1、整理ppt1 實驗四、基因組實驗四、基因組DNA的提取的提取 準(zhǔn)備：一次性手套、 65水浴鍋、氯仿、無水乙 醇、1.5離心管、菜花 整理ppt2 實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模?1.了解真核生物基因組DNA提取的一般原理。 2.了解基因組DNA的實驗用途。 3. 掌握基因組DNA提取的方法和步驟。 整理ppt3 材料：材料：花椰菜花椰菜/昆蟲組織昆蟲組織 設(shè)備：設(shè)備：移液器，高速離心機(jī)，移液器，高速離心機(jī)，水浴鍋，水浴鍋，培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 。 試劑：試劑： 1. CTAB組織消化液組織消化液 2. 氯仿 3. 無水乙醇 4. TE緩沖液 整理ppt4 CTAB溶液配制 2%CTAB溶液：100mmol/L

2、Tris-HCl, pH7.0 ；1.4mol/L NaCl；20mmol/L EDTA； 2%CTAB. 10 mlfinal conc.（終濃度）（終濃度） CTAB0.2 g2% H2O5.78 ml 1MTris-HCl1.0 ml100 mM 5MNaCl2.8 ml1.4 M 0.5MEDTA0.4 ml20 mM 整理ppt5 實驗原理（實驗原理（CTABCTAB法）法） CTAB，十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污 劑，可使細(xì)胞破裂，釋放出核酸； CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解釋放出 來的DNA （ DNA在2mol/LNaCl中DNA具有較高的溶

3、解度）； 加入無水乙醇，可以使DNA從溶液中沉淀出來。 整理ppt6 實驗步驟（常溫操作，實驗步驟（常溫操作，2 2人一組）人一組） 取適量(300-500mg)植物組織，加入2ml CTAB抽提緩沖 液，充分勻漿2-3min，然后每人每人轉(zhuǎn)移700ul的勻漿液至一 支1.5ml離心管中，65水浴水浴45min（中間搖動（中間搖動2-3次）次）（ 裂解細(xì)胞，釋放核酸和蛋白）； 加入700ul的氯仿，上下?lián)u動2-3min (此步是萃取組織液 中的蛋白質(zhì)；務(wù)必帶上手套！務(wù)必帶上手套?。?； 12000rpm離心10min，取400ul上清液轉(zhuǎn)移至一支1.5ml 離心管中（由于此時懸液已經(jīng)分層，而我們

4、需要取最上 層的溶液，所以注意千萬不要使槍頭觸碰到中間的雜質(zhì) 層，當(dāng)然，更不能取吸取下層的萃取液了）； 加入1/10體積的NaAc(3mol/L,pH5.2）（40ul），上下 顛倒3-4次混勻；然后再加入2倍體積的無水乙醇（ 0.9ml)，上下顛倒3-4次混勻（如DNA量大，此時可見絮 狀DNA沉淀。（如果放置于-20度過夜，DNA產(chǎn)率會更多 ?。?整理ppt7 12000rpm離心5min，緩緩倒掉上清液（剩余的液體可以用 移液器吸走），管底的沉淀即DNA（無色透明膠狀物?。?； 加入200ulTE緩沖液（含50ug/ml RNase），輕彈管底，以輕彈管底，以 溶解溶解DNADNA；也可

5、以用槍頭緩慢地來回吸放液體來幫助溶解；也可以用槍頭緩慢地來回吸放液體來幫助溶解 DNADNA。此時應(yīng)該可以看到片狀的。此時應(yīng)該可以看到片狀的DNADNA沉淀物逐漸變少，最終沉淀物逐漸變少，最終 消失消失。（一定要使DNA完全溶解于TE中，否則影響電泳效 果！）； 將DNA溶液置于37 培養(yǎng)箱或水浴中30min（降解殘留的 RNA） ； -20 保存?zhèn)溆谩?取510ulDNA（加適量loading buffer）電泳檢測；取 2ulDNA測定濃度和OD260/280（下次課電泳檢測）。 整理ppt8 基因組基因組DNADNA的檢驗（純度）的檢驗（純度） 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 核酸在2

6、60nm處有最大吸收峰 蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰 鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰 1.7OD260/OD2802.0 整理ppt9 基因組基因組DNADNA的檢驗（完整性）的檢驗（完整性） 凝膠電泳法：凝膠電泳法： 基因組基因組DNADNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā) 生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象。生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象。 整理ppt10 M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 123456 材料質(zhì)量 （mg） 100300500100300500 所加TE體積 （ul） 200200200400400400 260/2802

7、.031.971.922.072.022.01 260/2302.102.312.192.051.952.02 濃度（ng/ul）254.5454.4569.5139.6262.1320.0 上樣2ul上樣8ul 注：1-6序號分別與表中對應(yīng)。 整理ppt11 核酸的貯存DNA保存 1 1）短期貯存：）短期貯存： 4 4或或-20-20存放于存放于TETE（TrisTris和和EDTAEDTA）緩沖液中。緩沖液中。 TETE緩沖液緩沖液(PH(PH為為8 8.0).0)，可減少，可減少DNADNA脫氨反應(yīng)；脫氨反應(yīng)；EDTAEDTA可可 以抑制以抑制DNaseDNase的活性。的活性。 2 2）長期貯存：）長期貯存： TETE緩沖液中緩沖液中-70-70保存數(shù)年；保存數(shù)年； 整理ppt12 無水乙醇沉淀無水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaClNaCl等鹽離子，作用是等鹽離子，作用是中和核酸分子表中和核酸分子表 面的負(fù)電荷，減少分子間的排斥力，有助于分子之間的聚面的負(fù)電荷，減少分子間的排斥力，有助于分子之間的聚 集集。 無水乙醇可以吸收分子之間的水，使無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNADNA沉淀析出，沉淀析出，