,獸藥殘留前處理技術(shù),Pre-treatment Technology of Veterinary Drug Residue,馬勤川威海德生技術(shù)檢測(cè)有限公司,目錄,contents,01,PART,概述,Introduction,濃縮,凈化,提取,03,02,01,樣品前處理是指樣品的制備和對(duì)樣品中的待測(cè)組分進(jìn)行提取、凈化和濃縮的過(guò)程。樣品前處理的目的是消除基質(zhì)干擾，保護(hù)儀器，提高檢測(cè)方法的靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度、精密度。,基體復(fù)雜,各目標(biāo)化合物性質(zhì)差異大,殘留濃度低,檢測(cè)限越來(lái)越嚴(yán)格,01,02,03,04,SAMPLE TYPES,獸藥殘留分析中，最常用的生物樣品是組織樣品和禽蛋，其次是奶、血液和尿液樣品。,肌肉中水分約占75%，蛋白質(zhì)（肌漿蛋白、肌原蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白）占19%，脂肪（中性脂肪、脂肪酸和磷脂）占2.5%，糖類占1.2%，以及一些無(wú)機(jī)鹽、維生素和酶類。肌漿蛋白（肌紅蛋白、糖解酶）可溶于水，肌原蛋白（肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白）溶于濃鹽水，膠原蛋白和彈性蛋白（結(jié)締組織）在上述溶劑中均不溶。,禽蛋包括蛋黃和蛋清。蛋黃的含水量約50%、蛋白質(zhì)16.5%、脂肪33%、糖類0.2%，以及一些無(wú)機(jī)鹽、維生素和酶類（淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和過(guò)氧化氫酶）。蛋清含水量達(dá)88%，蛋白質(zhì)10.5%和極少量的碳水化合物和脂肪。,與蛋清相比較，蛋黃基本上為疏水性環(huán)境，低極性藥物的殘留較多。如果需要分別測(cè)定蛋黃和蛋清中的殘留，最好將剛產(chǎn)出后的蛋分離蛋黃和蛋清，避免藥物由蛋黃向蛋清擴(kuò)散。,奶中還含有大量由酪蛋白或脂蛋白構(gòu)成的束膠體系，當(dāng)酸化或加熱時(shí)，束膠結(jié)構(gòu)解體，蛋白質(zhì)沉淀析出。非解離性的或極性較低的藥物易由血漿向奶中擴(kuò)散，導(dǎo)致奶中殘留。與血漿樣品類似，奶中的藥物可與蛋白結(jié)合。,牛奶的含水量約87%，蛋白質(zhì)（以酪蛋白為主）為3.3%，脂肪（甘油三酯）為3.7%，糖類（乳糖）為4.7%，以及一些無(wú)機(jī)鹽、維生素和酶類（過(guò)氧化物酶、脂肪酶等）。,血液由血漿和血清組成。血漿和血清的化學(xué)成分與組織液相近，測(cè)定血漿或血清中藥物濃度，比全血更能反映作用部分藥濃的變化，測(cè)定方法一般也可互相通用。若血漿中含有抗凝劑對(duì)測(cè)定有影響，則應(yīng)使用血清樣品。通常藥物在血漿中均與血漿蛋白（白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白）發(fā)生一定程度的結(jié)合，一些藥物的蛋白結(jié)合率甚至可達(dá)90%以上。因此在萃取之前，必須將結(jié)合態(tài)的藥物分離出來(lái)。,尿中藥物大多呈結(jié)合狀態(tài)，主要以葡萄苷酸和硫酸酯結(jié)合物存在，因此無(wú)論直接測(cè)定或萃取分離之前，都必須將結(jié)合態(tài)的藥物水解，使藥物游離處理。,尿液的主要成分是水、尿素及鹽類。在所有體液樣品中，尿樣最容易獲得，并且樣品最多，內(nèi)含藥物（母體藥物及代謝物）濃度高；正常尿液中僅含微量蛋白質(zhì)，不需要去蛋白處理。,02,PART,樣品預(yù)處理,Sample Pretreatment,常用的結(jié)合物水解的方法有酸水解和酶水解,藥物在體內(nèi)經(jīng)第二相代謝反應(yīng)之后，常形成葡萄糖苷酸、硫酸酯及磷酸酯等結(jié)合物。以結(jié)合狀態(tài)存在的藥物多存在于尿中，但也存在于肝臟、肌肉及血液中。,Lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipisicing elit,酸水解,有的藥物的結(jié)合物則必須采取較劇烈的條件，如加入3 mol/L鹽酸溶液后還必須煮沸1h，水解后的樣品呈強(qiáng)酸性，必要時(shí)可用堿液調(diào)整pH后再進(jìn)行萃取。,酸水解通常使用無(wú)機(jī)酸（鹽酸），至于加入鹽酸的濃度、酸化時(shí)間以及是否需要加熱等，隨藥物性質(zhì)而異，但最終應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。,酶水解,-葡糖苷酸酶可專門水解藥物的葡萄糖醛酸苷，芳基硫酸酯酶和磷酸酯酶分別水解藥物的硫酸酯和磷酸酯。也可用幾種酶的混合物，將生物樣品中藥物的葡萄糖醛酸酐及硫酸酯同時(shí)水解。,酶水解是專屬性很強(qiáng)的水解結(jié)合物的方法。通常使用的水解酶是-葡糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶、磷酸酯酶等。,蛋白質(zhì),生物樣品如肝臟、腎臟、血漿等含有大量的蛋白質(zhì)，它們能結(jié)合藥物，因此對(duì)于某些藥物檢測(cè)，必須先將與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物游離之后再作進(jìn)一步處理。,除蛋白過(guò)程是將蛋白質(zhì)變性處理后，把與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物解離出來(lái)，離心分離出去蛋白。通常除蛋白的方法是在含蛋白樣品中加入適當(dāng)?shù)某恋韯┗蜃冃詣?，使蛋白質(zhì)脫水而沉淀（如有機(jī)溶劑、中性鹽），有的是由于和蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而析出（如一些酸類：三氯乙酸、高氯酸、磷酸、苦味酸）,去蛋白原理,有機(jī)溶劑沉淀劑,甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離，得到澄清的上清液；乙腈與蛋白形成致密沉淀，易離心除去，沉淀效率較甲醇高。使用時(shí)應(yīng)加入足量的沉淀劑，通常加入量為樣品體積的1.52倍。,酸沉淀劑,常用的酸性沉淀劑有三氯乙酸和高氯酸，其它還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。酸性沉淀劑能同蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子形成不溶性鹽而沉淀，必要的條件是溶液的pH要低于蛋白的等電點(diǎn)。,LOREM IPSUM,一些無(wú)機(jī)鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等，能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷，使蛋白質(zhì)失去膠體性而沉淀下來(lái)。無(wú)機(jī)鹽中以硫酸銨最常用。,鹽沉淀劑,03,PART,提取與凈化,Extraction & Cleanup,提取凈化方法,液-液萃取,基質(zhì)固相分散技術(shù),超臨界流體萃取,固相微萃取,免疫親和色譜,固相萃取,04,01,02,03,通過(guò)萃取可將被測(cè)組分自大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)中分離出來(lái)，減少雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾,操作簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用,可一次進(jìn)行多個(gè)樣品的萃取,可將萃取液蒸發(fā)，使組分富集,經(jīng)典,溶劑的極性,1,根據(jù)相似相溶原理，極性組分易溶于極性溶劑，反之亦然，應(yīng)根據(jù)被測(cè)組分的極性選擇相似極性的溶劑,2,溶劑的沸點(diǎn),萃取分離后的有機(jī)相通常需要旋蒸至干，因此萃取溶劑的沸點(diǎn)就不應(yīng)接近或高于水的沸點(diǎn)，否則揮發(fā)困難,3,溶劑的毒性,使用對(duì)人體有害的萃取溶劑時(shí)，應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行,4,與水的互溶性,有的溶劑如乙醚，萃取后可混入大約1.2%的水分，因此伴隨帶入一些水溶性雜質(zhì),液-液萃取常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。,陽(yáng)離子藥物,陰離子藥物,陽(yáng)離子藥物配對(duì)的離子對(duì)試劑則為陰離子，其中以烷基磺酸類（RSO3H）為最常用，實(shí)際起配對(duì)作用的是其陰離子（RSO3-），R為烷基，其碳鏈越長(zhǎng)，生成的離子對(duì)絡(luò)合物脂溶性越高。,一些酸性或堿性較強(qiáng)的有機(jī)藥物在體液中呈離解狀態(tài)，成為親水性較強(qiáng)的帶電離子，即使控制pH也不能抑制它們的電離，不能用有機(jī)溶劑將其自體液中提取出來(lái)。,陰離子藥物配對(duì)的離子對(duì)試劑主要為烷基季銨類化合物，可用通式R4N+X-表示，X-可為酸根或氫氧根，R為烷基。烷基碳鏈長(zhǎng)度常用C4C12，甚至可選用C20，碳鏈越長(zhǎng)，則生成的離子對(duì)絡(luò)合物的脂溶性越高。,固相萃取是一種基于色譜分離的樣品前處理方法。固相萃取包括固相（具有一定官能團(tuán)的固體吸附劑）和液相（樣品及溶劑）。液體樣品在正壓、負(fù)壓或重力的作用下通過(guò)裝有固體吸附劑的固相萃取裝置。由于固體吸附劑具有不同的官能團(tuán)，能將特定的化合物吸附并保留在SPE柱上。,吸附目標(biāo)物,吸附雜質(zhì),基質(zhì)分散固相萃?。∕SPD，matrix solid-phase dispersion），其原理是將涂漬有C18等多種聚合物的擔(dān)體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測(cè)物洗脫下來(lái)。其優(yōu)點(diǎn)是濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中的樣品勻化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過(guò)程，不需要進(jìn)行組織勻漿、沉淀、離心、pH調(diào)節(jié)和樣品轉(zhuǎn)移等操作步驟，避免了樣品的損失。,超臨界流體具有類似氣體的較強(qiáng)穿透力和類似于液體的較大密度和溶解度，具有良好的溶劑特性，可作為溶劑進(jìn)行萃取、分離單體。,固相微萃?。⊿PME）與固相萃取原理相似，其基本原則也是“相似相溶原理”，主要依據(jù)分析物質(zhì)的分子量（揮發(fā)性）與極性。纖維頭上的薄膜由極性的聚丙烯酸酯、聚乙二醇，或非極性的聚二甲硅氧烷組成。,04,PART,實(shí)例分析,Analysis of Example,進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法,-受體激動(dòng)劑是指含氮激素中的苯乙胺類藥物。苯乙胺類藥物具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核，苯環(huán)上連接有堿性的-羥胺（腫胺）側(cè)鏈。按照苯環(huán)上取代基的差異，可將PEAs分為苯胺型和苯酚型。,稱取5g試樣，添加50L內(nèi)標(biāo)工作液，加入20mL乙酸銨緩沖溶液（pH5.2），均質(zhì)1min,8000r/min離心5min，收集上清液，加入20mL正己烷，振蕩脫脂,加入40L-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，混勻，37酶解16h。,12000r/min離心5min，下層水相過(guò)濾，待凈化,01,02,03,04,依次用3 mL甲醇、3mL水和3mL 0.1mo