15I1本文件規(guī)定了牛結(jié)節(jié)性皮膚病樣品采集、保存、運輸及廢棄物處置等技術(shù)規(guī)范和要求。本文件適用于牛結(jié)節(jié)性皮膚病的檢測、診斷、監(jiān)測、免疫效果評價等獸醫(yī)實驗室樣品采集工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。取自?；颦h(huán)境，擬通過檢驗反映牛個體、群體或環(huán)境有關(guān)狀況的材料或物品。采樣sampling按照規(guī)定的程序和要求從牛或周圍環(huán)境取得一定量樣本，并經(jīng)過處理作為檢測用樣品的過程。采用物理或化學(xué)方法殺滅或清除所有微生物的方法。有潛在生物危險、可燃、易燃、腐蝕、有毒和有感染風(fēng)險的對人、環(huán)境有害的一切廢棄物。4采樣前準(zhǔn)備4.1采樣器材24.1.2容器：真空采血管(含EDTA或肝素鈉抗凝劑)、離心管(1.5mL、2mL)、樣品保存管、樣品保存盒(袋)。4.1.3其他：醫(yī)用棉簽、75%酒精棉球、碘酊棉球、封口膜、冰袋、試管架4.4.10.1mol/LPBS(pH7.4)緩沖液，配制方法見附錄A中的A.1。5.1.1病毒分離和核酸檢測時，優(yōu)先采集皮膚結(jié)節(jié)(痂皮)、淋巴結(jié)、肺、脾等組織上的病變結(jié)節(jié)及5.1.2樣品采集、前處理、制備時要做好個人生物安全防護，避免交叉污染，具體按照GB5.1.3解剖刀、手術(shù)剪刀、鑷子使用前應(yīng)經(jīng)121℃高壓蒸汽或煮沸30min滅菌處理，臨用時可用75%5.1.4采樣后的廢棄物等按照《醫(yī)療廢物管理條例》進行無害化處理。采血前應(yīng)對采血部位的皮膚剃毛，用1%～2%碘酊消毒后，再用75%的酒精棉球由內(nèi)向外螺旋式脫碘將牛尾提起，在離尾根大約10cm中間凹陷處，垂直刺入采血器針頭約1cm,見3采集不少于3mL的血液樣品到含EDTA或肝素鈉抗凝劑的真空采血管中，采血后要輕輕上下顛倒，使采集不少于5mL的血液樣品，將裝有血液的采血器在室溫下靜置2h～4h,待血液凝固析出血清后置于4℃冰箱過夜，用移液器無菌吸出血清至1.5mL離心管內(nèi)；急用時可采用低速離心機(1000g離心5.3.1先用0.1mol/LPBS(pH7.4)緩沖液清洗皮膚表面，再用無菌手術(shù)剪刀取2g～5g結(jié)節(jié)，放入樣品保存管內(nèi)，加入10%甘油-PBS保存液，并5.3.2用手術(shù)剪刀取2g～5g痂皮和周圍組織病料，放入樣品保存管內(nèi)，加入10%甘油-PBS保存液并5.5.1病死牛在剖檢時，可采集淋巴結(jié)、肺、脾等組織的病變結(jié)節(jié)及周圍組織2g～5g,放入樣品保存管內(nèi)，加入10%甘油-PBS保存液，并沒過樣品，加蓋密封，-20℃冷凍保存。5.5.2臨床健康牛，可在屠宰時采集淋巴結(jié)、疑似結(jié)節(jié)組織樣品2g~5g,放入樣品保存管內(nèi)，加入5.6.1可采集牛圈中的墊料、糞便或尿液2g～5g,放入樣品保存5.6.2可采集飼料槽、飲水槽的拭子樣品，放入2mL離心管中，加入0.1mol/LPBS(pH7.4)緩沖液或10%甘油-PBS保存液，密封后-20℃冷凍保存。5.7.1在牛耳部、頸部、腋窩、腹股溝、尾巴等部位采集牛身上的蚊、蠅、蜱等媒介樣品，盡量保證樣品的完整性，放入裝有70%乙醇的樣本保存管內(nèi)，加蓋密封，-20℃冷凍保存。5.7.2在牛舍、擠奶廳、飲水處、活動場地周圍懸掛捕蠅籠或放置粘蠅紙(帶、板),放置24h～48h后，將捕蠅籠或粘蠅紙(帶、板)上的蚊、蠅等媒介樣品取下放入樣本保存管中，-20℃冷凍保存。6.1在裝有樣品的離心管蓋和管壁上用記號筆標(biāo)記樣品的編號，標(biāo)記的樣品編號按照采樣順序編寫，46.2皮膚結(jié)節(jié)、痂皮、組織、環(huán)境、媒介等樣品應(yīng)置于特定的樣品盒(袋)內(nèi)，注明采樣場點、采樣時間、樣品名稱、數(shù)量、編號等。6.3口鼻拭子、血清等樣品裝于離心管中，應(yīng)置于特定的樣品盒(袋)內(nèi)，注明采樣場點、采樣時間、樣品名稱、數(shù)量、編號等。6.4抗凝血樣品應(yīng)置于試管架上后裝入自封袋中，防止運輸過程中撞裂污染其他樣品，注明采樣場點、采樣時間、樣品名稱、數(shù)量、編號等。6.5外包裝上標(biāo)注放置的方向，并貼封條，封條上應(yīng)有采樣人簽章、貼封日期。7樣品的保存與運輸7.1樣品的保存7.1.1樣品采集后無法在12h內(nèi)送達獸醫(yī)實驗室的，應(yīng)根據(jù)不同的檢測要求，分類保存在冰箱或低溫冰柜中。7.1.2供病毒分離的樣品應(yīng)在0℃以下低溫保存，做核酸檢測的樣品可-20℃及以下冷凍保存。7.1.3送達實驗室，血清、口鼻拭子樣品應(yīng)在-20℃以下冷凍保存；全血在4℃低溫保存；皮膚結(jié)節(jié)和痂皮、組織、淋巴結(jié)等樣品應(yīng)-80℃冷凍保存。7.2樣品的運輸7.2.1樣品采集后，應(yīng)以最快最直接的途徑送至實驗室。7.2.2對于采集后能在24h內(nèi)送達實驗室的樣品，可放在4℃的容器中冷藏運輸；對于超過24h內(nèi)送達實驗室的樣品，在不影響監(jiān)測結(jié)果的前提下在冷凍狀態(tài)運送。7.2.3樣品運輸箱應(yīng)完整無損，密封防止漏液，必要時經(jīng)清潔、滅菌后使用。運輸箱內(nèi)需加填防震材料避免樣品晃動。樣品運輸應(yīng)符合生物安全要求。8采樣記錄8.1應(yīng)清晰標(biāo)識每份樣品的編號，同時在采樣單上填寫采樣相關(guān)信息。8.2應(yīng)記錄養(yǎng)殖場(戶)的地址和經(jīng)緯度，及養(yǎng)殖場(戶)姓名、電話等信息。8.3應(yīng)記錄養(yǎng)殖場(戶)飼養(yǎng)動物的品種及數(shù)量，存欄數(shù)、死亡數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀數(shù)。8.4應(yīng)記錄采樣牛品種、年齡、性別及耳標(biāo)號。8.5應(yīng)記錄精神狀況、臨床癥狀、產(chǎn)奶記錄、死亡時間等信息。8.6應(yīng)詳細(xì)記錄免疫和用藥情況，其中包括疫苗生產(chǎn)廠家、批號、注射方式、注射劑量、保存方式、免疫程序、末次免疫時間和用藥名稱、劑量、時間等信息。8.7應(yīng)記錄采樣時間、采樣人姓名、電話等信息。8.8將填寫好的采樣單裝在透明自封袋中，一份隨樣品送實驗室，一份給被采樣單位，另一份留存?zhèn)?廢棄物處置9.1在采樣過程中產(chǎn)生的廢棄