1、第五章第五章 酶分子的化學(xué)修飾酶分子的化學(xué)修飾酶的修飾共價修飾非共價修飾化學(xué)修飾遺傳修飾酶的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾：在體外將酶分子通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。從廣義上說，凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，都可稱為酶的化學(xué)修飾。 意義：意義：1.基礎(chǔ)酶學(xué)的研究基礎(chǔ)酶學(xué)的研究；活性部位的研究 一級結(jié)構(gòu)的測定 測定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 2.2.提高生物活性；提高生物活性；3.3.增強穩(wěn)定性；增強穩(wěn)定性；4.4.產(chǎn)生新的催化能力產(chǎn)生新的催化能力; ;5.5.解除免疫原性；解除免疫原性；第一節(jié)酶分子的修飾方法第一節(jié)酶分子的修飾方法一、酶的表面修飾一、酶的

2、表面修飾酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巰基、羥基、咪唑基等（一）小分子修飾：（一）小分子修飾：常用的小分子化合物主要：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、鄰苯二酸酐、乙酸-N-丁二酯亞胺酯等例： - 胰 凝 乳 蛋 白 酶 表 面 的 氨 基 修 飾 一NHCH2COOH后，穩(wěn)定性在60可提高1000倍。馬肝醇脫氫酶的賴氨酸的乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，同時酶穩(wěn)定性也提高許多，底物專一性也有所改變。（二）大分子修飾（二）大分子修飾 可溶性大分子：如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、右旋糖苷、環(huán)糊精、肝素等。例：PEG修飾的L-天冬酰胺酶免疫原性顯著

3、降低、半衰期延長。天然過氧化氫酶在6h內(nèi)很快從血液中被去，PEG修飾后，酶活力在血液循環(huán)中可保持72h右旋糖苷修飾-淀粉酶：60,t1/2：3.5min；修飾后：175 minMPEG修飾過氧化氫酶，三氯乙烷中酶活是原來的200倍。（三）交聯(lián)修飾（三）交聯(lián)修飾使用雙功能或多功能試劑將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分間進(jìn)行共價交聯(lián)。（四）固定化修飾（四）固定化修飾例：枯草桿菌蛋白酶交聯(lián)酶晶體，其酶活提高13倍。葡聚糖二乙醛交聯(lián)青霉素G酰化酶，55下的半衰期提高9倍。絲氨酸氨白酶、胰蛋白酶通過交聯(lián)修飾，最適溫度從45提高到76。 小分子修飾小分子修飾：穩(wěn)定性增加及一定催化特性的改變。大

4、分子修飾大分子修飾：穩(wěn)定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性與抗原性降低、延長半衰期。交聯(lián)修飾交聯(lián)修飾：提高其穩(wěn)定性，增加酶在非水溶液中的使用價值。 二、酶分子的內(nèi)部修飾二、酶分子的內(nèi)部修飾（一）催化活性基團(tuán)的修飾（一）催化活性基團(tuán)的修飾 產(chǎn)生新的催化能力硫代烷基化反應(yīng)，枯草桿菌蛋白酶活性部位的Ser轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，對肽或酯無水解能力，但能水解硝基苯酯?；瘜W(xué)突變：將一種氨基酸側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化為另一種新的氨基酸側(cè)鏈的方法。（二）非催化活性基團(tuán)的修飾（二）非催化活性基團(tuán)的修飾改變酶的動力學(xué)特征、影響酶的專一性。胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亞砜，該酶對含芳香族或大體積脂肪族的專一性底物的Km提

5、高2-3倍。（三）（三） 蛋白質(zhì)主鏈的修飾蛋白質(zhì)主鏈的修飾依靠酶法，水解部分酶片斷。天冬氨酸酶有限水解切去10個氨基酸后，酶活提高5.5倍 （四）（四） 與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子相關(guān)的修飾 1依賴輔助因子的酶依賴輔助因子的酶 輔因子共價結(jié)合在酶上； NADH共價結(jié)合到醇脫氫酶，活力為原來的40%,但解決了輔因子循環(huán)利用的問題。 引入新的輔因子或?qū)o助因子進(jìn)行修飾。例：黃素共價結(jié)合在木瓜蛋白酶上，從而將蛋白酶轉(zhuǎn)變成氧化原酶。 修飾輔助因子，可創(chuàng)造出多種多樣的新酶。2.金屬酶中的金屬取代金屬酶中的金屬取代酶分子中的金屬取代可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。例：?；被崴饷富钚圆课恢械匿\

6、被鈷取代后，酶的底物專一性和最適pH都有改變。第二節(jié)第二節(jié) 酶蛋白側(cè)鏈的小分子修飾酶蛋白側(cè)鏈的小分子修飾一、巰基的化學(xué)修飾一、巰基的化學(xué)修飾烷基化試劑：有鹵代乙酸、芳香鹵、芳香族磺酸。常用的有碘代乙酸碘代乙酸和碘乙酰胺、巰基乙醇碘乙酰胺、巰基乙醇。有機汞試劑：對氯汞苯甲酸對氯汞苯甲酸(pCMB) 專一性最強，修飾產(chǎn)物在250nm處有最大吸收。 5，5-二硫代-雙（2-硝基苯甲酸）（）（DTNB）(Ellman 試劑) ，反應(yīng)生成的陰離子在412nm處有最大吸收。定量酶分子中巰基數(shù)目最常用的試劑。N-乙基馬來酰亞胺(NEM)：反應(yīng)專一性很強的疏基修飾劑，反應(yīng)產(chǎn)物在300 nm處有最大吸收。二、氨

7、基的化學(xué)修飾二、氨基的化學(xué)修飾烷基化試劑： 碘代乙酸碘代乙酸 三硝基苯磺酸（TNBS）：與賴氨酸殘基反應(yīng)，420nm，367nm能產(chǎn)生特定的光吸收。磷酸毗哆醛(PLP)是一種非常專一的賴氨酸修飾試劑，反應(yīng)可通過325nm處光吸收定量。2,4-二硝基氟苯（DNFB）法(又稱sanger試劑)；丹磺酞氯(DNS)法；苯異硫氰酸酯(PITC)法。 用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化學(xué)修飾方法。 三、羧基的化學(xué)修飾三、羧基的化學(xué)修飾水溶性的碳二亞胺碳二亞胺類特定修飾酶的羧基已成為最普通的標(biāo)準(zhǔn)方法，在一定條件下，絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反應(yīng)。四、咪唑基的化學(xué)修飾四、咪唑基的化學(xué)修飾焦碳酸二乙酯(DP

8、C)和碘代乙酸碘代乙酸。 DPC對組氨酸殘基有較好的專一性，產(chǎn)物在240nm處有最大吸收，可跟蹤反應(yīng)和定量。DPC還可能修飾巰基，用連四硫酸鈉或連四硫酸鉀對巰基進(jìn)行可逆地保護(hù)。五、吲哚基的化學(xué)修飾五、吲哚基的化學(xué)修飾N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)：產(chǎn)物可通過280 nm處光吸收的減少跟蹤反應(yīng)。2-羥基-5-硝基芐溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯對吲哚基修飾比較專一。但易與巰基作用，修飾時應(yīng)對巰基進(jìn)行保護(hù)。 六、二硫鍵的化學(xué)修飾六、二硫鍵的化學(xué)修飾二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇（DTT）巰基乙醇巰基乙醇 七、酚基的化學(xué)修飾七、酚基的化學(xué)修飾四硝基甲烷（TNM）：）：最常用的具高度專一性酪氨酸殘基的修飾劑。蘇氨

9、酸和絲氨酸殘基：一般都可被修飾酚羥基的修飾試劑所修飾；二異丙基氟磷酸（DFP）對絲氨酸有高度反應(yīng)性。 八、胍基的化學(xué)修飾八、胍基的化學(xué)修飾常用丁二酮、丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛環(huán)己二酮、苯乙二醛。4-羥基-3-硝基苯乙二醛（405nm）對硝基苯乙二醛（340nm）具有光吸收性質(zhì)，并且產(chǎn)物具有旋光性，特別適合于精氨酸的定量?；瘜W(xué)修飾反應(yīng)的類型化學(xué)修飾反應(yīng)的類型 1) 1) 烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)試劑特點：試劑特點：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（親核基團(tuán)（如如NH2，-SH等）發(fā)生烷基化。等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：可作用基團(tuán)：氨基氨基（Lys，Arg

10、），巰基（），巰基（Cys），羧基（），羧基（Asp、Glu），甲硫基（），甲硫基（Met），咪唑基（），咪唑基（His）。修飾劑：修飾劑：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺胺等。等。 烷基化反應(yīng) 2) 2) 酰基化反應(yīng)?；磻?yīng)試劑特點：試劑特點：含有含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?。團(tuán)，使之?；？勺饔没鶊F(tuán)：可作用基團(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥），酚羥基（基（Tyr） ?；磻?yīng)?；磻?yīng) 3) 3) 氧化和還原反應(yīng)氧化和還原反應(yīng)試劑特點：具有氧化性或還原性。試劑特點：具

11、有氧化性或還原性。氧化劑：氧化劑：H H2 2O O2 2可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán):巰基，甲硫基，等。巰基，甲硫基，等。還原劑：還原劑：2 2巰基乙醇、巰基乙醇、DTTDTT等。等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。氨基酸氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑修飾劑LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亞胺水溶性碳化二亞胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2環(huán)己二酮、丁二酮環(huán)己二酮、丁二酮Cys

12、Cys巰基巰基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基馬來酰亞胺乙基馬來酰亞胺二硫鍵二硫鍵巰基乙醇、巰基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羥基酚羥基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑第三節(jié)第三節(jié) 酶蛋白側(cè)鏈的大分子修飾酶蛋白側(cè)鏈的大分子修飾 常用修飾劑：聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、環(huán)糊精、蔗糖聚合物(Ficoll)、肝素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、等?；罨盒揎梽┑幕罨?，即制備修飾劑衍生物。偶聯(lián)

13、：與酶蛋白偶聯(lián)反應(yīng)。proteinH a l f l i f e i nvivo(h)Injections/week-IFN-IFNHGHEPOG-CSFGM-CSF5.60.60.3652337377各類蛋白類藥物的體內(nèi)半衰期及注射次數(shù)各類蛋白類藥物的體內(nèi)半衰期及注射次數(shù)IFN-2aand40kDa(PEG)IFN-2a的藥代動力學(xué)的藥代動力學(xué) 酶 半衰期相對穩(wěn)定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇-SOD 35 h 350蛋白類藥物修飾后的半衰期及穩(wěn)定性蛋

14、白類藥物修飾后的半衰期及穩(wěn)定性1.PEG1.PEG（Polyethylene GlycolPolyethylene Glycol）簡介簡介： 具有兩親性; 無毒，免疫原性低; 分子量范圍很寬，從幾百到數(shù)十萬，選擇余地大; 修飾劑一般為50020000 可以將它的許多優(yōu)良性質(zhì):如親水性，柔性親水性，柔性、抗凝血性、抗巨噬細(xì)吞噬性抗凝血性、抗巨噬細(xì)吞噬性等，賦予修飾后的生物分子。H(-O-CH-CH)n-OH為避免在修飾過程中發(fā)生交聯(lián)和團(tuán)聚，通常采用單甲氧基聚聚乙二醇甲氧基聚聚乙二醇( (mPEG) )作為修飾劑。CH3(-O-CH-CH)n-OH2.PEG2.PEG的活化的活化1 )三氯均嗪法M

15、PEGMPEG1 1 MPEGMPEG2 2 均三嗪，三聚氯氰均三嗪，三聚氯氰消化酶作用下的過氧化氫酶的活性保留消化酶作用下的過氧化氫酶的活性保留2 2) ).N-.N-羥基琥珀酰亞胺法羥基琥珀酰亞胺法第一代第一代PEG衍生物：衍生物：反應(yīng)選擇性低；修飾后蛋白藥物的抗原性和半衰期改進(jìn)效果不明顯；容易引發(fā)蛋白質(zhì)的交聯(lián)與團(tuán)聚；衍生物與藥物反應(yīng)形成的連接鍵穩(wěn)定性不高。1. N-末端氨基修飾PEG-醛 蛋白質(zhì) N 端 氨基的 pKa 為 7.68.0，而分子內(nèi)賴氨酸的 -氨基的 pKa 為 10.010.2mPEG-醛與 N端氨基的偶聯(lián)第二代第二代PEG衍生物衍生物2.疏基修飾PEG-馬來酰亞胺PEG

16、 -吡啶-二硫醚；PEG -乙烯基砜PEG -碘乙酰胺。3.羧基端的修飾mPEG-酰肼或mPEG-胺mPEG-酰肼與羧基的偶聯(lián)枝形PEG單鏈叉形PEG多鏈叉形PEG產(chǎn)品號產(chǎn)品號末端基團(tuán)末端基團(tuán)分子量分子量包裝（包裝（g）價格價格（￥）（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MP

17、EG-NHS5-N-羥基琥珀酰亞胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羥基琥珀酰亞胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羥基琥珀酰亞胺20K1001053500070003500第四節(jié)第四節(jié) 酶化學(xué)修飾的基本要求酶化學(xué)修飾的基本要求一、被修飾酶的性質(zhì)一、被修飾酶的性質(zhì)1酶的穩(wěn)定性修飾反應(yīng)條件的確定。2. 酶活性中心的狀況3酶側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)及反應(yīng)性。用于選擇修飾劑。二、修飾劑的選擇二、修飾劑的選擇 較高的選擇性； 溫和的反應(yīng)條件；反應(yīng)的程度能用簡單的技術(shù)測定 ； 標(biāo)記的殘基穩(wěn)定、易通過降解分離進(jìn)行鑒定。三、反應(yīng)條件的確定三、反應(yīng)條件的確定 1.pH 決定了具有潛在反應(yīng)能力的功能基所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài)。 2. 修飾反應(yīng)的溫度和時間修飾反應(yīng)的溫度和時間 決定了反應(yīng)的的修飾度 影響反應(yīng)的專一性 3.酶與修飾劑的比例酶與修飾劑的比例控制修飾度。四、修飾效果評價四、修飾效果評價 1)修飾度和均一性的分析測定修飾度和均一性的分析測定 氨基修飾率：TNBS(三硝基苯磺酸）法和熒光胺法 均一性：SDS-PAGE 2)修飾蛋白理化性質(zhì)的測定修飾蛋白理化性質(zhì)的測定生物活性穩(wěn)