類基因組序列。這種高質量，低成本（文章還報道了不同樣本的測序成本，包括了從$8,005（87x coverage）到$1,726（45x coverage）的范圍）的基因組測序方法能幫助研究人員對成千上百個某種疾病患者的完整基因組序列進行分析，從而獲得對這種疾病的深入了解，最終找出預防和治療的方法。基于半導體技術的納米孔測序技術，dna分子依靠被稱為核酸外切酶的蛋白質以一次一個堿基的速度通過