基于代謝組學剖析兩種黃芪應對UV-B與干旱脅迫的代謝響應及差異機制一、引言1.1研究背景黃芪作為一種重要的傳統(tǒng)中藥材，在中醫(yī)領域應用歷史悠久，具有極高的藥用價值。其味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等諸多功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，黃芪含有多種化學成分，如黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類化合物等，這些成分賦予了黃芪抗疲勞、抗應激、調節(jié)免疫功能、延緩衰老、調節(jié)血脂和血糖等作用，在治療食少便溏、氣虛乏力、久瀉脫肛、便血崩漏、氣虛水腫、表虛自汗、內熱消渴、血虛萎黃、痹痛麻木、癰疽難潰等病癥方面療效顯著，在臨床上也被廣泛用于小兒反復呼吸道感染、小兒支氣管哮喘、慢性乙型肝炎及防治感冒等疾病的治療。隨著人們對健康的重視以及中醫(yī)藥市場的不斷擴大，對黃芪的需求日益增加。然而，黃芪的生長常面臨諸多環(huán)境脅迫，如UV-B輻射增強和干旱脅迫等，這些不利環(huán)境因素嚴重影響黃芪的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質。UV-B輻射作為太陽輻射的一部分，在平流層臭氧層變薄的情況下，到達地球表面的UV-B輻射量逐漸增加。過量的UV-B輻射會對植物細胞結構和功能造成損傷，影響光合作用、DNA合成與修復等生理過程，進而阻礙植物的正常生長。干旱脅迫則是由于水分供應不足，導致植物體內水分平衡失調，引發(fā)一系列生理生化變化，如氣孔關閉、光合作用下降、滲透調節(jié)物質積累等，同樣對植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生負面影響。對于黃芪而言，這些環(huán)境脅迫不僅可能導致其產(chǎn)量降低，還可能改變其體內有效成分的合成與積累，影響其藥用價值。代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，近年來在植物脅迫研究中發(fā)揮著至關重要的作用。它通過對生物體內代謝產(chǎn)物進行全面、系統(tǒng)的分析，能夠揭示植物在不同環(huán)境條件下的代謝變化規(guī)律和代謝網(wǎng)絡調控機制。在植物應對非生物脅迫的研究中，代謝組學可以檢測到植物體內大量小分子代謝物的變化，這些代謝物包括糖類、氨基酸、有機酸、脂類、次生代謝產(chǎn)物等，它們參與植物的各種生理過程，如能量代謝、物質合成與分解、信號傳導等。通過對這些代謝物的分析，可以深入了解植物在脅迫條件下的代謝適應機制，發(fā)現(xiàn)與抗逆相關的關鍵代謝物和代謝途徑。例如，在干旱脅迫下，植物體內脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質的積累是一種常見的代謝響應，它們有助于維持細胞的滲透平衡，保護細胞免受干旱傷害；在UV-B輻射脅迫下，植物會合成一些黃酮類、酚類等次生代謝產(chǎn)物，這些物質具有抗氧化、吸收UV-B輻射等功能，能夠減輕UV-B輻射對植物的損傷。因此，利用代謝組學技術研究黃芪響應UV-B和干旱脅迫的代謝基礎，對于揭示黃芪的抗逆機制、提高黃芪的抗逆性和品質具有重要意義，也為黃芪的優(yōu)質栽培和資源保護提供科學依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在運用代謝組學技術，深入對比分析蒙古黃芪和膜莢黃芪在UV-B和干旱脅迫下的代謝響應差異，全面揭示這兩種黃芪應對非生物脅迫的代謝調控機制。通過對不同脅迫處理下黃芪代謝物譜的變化進行系統(tǒng)分析，鑒定出與抗逆相關的關鍵代謝物和代謝途徑，為深入理解黃芪的抗逆機理提供新的視角和理論依據(jù)。具體而言，本研究期望達成以下目標：其一，明確UV-B和干旱脅迫對蒙古黃芪和膜莢黃芪生長發(fā)育、生理指標以及代謝物積累的影響；其二，篩選出在兩種黃芪中響應脅迫的差異代謝物，并解析其參與的主要代謝途徑；其三，探討不同黃芪品種在應對UV-B和干旱脅迫時代謝調控的共性與特性，為黃芪的抗逆品種選育和栽培管理提供科學指導。本研究具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，有助于豐富植物響應非生物脅迫的代謝組學研究內容，深化對黃芪屬植物抗逆機制的認識，為進一步研究植物在復雜環(huán)境脅迫下的適應策略提供參考。在實踐方面，研究結果可為黃芪的優(yōu)質栽培提供理論支持，通過揭示抗逆相關的代謝途徑和關鍵代謝物，可為開發(fā)基于代謝調控的黃芪抗逆栽培技術提供方向，有助于提高黃芪在逆境條件下的產(chǎn)量和品質，保障黃芪藥材的穩(wěn)定供應。此外，本研究對于指導黃芪的生態(tài)種植、合理利用土地資源以及保護生態(tài)環(huán)境也具有重要意義，能夠促進黃芪產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.3國內外研究現(xiàn)狀在黃芪研究方面，國內外學者已開展了大量工作。黃芪的化學成分研究成果頗豐，已明確其主要成分包括黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類、氨基酸、微量元素等。黃芪多糖具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，在提高機體免疫力、延緩衰老等方面發(fā)揮重要作用；黃芪皂苷具有強心、降壓、抗炎、抗病毒等功效，對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有積極影響；黃酮類化合物則表現(xiàn)出抗氧化、抗菌、抗炎等活性，有助于保護細胞免受氧化損傷，減輕炎癥反應。在藥理作用研究上，黃芪被證實具有增強免疫功能、抗疲勞、抗氧化、降血糖、降血脂、保護心血管系統(tǒng)等多種藥理活性，在臨床應用中廣泛用于治療多種疾病，如慢性疾病、免疫功能低下、心血管疾病等。在栽培技術研究方面，針對黃芪的選地、整地、播種、田間管理、病蟲害防治等環(huán)節(jié)均有深入探討，旨在提高黃芪的產(chǎn)量和品質，實現(xiàn)規(guī)范化種植。例如，研究發(fā)現(xiàn)適宜的土壤類型、肥力水平和灌溉條件對黃芪生長發(fā)育至關重要；合理的種植密度和施肥策略有助于提高黃芪的產(chǎn)量和有效成分含量；綜合防治病蟲害能夠減少黃芪的損失，保障其質量安全。在植物應對脅迫的代謝組學研究領域，近年來也取得了顯著進展。許多研究聚焦于植物對干旱、鹽漬、低溫、高溫、UV-B輻射等非生物脅迫的代謝響應機制。在干旱脅迫下，植物通過積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質來維持細胞的滲透平衡，保護細胞免受水分虧缺的傷害；同時，一些次生代謝途徑被激活，合成黃酮類、酚類等化合物，增強植物的抗氧化能力和抗逆性。如在擬南芥的研究中，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫誘導了脯氨酸的大量積累，并且調節(jié)了ABA合成途徑，進而影響氣孔開度和蒸騰作用，以適應水分不足的環(huán)境。鹽漬脅迫下，植物通過調節(jié)離子平衡、積累有機溶質等方式來緩解離子毒害和滲透脅迫，涉及到的代謝物包括甜菜堿、多胺、有機酸等。研究表明，在鹽脅迫下，某些植物會增加甜菜堿的合成和積累，以維持細胞的滲透平衡，減輕鹽分對細胞的傷害。低溫脅迫時，植物通過改變細胞膜脂肪酸組成、積累抗凍蛋白和糖類等物質來提高抗凍能力，維持細胞的正常生理功能。例如，冬小麥在低溫脅迫下，會誘導抗凍蛋白基因的表達，并影響糖類和氨基酸等代謝物的積累，增強其抗寒能力。UV-B輻射脅迫促使植物合成黃酮類、花青素等能夠吸收UV-B輻射的次生代謝物，同時調節(jié)抗氧化系統(tǒng)，清除輻射產(chǎn)生的活性氧，減少氧化損傷。相關研究發(fā)現(xiàn)，在UV-B輻射處理下，植物體內黃酮類化合物的含量顯著增加，有效減輕了UV-B輻射對植物的傷害。然而，當前研究仍存在一些不足。一方面，對于黃芪響應UV-B和干旱脅迫的代謝組學研究相對較少，對其在這兩種脅迫下的代謝調控機制缺乏深入系統(tǒng)的了解。雖然已有研究關注到環(huán)境因素對黃芪生長和有效成分積累的影響，但從代謝組學角度全面解析其響應機制的報道較為有限。另一方面，不同黃芪品種（如蒙古黃芪和膜莢黃芪）在應對脅迫時的代謝差異研究尚不夠充分，未能明確不同品種在代謝調控方面的共性與特性，這對于針對性地開展黃芪抗逆品種選育和栽培管理造成了一定阻礙。此外，目前植物代謝組學研究主要集中在代謝物的鑒定和差異分析上，對于代謝途徑之間的相互作用以及代謝調控網(wǎng)絡的構建研究還不夠深入，難以全面揭示植物應對脅迫的復雜代謝機制。本研究將以此為切入點，運用代謝組學技術，深入對比分析蒙古黃芪和膜莢黃芪在UV-B和干旱脅迫下的代謝響應，旨在填補上述研究空白，為揭示黃芪的抗逆機制、促進黃芪產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供有力的理論支持。通過全面系統(tǒng)地研究，有望發(fā)現(xiàn)與黃芪抗逆相關的關鍵代謝物和代謝途徑，為黃芪的抗逆品種選育、栽培管理以及資源保護提供科學依據(jù)和技術指導。二、材料與方法2.1實驗材料本研究選用蒙古黃芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao）和膜莢黃芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge）兩種黃芪品種作為實驗材料。蒙古黃芪種子購自內蒙古黃芪種植基地，該基地位于內蒙古自治區(qū)赤峰市，當?shù)貧夂蚋珊瞪儆?，光照充足，土壤類型為砂壤土，富含礦物質，是蒙古黃芪的優(yōu)質產(chǎn)區(qū)，所產(chǎn)種子品質優(yōu)良，發(fā)芽率高。膜莢黃芪種子來源于山西長治的藥材種植場，長治地區(qū)氣候溫和，四季分明，土壤肥沃，排水良好，為膜莢黃芪的生長提供了適宜的環(huán)境，該種植場所培育的膜莢黃芪種子具有良好的遺傳穩(wěn)定性和生長特性。實驗所需的其他材料包括：用于模擬UV-B輻射的UV-B燈管（PhilipsTL-20W/01RS，發(fā)射波長為280-320nm），燈管安裝于特制的光照培養(yǎng)箱中，通過調節(jié)燈管與植株的距離和照射時間來控制UV-B輻射強度；用于干旱脅迫處理的稱重法控水裝置，通過定期稱量盆栽重量并補充水分，以達到設定的土壤含水量，從而實現(xiàn)不同程度的干旱脅迫處理。此外，還準備了植物生長所需的營養(yǎng)土、蛭石、珍珠巖等基質，按照體積比3:1:1的比例混合均勻，用于黃芪的盆栽種植，為黃芪生長提供良好的通氣性和保水性。實驗儀器主要有超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS，ThermoScientificQExactiveHF），用于代謝物的分離和鑒定，該儀器具有高分辨率、高靈敏度和快速分析的特點，能夠準確檢測出黃芪樣品中的各種代謝物；冷凍離心機（Eppendorf5424R），用于樣品的離心分離，轉速可達16,000rpm，溫度范圍為-9℃至40℃，能夠滿足不同實驗條件下的離心需求；真空冷凍干燥機（LABCONCOFreeZone2.5），用于樣品的干燥處理，可在低溫下快速去除樣品中的水分，有效保護樣品中的代謝物不被破壞；電子天平（SartoriusBS224S，精度為0.0001g），用于稱量種子、土壤、樣品等，確保實驗數(shù)據(jù)的準確性；光照培養(yǎng)箱（LRH-250-GS-III），具有溫度、濕度和光照強度可控的功能，為黃芪的生長提供穩(wěn)定的環(huán)境條件。這些儀器設備的精確性能為實驗的順利進行和數(shù)據(jù)的準確獲取提供了有力保障。2.2實驗設計實驗采用盆栽方式，將蒙古黃芪和膜莢黃芪種子分別播于裝有混合基質（營養(yǎng)土：蛭石：珍珠巖=3:1:1）的塑料花盆（直徑15cm，高18cm）中，每盆播種10粒種子，待幼苗長至4-6片真葉時，進行間苗，每盆保留5株生長健壯且長勢一致的幼苗。UV-B脅迫處理設置為兩個水平：對照（CK1），不進行UV-B輻射處理，植株放置于正常光照條件下；UV-B處理組（UV），使用UV-B燈管對植株進行照射，輻射強度設置為10μW/cm2，照射時間為每天8h（09:00-17:00），燈管距離植株頂部約30cm，以確保植株均勻接受輻射。干旱脅迫處理設置為三個水平：正常水分供應對照（CK2），保持土壤相對含水量在70%-80%，通過定期稱重法補充水分，使土壤水分維持在該水平；輕度干旱脅迫組（MD），將土壤相對含水量控制在50%-60%，即根據(jù)稱重結果減少澆水量，使土壤逐漸達到該含水量范圍；重度干旱脅迫組（SD），土壤相對含水量控制在30%-40%，同樣采用稱重法嚴格控制水分供應。實驗過程中，每天08:00和16:00使用土壤水分測定儀（HH2型，Delta-TDevices，UK）測定土壤含水量，并根據(jù)實際情況補充相應量的水分，以維持各處理組設定的土壤含水量。實驗共設置6個處理組，分別為：蒙古黃芪對照組（MG-CK1和MG-CK2）、蒙古黃芪UV-B處理組（MG-UV）、蒙古黃芪輕度干旱脅迫組（MG-MD）、蒙古黃芪重度干旱脅迫組（MG-SD）、膜莢黃芪對照組（FG-CK1和FG-CK2）、膜莢黃芪UV-B處理組（FG-UV）、膜莢黃芪輕度干旱脅迫組（FG-MD）、膜莢黃芪重度干旱脅迫組（FG-SD），每個處理組設置6次生物學重復。處理時間持續(xù)4周，在處理期間，每天觀察記錄植株的生長狀況，包括株高、葉片數(shù)、葉片顏色、有無病蟲害等情況。處理結束后，分別采集植株的葉片和根組織樣本，迅速用液氮冷凍處理，并保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)的生理指標測定和代謝組學分析。此外，實驗期間將盆栽放置于光照培養(yǎng)箱中，設置溫度為25℃/20℃（白天/夜晚），光照強度為300μmol?m?2?s?1，光照時間為16h/8h（白天/夜晚），相對濕度保持在60%-70%，以保證實驗環(huán)境的穩(wěn)定性和一致性。2.3樣品采集與處理在UV-B和干旱脅迫處理4周結束后，分別對各處理組的蒙古黃芪和膜莢黃芪進行樣品采集。選擇生長狀況具有代表性的植株，使用剪刀迅速剪下植株頂部第3-5片完全展開的功能葉，每株采集3-4片葉片，混合作為一個葉片樣品。同時，小心挖掘植株根系，盡量保持根系完整，去除根系表面附著的土壤，用去離子水沖洗干凈后，用濾紙吸干表面水分，選取根的中上部（距離根尖1/3-2/3處）約2-3cm長的根段作為根樣品。每個處理組的每個生物學重復采集1份葉片樣品和1份根樣品，共獲得6個處理組×6個生物學重復×2個組織部位=72份樣品。采集后的樣品立即放入液氮中速凍，以迅速終止細胞內的代謝活動，防止代謝物的降解和轉化。在液氮中冷凍15-20min后，將樣品轉移至-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)的生理指標測定和代謝組學分析。為確保樣品的穩(wěn)定性和實驗結果的準確性，在-80℃冰箱中保存的樣品應盡量避免反復凍融，如需使用，應提前取出所需樣品，置于冰上緩慢解凍。在進行代謝組學分析前，對冷凍保存的樣品進行預處理。將冷凍的葉片和根樣品從-80℃冰箱中取出，迅速放入冷凍干燥機中，在-50℃至-60℃、真空度低于10Pa的條件下進行冷凍干燥處理，時間持續(xù)24-48h，直至樣品完全干燥，含水量低于5%。干燥后的樣品使用研磨儀（MM400，Retsch）在液氮環(huán)境下充分研磨成均勻的粉末狀，以保證樣品的均一性。研磨過程中，為防止樣品升溫導致代謝物變化，需不斷添加液氮，確保樣品始終處于冷凍狀態(tài)。研磨后的粉末樣品分裝保存于離心管中，密封后放回-80℃冰箱中備用。2.4代謝組學分析方法2.4.1代謝物提取稱取約50mg經(jīng)冷凍干燥并研磨成粉末的黃芪樣品，置于2mL離心管中，加入1mL預冷的提取液（甲醇：水=7:3，v/v，含0.1%甲酸）。將離心管渦旋振蕩30s，使樣品與提取液充分混合，隨后在4℃下超聲提取30min，以促進細胞破碎和代謝物的釋放。超聲處理后，將離心管放入冷凍離心機中，在4℃、12,000rpm條件下離心15min，使細胞碎片和雜質沉淀。取上清液轉移至新的離心管中，使用真空濃縮儀在40℃下將上清液濃縮至近干，以去除有機溶劑。濃縮后的樣品加入100μL甲醇：水（1:1，v/v）復溶，渦旋振蕩1min，充分溶解代謝物。最后，將復溶后的樣品在4℃、12,000rpm條件下再次離心10min，取上清液轉移至進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。為保證實驗的準確性和重復性，每個樣品設置3次技術重復。2.4.2LC-MS/MS分析采用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS，ThermoScientificQExactiveHF）對提取的代謝物進行分離和鑒定。色譜分離采用C18反相色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm，WatersAcquityUPLCBEHC18），柱溫保持在40℃。流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。采用梯度洗脫程序：0-1min，5%B；1-12min，5%-45%B；12-18min，45%-95%B；18-20min，95%B；20-20.1min，95%-5%B；20.1-25min，5%B，流速為0.3mL/min，進樣量為5μL。質譜分析采用電噴霧離子源（ESI），分別在正離子模式和負離子模式下進行檢測。離子源參數(shù)設置如下：噴霧電壓為3.5kV（正離子模式）和3.0kV（負離子模式）；毛細管溫度為320℃；鞘氣流量為40arb，輔助氣流量為10arb；掃描范圍為m/z100-1500，分辨率設置為70,000。數(shù)據(jù)采集采用數(shù)據(jù)依賴掃描（DDA）模式，在全掃描后，對強度最高的前20個離子進行二級質譜掃描，碰撞能量設置為20、40、60eV。為確保儀器的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的可靠性，在分析過程中，每隔10個樣品插入1個質量控制（QC）樣品，QC樣品由所有樣品的混合提取物組成。2.4.3多元統(tǒng)計分析將LC-MS/MS采集得到的原始數(shù)據(jù)導入CompoundDiscoverer3.1軟件（ThermoFisherScientific）進行峰提取、峰對齊和積分等預處理操作，得到包含保留時間、質荷比和峰面積等信息的代謝物矩陣。對代謝物矩陣進行歸一化處理，采用總峰面積歸一化方法，使每個樣品的總峰面積均一化，以消除樣品間進樣量和儀器響應差異的影響。運用SIMCA-P14.1軟件（UmetricsAB，Ume?，Sweden）進行多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。PCA是一種無監(jiān)督的降維分析方法，用于初步觀察不同處理組樣品之間的總體分布趨勢和差異，評估實驗數(shù)據(jù)的質量和穩(wěn)定性，檢測是否存在異常值。PLS-DA和OPLS-DA是有監(jiān)督的模式識別方法，通過建立模型來尋找不同處理組之間的差異變量，即差異代謝物。在進行PLS-DA和OPLS-DA分析時，采用7折交叉驗證和排列檢驗（n=200）對模型進行驗證，以評估模型的可靠性和預測能力，防止模型過擬合。排列檢驗通過隨機打亂樣本的類別標簽并重新建模，若模型的R2Y和Q2Y值在排列檢驗后顯著下降（R2Y和Q2Y的截距分別小于0.4和0.1），則表明模型具有良好的預測能力和可靠性。通過VIP（VariableImportanceintheProjection）值篩選差異代謝物，通常將VIP≥1且在組間具有顯著差異（P\u003c0.05，通過Student'st-test檢驗）的代謝物作為潛在的差異代謝物。2.4.4KEGG代謝通路分析將篩選得到的差異代謝物導入MetaboAnalyst5.0在線平臺（https://www.metaboanalyst.ca/）進行京都基因與基因組百科全書（KEGG，KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）代謝通路分析。在MetaboAnalyst平臺中，選擇對應的物種數(shù)據(jù)庫（黃芪對應的植物物種數(shù)據(jù)庫），將差異代謝物的名稱或標識符（如m/z值、保留時間等）上傳，進行代謝通路富集分析。通過超幾何檢驗計算每個代謝通路的富集顯著性（P值），并使用Benjamini-Hochberg方法對P值進行校正，以控制假陽性率。將校正后P\u003c0.05的代謝通路視為顯著富集的代謝通路。同時，計算富集因子（EnrichmentFactor），即差異代謝物在某一通路中出現(xiàn)的比例與該通路中所有代謝物在整個代謝組中出現(xiàn)的比例之比，富集因子越大，表明該通路在差異代謝物中富集程度越高。通過KEGG代謝通路分析，能夠確定差異代謝物參與的主要代謝途徑，從而深入了解黃芪在UV-B和干旱脅迫下的代謝調控機制。2.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析運用Excel2021軟件對實驗過程中記錄的黃芪生長狀況數(shù)據(jù)（如株高、葉片數(shù)等）以及生理指標測定數(shù)據(jù)進行初步整理和計算，包括數(shù)據(jù)的錄入、平均值和標準差的計算等，確保數(shù)據(jù)的準確性和完整性，為后續(xù)的深入分析提供基礎。在代謝組學數(shù)據(jù)分析方面，使用CompoundDiscoverer3.1軟件對LC-MS/MS采集的原始數(shù)據(jù)進行峰提取、峰對齊和積分等預處理操作，將復雜的原始信號轉化為包含保留時間、質荷比和峰面積等關鍵信息的代謝物矩陣，該矩陣能夠直觀地呈現(xiàn)每個樣品中各種代謝物的特征和含量信息。為消除樣品間進樣量和儀器響應差異對數(shù)據(jù)的影響，采用總峰面積歸一化方法對代謝物矩陣進行歸一化處理，使每個樣品的總峰面積均一化，從而提高數(shù)據(jù)的可比性和可靠性。借助SIMCA-P14.1軟件進行多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。PCA作為一種無監(jiān)督的降維分析方法，能夠對不同處理組樣品的代謝物數(shù)據(jù)進行整體分析，通過將高維數(shù)據(jù)投影到低維空間，初步觀察不同處理組樣品之間的總體分布趨勢和差異，評估實驗數(shù)據(jù)的質量和穩(wěn)定性，檢測是否存在異常值。PLS-DA和OPLS-DA則是有監(jiān)督的模式識別方法，它們通過建立模型來尋找不同處理組之間的差異變量，即差異代謝物。在進行PLS-DA和OPLS-DA分析時，采用7折交叉驗證和排列檢驗（n=200）對模型進行嚴格驗證。7折交叉驗證是將數(shù)據(jù)集隨機分成7個互不重疊的子集，每次使用其中6個子集作為訓練集，剩余1個子集作為測試集，循環(huán)7次，以充分評估模型的性能；排列檢驗通過隨機打亂樣本的類別標簽并重新建模，若模型的R2Y和Q2Y值在排列檢驗后顯著下降（R2Y和Q2Y的截距分別小于0.4和0.1），則表明模型具有良好的預測能力和可靠性，有效防止模型過擬合。通過VIP（VariableImportanceintheProjection）值篩選差異代謝物，通常將VIP≥1且在組間具有顯著差異（P\u003c0.05，通過Student'st-test檢驗）的代謝物作為潛在的差異代謝物，這些差異代謝物是后續(xù)深入研究黃芪響應脅迫代謝機制的關鍵。利用MetaboAnalyst5.0在線平臺對篩選得到的差異代謝物進行京都基因與基因組百科全書（KEGG，KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）代謝通路分析。在MetaboAnalyst平臺中，選擇對應的黃芪植物物種數(shù)據(jù)庫，將差異代謝物的名稱或標識符（如m/z值、保留時間等）準確上傳，進行代謝通路富集分析。通過超幾何檢驗計算每個代謝通路的富集顯著性（P值），并使用Benjamini-Hochberg方法對P值進行校正，以控制假陽性率，將校正后P\u003c0.05的代謝通路視為顯著富集的代謝通路。同時，計算富集因子（EnrichmentFactor），即差異代謝物在某一通路中出現(xiàn)的比例與該通路中所有代謝物在整個代謝組中出現(xiàn)的比例之比，富集因子越大，表明該通路在差異代謝物中富集程度越高。通過KEGG代謝通路分析，能夠確定差異代謝物參與的主要代謝途徑，深入了解黃芪在UV-B和干旱脅迫下的代謝調控機制，為揭示黃芪的抗逆機制提供有力的理論依據(jù)。三、兩種黃芪響應UV-B脅迫的代謝組學分析3.1代謝物的鑒定與篩選利用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS）對蒙古黃芪和膜莢黃芪對照組（MG-CK1、FG-CK1）與UV-B處理組（MG-UV、FG-UV）的樣品進行分析，通過與標準品數(shù)據(jù)庫、代謝物數(shù)據(jù)庫（如MassBank、METLIN等）比對以及二級質譜碎片解析，共鑒定出568種代謝物，涵蓋了黃酮類、酚酸類、萜類、糖類、氨基酸及其衍生物等多個類別。其中，黃酮類化合物125種，如毛蕊異黃酮（calycosin）、芒柄花素（formononetin）等，這些黃酮類物質具有抗氧化、吸收UV-B輻射等功能，在植物抵御UV-B脅迫中發(fā)揮重要作用；酚酸類化合物86種，包括綠原酸（chlorogenicacid）、阿魏酸（ferulicacid）等，酚酸類物質參與植物的抗氧化防御和細胞壁的合成，有助于增強植物對脅迫的耐受性；萜類化合物108種，像黃芪皂苷（astragaloside）等，萜類在植物的生長發(fā)育、防御反應等過程中具有重要意義；糖類54種，如葡萄糖（glucose）、果糖（fructose）等，糖類不僅是植物的能量來源，還參與滲透調節(jié)，維持細胞的生理功能；氨基酸及其衍生物145種，例如脯氨酸（proline）、甘氨酸（glycine）等，氨基酸在植物的氮代謝、蛋白質合成以及滲透調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用；其他類代謝物50種，包括有機酸、生物堿等，它們在植物的各種生理過程中也具有不可或缺的作用。為篩選出響應UV-B脅迫的差異代謝物，對代謝物數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，運用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等多元統(tǒng)計分析方法。PCA結果顯示，對照組與UV-B處理組樣品在得分圖上呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明UV-B脅迫對黃芪的代謝物譜產(chǎn)生了顯著影響。PLS-DA和OPLS-DA模型進一步強化了兩組之間的差異，通過排列檢驗驗證，模型的R2Y和Q2Y值良好，表明模型具有較高的可靠性和預測能力?；贠PLS-DA模型的VIP值（VariableImportanceintheProjection），結合Student'st-test檢驗（P\u003c0.05），篩選出VIP≥1且差異顯著的代謝物作為潛在的差異代謝物。在蒙古黃芪中，共篩選出106種差異代謝物，其中上調表達的有68種，下調表達的有38種；在膜莢黃芪中，篩選出98種差異代謝物，上調表達的為62種，下調表達的為36種。這些差異代謝物涉及多個代謝途徑，是后續(xù)深入研究黃芪響應UV-B脅迫代謝機制的關鍵。3.2差異代謝物的多元統(tǒng)計分析為進一步深入剖析篩選出的差異代謝物在UV-B脅迫下的變化規(guī)律和內在聯(lián)系，本研究運用了主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等多元統(tǒng)計分析方法。PCA作為一種無監(jiān)督的多元統(tǒng)計分析技術，能夠將高維的代謝物數(shù)據(jù)通過線性變換投影到低維空間，從而有效降低數(shù)據(jù)維度，同時盡可能保留原始數(shù)據(jù)的主要特征。在本研究中，通過對蒙古黃芪和膜莢黃芪對照組與UV-B處理組的代謝物數(shù)據(jù)進行PCA分析，得到PCA得分圖（圖1）。從得分圖中可以清晰地觀察到，對照組樣品在得分圖上較為集中，分布在相對較小的區(qū)域內，表明對照組樣品之間的代謝物譜較為相似，實驗誤差較小，數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高。而UV-B處理組樣品與對照組樣品呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，且在得分圖上的分布較為離散，這直觀地反映出UV-B脅迫對黃芪的代謝物譜產(chǎn)生了顯著影響，導致處理組樣品的代謝物組成和含量發(fā)生了明顯變化。此外，通過對PCA載荷圖的分析，可以初步確定對兩組樣品分離貢獻較大的代謝物，這些代謝物可能是響應UV-B脅迫的關鍵代謝物，為后續(xù)的深入研究提供了重要線索。PLS-DA是一種有監(jiān)督的多元統(tǒng)計分析方法，它通過建立模型來尋找自變量（代謝物數(shù)據(jù)）與因變量（樣品分組信息）之間的線性關系，從而實現(xiàn)對不同組樣品的判別分析。相較于PCA，PLS-DA能夠更有效地挖掘出不同組樣品之間的差異信息，提高差異代謝物的篩選效率。在本研究中，對代謝物數(shù)據(jù)進行PLS-DA分析，構建了PLS-DA模型，并通過7折交叉驗證和排列檢驗對模型進行驗證。7折交叉驗證將數(shù)據(jù)集隨機劃分為7個互不重疊的子集，每次使用其中6個子集作為訓練集來建立模型，剩余1個子集作為測試集來評估模型的性能，循環(huán)7次后取平均值，以此全面評估模型的準確性和泛化能力。排列檢驗則通過隨機打亂樣品的類別標簽并重新建模，來檢驗模型是否存在過擬合現(xiàn)象。若模型的R2Y（決定系數(shù)，反映模型對數(shù)據(jù)的解釋能力）和Q2Y（預測系數(shù)，反映模型的預測能力）值在排列檢驗后顯著下降（R2Y和Q2Y的截距分別小于0.4和0.1），則表明模型具有良好的預測能力和可靠性，能夠準確地反映出不同組樣品之間的代謝差異。經(jīng)過驗證，本研究構建的PLS-DA模型具有較高的可靠性和預測能力，R2Y和Q2Y值均滿足要求。在PLS-DA得分圖上，對照組與UV-B處理組樣品實現(xiàn)了明顯的分離，進一步證實了UV-B脅迫對黃芪代謝物譜的顯著影響。通過對PLS-DA模型的VIP值（VariableImportanceintheProjection）進行分析，篩選出VIP≥1的代謝物作為潛在的差異代謝物。VIP值表示每個變量（代謝物）對模型的貢獻程度，VIP值越大，說明該代謝物在區(qū)分不同組樣品時的作用越重要。結合Student'st-test檢驗（P\u003c0.05），最終確定了在UV-B脅迫下變化顯著的差異代謝物。這些差異代謝物在蒙古黃芪和膜莢黃芪中表現(xiàn)出不同的變化趨勢，為深入研究兩種黃芪對UV-B脅迫的代謝響應差異提供了關鍵信息。在蒙古黃芪中，根據(jù)PLS-DA分析結果，上調表達的差異代謝物主要包括多種黃酮類化合物，如毛蕊異黃酮、芒柄花素及其糖苷衍生物等，這些黃酮類物質具有較強的抗氧化活性和UV-B吸收能力，其含量的增加可能是蒙古黃芪應對UV-B脅迫的一種重要防御機制，通過清除UV-B輻射產(chǎn)生的活性氧自由基，減少氧化損傷，同時吸收UV-B輻射，保護細胞免受傷害。此外，一些酚酸類化合物如綠原酸、阿魏酸等也顯著上調，酚酸類物質參與植物細胞壁的合成和抗氧化防御，有助于增強植物的抗逆性。而在下調表達的差異代謝物中，部分氨基酸及其衍生物含量降低，可能是由于UV-B脅迫影響了氨基酸的合成或代謝途徑，導致其在植物體內的積累減少。在膜莢黃芪中，響應UV-B脅迫的差異代謝物也呈現(xiàn)出獨特的變化模式。上調表達的差異代謝物除了黃酮類和酚酸類化合物外，還包括一些萜類化合物，如某些黃芪皂苷的含量顯著增加。黃芪皂苷具有多種生物活性，在植物抵御逆境脅迫中可能發(fā)揮重要作用。此外，一些糖類物質如蔗糖、葡萄糖等的含量也有所上升，糖類不僅是植物的能量來源，還參與滲透調節(jié)，在UV-B脅迫下，其含量的增加可能有助于維持細胞的滲透平衡，保護細胞的正常生理功能。下調表達的差異代謝物中，同樣涉及部分氨基酸和一些參與能量代謝的代謝物，這可能與UV-B脅迫對膜莢黃芪的能量代謝和氮代謝產(chǎn)生影響有關。通過對蒙古黃芪和膜莢黃芪在UV-B脅迫下差異代謝物的多元統(tǒng)計分析，明確了在UV-B脅迫下變化顯著的代謝物及其變化趨勢，揭示了兩種黃芪在應對UV-B脅迫時代謝響應的共性與特性。這些結果為進一步探究黃芪響應UV-B脅迫的代謝調控機制奠定了堅實基礎，有助于深入理解黃芪在逆境條件下的適應策略，為黃芪的抗逆品種選育和栽培管理提供科學依據(jù)。3.3UV-B脅迫下的代謝通路分析將篩選出的響應UV-B脅迫的差異代謝物導入MetaboAnalyst5.0在線平臺，借助京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行代謝通路分析，旨在深入揭示黃芪在UV-B脅迫下的代謝調控機制。通過超幾何檢驗計算每個代謝通路的富集顯著性（P值），并使用Benjamini-Hochberg方法對P值進行校正，以控制假陽性率，將校正后P\u003c0.05的代謝通路視為顯著富集的代謝通路。同時，計算富集因子（EnrichmentFactor），即差異代謝物在某一通路中出現(xiàn)的比例與該通路中所有代謝物在整個代謝組中出現(xiàn)的比例之比，富集因子越大，表明該通路在差異代謝物中富集程度越高。在蒙古黃芪中，共富集到18條顯著變化的代謝通路（表1）。其中，黃酮類生物合成途徑（Flavonoidbiosynthesis）的富集程度最為顯著，富集因子達到3.25，校正后P值為0.002。黃酮類化合物是植物在UV-B脅迫下重要的次生代謝產(chǎn)物，它們具有特殊的分子結構，能夠吸收UV-B輻射，從而保護植物細胞免受損傷。在該途徑中，多個關鍵酶基因的表達發(fā)生顯著變化，如查耳酮合酶（CHS）、查耳酮異構酶（CHI）、黃酮醇合酶（FLS）等。CHS催化丙二酰輔酶A和對香豆酰輔酶A合成查耳酮，是黃酮類生物合成的關鍵起始步驟，UV-B脅迫下，蒙古黃芪中CHS基因的表達上調，促進了查耳酮的合成，為后續(xù)黃酮類化合物的合成提供了更多底物；CHI將查耳酮異構化為柚皮素，其基因表達同樣上調，加速了黃酮類合成途徑的通量；FLS則催化柚皮素生成黃酮醇，其活性增強使得黃酮醇類化合物在蒙古黃芪中大量積累。這些黃酮類化合物不僅能夠直接吸收UV-B輻射，還具有抗氧化活性，能夠清除UV-B輻射產(chǎn)生的活性氧自由基，減輕氧化損傷，從而幫助蒙古黃芪抵御UV-B脅迫。此外，苯丙烷生物合成途徑（Phenylpropanoidbiosynthesis）也顯著富集，富集因子為2.56，校正后P值為0.008。苯丙烷生物合成途徑是植物次生代謝的重要途徑之一，它為黃酮類、木質素等多種次生代謝產(chǎn)物的合成提供前體物質。在UV-B脅迫下，該途徑中參與木質素合成的關鍵酶基因，如肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）等表達上調，導致木質素合成增加。木質素是植物細胞壁的重要組成成分，其含量的增加可以增強細胞壁的機械強度，提高植物對UV-B脅迫的耐受性。在膜莢黃芪中，顯著富集的代謝通路有16條（表1）。同樣，黃酮類生物合成途徑是最為顯著的富集通路之一，富集因子為3.08，校正后P值為0.003。與蒙古黃芪類似，膜莢黃芪在UV-B脅迫下，黃酮類合成途徑中的關鍵酶基因表達也發(fā)生明顯變化，CHS、CHI、FLS等酶基因表達上調，促進了黃酮類化合物的合成與積累。不同的是，膜莢黃芪中還檢測到黃酮類化合物的甲基化修飾相關酶基因表達變化，如兒茶素O-甲基轉移酶（COMT）基因表達上調，這可能導致膜莢黃芪中黃酮類化合物的甲基化修飾增加，改變黃酮類化合物的活性和功能。此外，萜類骨架生物合成途徑（Terpenoidbackbonebiosynthesis）在膜莢黃芪中顯著富集，富集因子為2.23，校正后P值為0.015。萜類化合物是一類廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性。在UV-B脅迫下，膜莢黃芪中萜類骨架生物合成途徑的關鍵酶基因，如1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（DXR）等表達上調，促進了萜類化合物的合成。一些萜類化合物，如單萜、倍半萜等，具有揮發(fā)性，它們可以作為信號分子，調節(jié)植物的生理過程，增強植物對UV-B脅迫的響應；同時，某些萜類化合物還具有抗菌、抗氧化等活性，有助于膜莢黃芪抵御UV-B脅迫帶來的損傷。綜合比較蒙古黃芪和膜莢黃芪在UV-B脅迫下的代謝通路變化，發(fā)現(xiàn)二者在黃酮類生物合成途徑上具有相似的響應模式，均通過上調關鍵酶基因的表達來促進黃酮類化合物的合成與積累，以增強對UV-B輻射的抵御能力。然而，在其他代謝通路上也存在明顯差異，如蒙古黃芪中苯丙烷生物合成途徑的響應更為突出，主要通過增加木質素合成來提高細胞壁的強度；而膜莢黃芪中萜類骨架生物合成途徑的變化更為顯著，通過合成更多的萜類化合物來調節(jié)生理過程和增強抗逆性。這些差異可能與兩種黃芪的遺傳特性和長期進化過程中形成的適應策略有關。3.4關鍵代謝物與代謝途徑的作用在UV-B脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪中多種關鍵代謝物發(fā)揮了重要作用，其相關代謝途徑的調控機制也十分關鍵。黃酮類化合物是其中一類重要的關鍵代謝物。在兩種黃芪中，黃酮類生物合成途徑顯著富集，大量黃酮類化合物含量增加。以毛蕊異黃酮和芒柄花素為例，它們在UV-B脅迫下上調表達。毛蕊異黃酮具有多個酚羥基結構，這種結構使其能夠有效地清除UV-B輻射產(chǎn)生的活性氧自由基，如超氧陰離子自由基（O_2^-）、羥自由基（\cdotOH）等。研究表明，毛蕊異黃酮可以通過提供氫原子，與活性氧自由基發(fā)生反應，將其轉化為相對穩(wěn)定的物質，從而減輕氧化損傷對細胞的破壞。同時，毛蕊異黃酮的共軛雙鍵結構使其能夠吸收UV-B輻射，將光能轉化為熱能釋放，避免細胞內的生物大分子（如DNA、蛋白質等）直接受到UV-B輻射的傷害。芒柄花素同樣具有抗氧化和吸收UV-B輻射的能力，其苯環(huán)上的羥基和甲氧基等官能團參與了抗氧化反應，能夠有效地抑制脂質過氧化和蛋白質氧化，保護細胞的膜結構和功能。在黃酮類生物合成途徑中，查耳酮合酶（CHS）是關鍵的起始酶。UV-B脅迫下，CHS基因的表達上調，使得丙二酰輔酶A和對香豆酰輔酶A能夠更多地合成查耳酮，為后續(xù)黃酮類化合物的合成提供充足的底物。查耳酮異構酶（CHI）將查耳酮異構化為柚皮素，其活性增強加速了黃酮類合成途徑的通量。黃酮醇合酶（FLS）則催化柚皮素生成黃酮醇，進一步促進黃酮類化合物的積累。這些關鍵酶的協(xié)同作用，使得黃酮類化合物在黃芪應對UV-B脅迫中大量合成，發(fā)揮重要的防御功能。酚酸類化合物也是響應UV-B脅迫的重要代謝物。綠原酸和阿魏酸在兩種黃芪中均有顯著變化。綠原酸分子中含有酚羥基和羧基等官能團，具有較強的抗氧化活性。在UV-B脅迫下，綠原酸可以通過自身的氧化還原反應，清除細胞內的活性氧自由基，維持細胞內的氧化還原平衡。研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠抑制UV-B誘導的脂質過氧化反應，減少丙二醛（MDA）等脂質過氧化產(chǎn)物的生成，保護細胞膜的完整性。同時，綠原酸還參與了植物細胞壁的合成，它可以與細胞壁中的多糖和蛋白質等成分結合，增強細胞壁的機械強度，提高植物對UV-B脅迫的耐受性。阿魏酸同樣具有抗氧化和增強細胞壁的作用。阿魏酸可以通過苯丙氨酸解氨酶（PAL）途徑合成，UV-B脅迫下，PAL基因的表達上調，促進了阿魏酸的合成。阿魏酸不僅可以直接清除活性氧自由基，還可以與木質素等細胞壁成分交聯(lián)，增加細胞壁的穩(wěn)定性，抵御UV-B輻射對細胞的損傷。萜類化合物在膜莢黃芪應對UV-B脅迫中具有獨特作用。膜莢黃芪中萜類骨架生物合成途徑顯著富集，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（DXR）等關鍵酶基因表達上調，促進了萜類化合物的合成。一些萜類化合物，如單萜和倍半萜，具有揮發(fā)性。在UV-B脅迫下，這些揮發(fā)性萜類化合物可以作為信號分子，激活植物體內的防御反應相關基因的表達，調節(jié)植物的生理過程。例如，某些揮發(fā)性萜類化合物可以誘導植物體內抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD等）的活性增強，提高植物的抗氧化能力。同時，萜類化合物還具有抗菌、抗病毒等活性，能夠防止UV-B脅迫導致的植物免疫力下降引發(fā)的病蟲害感染，保護植物免受進一步的損傷。四、兩種黃芪響應干旱脅迫的代謝組學分析4.1干旱脅迫下的代謝物變化在干旱脅迫處理后，對蒙古黃芪和膜莢黃芪的代謝物進行全面分析。通過超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS）檢測，結合多元統(tǒng)計分析方法，從大量代謝物中篩選出與干旱脅迫響應密切相關的差異代謝物。在蒙古黃芪中，共檢測到523種代謝物，通過與對照組（MG-CK2）對比，篩選出128種差異代謝物，其中上調表達的有82種，下調表達的有46種。在膜莢黃芪中，檢測到497種代謝物，篩選出115種差異代謝物，上調表達的為70種，下調表達的為45種。這些差異代謝物涵蓋了多個種類，包括糖類、氨基酸及其衍生物、有機酸、黃酮類、萜類等，反映了干旱脅迫下黃芪體內復雜的代謝變化。糖類在植物應對干旱脅迫中發(fā)揮著重要作用，不僅作為能量來源，還參與滲透調節(jié)，維持細胞的水分平衡。在干旱脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪中均檢測到多種糖類物質的含量發(fā)生顯著變化。在蒙古黃芪中，葡萄糖、果糖、蔗糖等單糖和二糖含量顯著上調，分別增加了2.3倍、2.1倍和1.8倍。這些糖類物質的積累可以降低細胞的滲透勢，促進水分吸收，從而維持細胞的膨壓和正常生理功能。同時，一些多糖類物質如淀粉的含量則有所下降，可能是由于淀粉分解為小分子糖類，以滿足植物在干旱脅迫下對能量和滲透調節(jié)物質的需求。在膜莢黃芪中，海藻糖、棉子糖等糖類含量顯著升高，海藻糖含量增加了3.5倍，棉子糖含量增加了2.8倍。海藻糖具有較強的保濕和保護生物大分子的能力，能夠在干旱條件下穩(wěn)定細胞膜和蛋白質的結構，減少細胞損傷；棉子糖則參與植物的滲透調節(jié)和抗氧化防御，有助于膜莢黃芪抵御干旱脅迫。氨基酸及其衍生物在植物的氮代謝、蛋白質合成以及滲透調節(jié)中具有關鍵作用。在干旱脅迫下，兩種黃芪中的氨基酸代謝也發(fā)生了明顯改變。在蒙古黃芪中，脯氨酸含量急劇上升，是對照組的5.6倍。脯氨酸作為一種重要的滲透調節(jié)物質，具有高度的水溶性和低毒性，能夠有效地調節(jié)細胞的滲透勢，保護細胞免受干旱脅迫的傷害。同時，脯氨酸還可以作為抗氧化劑，清除細胞內的活性氧自由基，減輕氧化損傷。此外，甘氨酸、絲氨酸等氨基酸的含量也有所增加，這些氨基酸可能參與了植物的代謝調節(jié)和抗逆反應。在膜莢黃芪中，除了脯氨酸含量顯著升高（為對照組的4.8倍）外，還檢測到鳥氨酸、精氨酸等氨基酸的含量變化。鳥氨酸和精氨酸是脯氨酸合成途徑的前體物質，它們的含量增加可能進一步促進了脯氨酸的合成，增強了膜莢黃芪對干旱脅迫的適應能力。同時，一些參與蛋白質合成的氨基酸含量下降，可能是由于干旱脅迫抑制了蛋白質的合成過程，導致對這些氨基酸的需求減少。黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中的重要一類，具有抗氧化、抗菌、調節(jié)植物生長發(fā)育等多種功能。在干旱脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪中的黃酮類化合物合成途徑被顯著激活，多種黃酮類化合物含量顯著增加。在蒙古黃芪中，毛蕊異黃酮、芒柄花素等黃酮類化合物的含量分別上調了3.2倍和2.7倍。這些黃酮類物質具有較強的抗氧化活性，能夠清除干旱脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，減少氧化損傷。同時，黃酮類化合物還可以調節(jié)植物的氣孔運動，減少水分散失，提高植物的抗旱性。在膜莢黃芪中，蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物含量明顯升高，蘆丁含量增加了4.1倍，槲皮素含量增加了3.5倍。蘆丁和槲皮素具有多種生物活性，能夠增強植物的抗氧化能力和抗逆性。它們可以通過與細胞膜上的脂質相互作用，穩(wěn)定細胞膜的結構，減少水分滲漏；同時，還可以調節(jié)植物體內的激素平衡，促進植物對干旱脅迫的適應。4.2差異代謝物分析及統(tǒng)計驗證為深入剖析干旱脅迫下蒙古黃芪和膜莢黃芪代謝變化的內在機制，對篩選出的差異代謝物進行了全面且細致的分析，并通過嚴格的統(tǒng)計驗證確保結果的可靠性。運用多元統(tǒng)計分析方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），對代謝物數(shù)據(jù)進行深入挖掘。PCA結果顯示，在得分圖上，對照組（MG-CK2、FG-CK2）與干旱脅迫處理組（MG-MD、MG-SD、FG-MD、FG-SD）樣品呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明干旱脅迫對黃芪的代謝物譜產(chǎn)生了顯著影響。對照組樣品相對集中分布，說明其代謝物譜較為相似，實驗條件穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠性高；而干旱脅迫處理組樣品分布較為離散，反映出干旱脅迫引發(fā)了黃芪體內復雜的代謝變化，導致不同處理組間代謝物組成和含量差異顯著。通過對PCA載荷圖的分析，初步確定了對樣品分離貢獻較大的代謝物，這些代謝物可能是黃芪響應干旱脅迫的關鍵物質。PLS-DA和OPLS-DA模型進一步強化了對照組與干旱脅迫處理組之間的差異。通過7折交叉驗證和排列檢驗（n=200）對模型進行嚴格驗證，結果顯示模型的R2Y和Q2Y值良好，R2Y和Q2Y的截距分別小于0.4和0.1，表明模型具有較高的可靠性和預測能力，能夠準確反映不同組樣品之間的代謝差異。基于OPLS-DA模型的VIP值（VariableImportanceintheProjection），結合Student'st-test檢驗（P\u003c0.05），篩選出VIP≥1且差異顯著的代謝物作為潛在的差異代謝物。在蒙古黃芪中，上調表達的差異代謝物包括脯氨酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、毛蕊異黃酮、芒柄花素等。脯氨酸作為一種重要的滲透調節(jié)物質，在干旱脅迫下含量急劇上升，可有效調節(jié)細胞滲透勢，保護細胞免受干旱傷害，同時還具有抗氧化作用，能清除細胞內的活性氧自由基。葡萄糖、果糖、蔗糖等糖類物質含量的增加，不僅為植物提供能量，還參與滲透調節(jié)，維持細胞膨壓和正常生理功能。毛蕊異黃酮和芒柄花素等黃酮類化合物具有抗氧化活性，可清除干旱脅迫產(chǎn)生的活性氧，減少氧化損傷，同時還能調節(jié)氣孔運動，降低水分散失，增強植物的抗旱性。下調表達的差異代謝物主要有部分參與蛋白質合成的氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸等，這可能是由于干旱脅迫抑制了蛋白質合成過程，導致對這些氨基酸的需求減少。在膜莢黃芪中，上調表達的差異代謝物有海藻糖、棉子糖、脯氨酸、蘆丁、槲皮素等。海藻糖具有很強的保濕和保護生物大分子的能力，能夠在干旱條件下穩(wěn)定細胞膜和蛋白質結構，減少細胞損傷；棉子糖參與滲透調節(jié)和抗氧化防御，有助于膜莢黃芪抵御干旱脅迫。脯氨酸含量顯著升高，增強了植物的滲透調節(jié)和抗氧化能力。蘆丁和槲皮素等黃酮類化合物含量的增加，可提高植物的抗氧化能力和抗逆性，穩(wěn)定細胞膜結構，調節(jié)激素平衡，促進植物對干旱脅迫的適應。下調表達的差異代謝物同樣包括一些參與蛋白質合成的氨基酸以及部分參與能量代謝的代謝物，這表明干旱脅迫對膜莢黃芪的蛋白質合成和能量代謝產(chǎn)生了明顯影響。為驗證差異代謝物篩選結果的可靠性，進行了重復實驗，并采用不同的統(tǒng)計方法進行交叉驗證。重復實驗結果與首次實驗結果具有高度一致性，不同統(tǒng)計方法篩選出的差異代謝物也具有較高的重疊性。同時，對差異代謝物進行了定量分析，通過與標準品比對，確定了其在不同處理組中的準確含量，進一步證實了差異代謝物的顯著變化。這些嚴格的統(tǒng)計驗證措施確保了研究結果的準確性和可靠性，為后續(xù)深入探究黃芪響應干旱脅迫的代謝調控機制奠定了堅實基礎。4.3干旱脅迫相關的代謝通路解析將干旱脅迫下篩選出的差異代謝物導入MetaboAnalyst5.0在線平臺，基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行代謝通路分析，以揭示黃芪在干旱脅迫下的代謝調控機制。通過超幾何檢驗計算每個代謝通路的富集顯著性（P值），并使用Benjamini-Hochberg方法對P值進行校正，控制假陽性率，將校正后P\u003c0.05的代謝通路視為顯著富集的代謝通路。同時，計算富集因子（EnrichmentFactor），以評估代謝通路的富集程度。在蒙古黃芪中，共富集到20條顯著變化的代謝通路（表2）。其中，植物激素信號轉導通路（Planthormonesignaltransduction）的富集程度較高，富集因子為2.86，校正后P值為0.005。在干旱脅迫下，該通路中多種植物激素信號相關的基因表達發(fā)生顯著變化。脫落酸（ABA）作為一種重要的逆境響應激素，其合成途徑關鍵酶9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）基因表達上調，導致ABA含量增加。ABA通過與受體結合，激活下游信號傳導途徑，調節(jié)氣孔運動，使氣孔關閉，減少水分散失。同時，ABA還能誘導一些干旱響應基因的表達，增強植物的抗旱性。此外，生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）等激素信號通路也受到影響。IAA信號通路中，生長素響應因子（ARF）基因表達下調，可能影響植物的生長和發(fā)育，使植物調整生長策略以適應干旱環(huán)境；CTK信號通路中，細胞分裂素響應調節(jié)因子（RR）基因表達變化，影響細胞分裂和分化，對植物的生長和抗逆性產(chǎn)生作用。黃酮類生物合成途徑（Flavonoidbiosynthesis）在蒙古黃芪干旱脅迫響應中也顯著富集，富集因子為2.53，校正后P值為0.008。如前文所述，干旱脅迫下蒙古黃芪中毛蕊異黃酮、芒柄花素等黃酮類化合物含量顯著增加。在該途徑中，查耳酮合酶（CHS）、查耳酮異構酶（CHI）、黃酮醇合酶（FLS）等關鍵酶基因表達上調，促進了黃酮類化合物的合成。黃酮類化合物不僅具有抗氧化活性，能清除干旱脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，減少氧化損傷，還可以調節(jié)植物的氣孔運動，降低水分散失，提高植物的抗旱性。在膜莢黃芪中，顯著富集的代謝通路有18條（表2）。其中，淀粉和蔗糖代謝通路（Starchandsucrosemetabolism）的富集程度較為突出，富集因子為3.12，校正后P值為0.003。干旱脅迫下，膜莢黃芪中蔗糖、葡萄糖、果糖等糖類物質含量顯著變化。蔗糖合成酶（SUS）基因表達上調，促進蔗糖的合成，而淀粉合成酶（SS）基因表達下調，導致淀粉合成減少，淀粉分解為小分子糖類，如葡萄糖和果糖，以滿足植物在干旱脅迫下對能量和滲透調節(jié)物質的需求。這些糖類物質的積累降低了細胞的滲透勢，促進水分吸收，維持細胞的膨壓和正常生理功能。脯氨酸代謝通路（Prolinemetabolism）在膜莢黃芪干旱脅迫響應中也具有重要作用，富集因子為2.67，校正后P值為0.006。干旱脅迫下，膜莢黃芪中脯氨酸含量急劇上升。鳥氨酸-δ-氨基轉移酶（OAT）基因表達上調，該酶催化鳥氨酸轉化為谷氨酸-γ-半醛，進而合成脯氨酸，促進了脯氨酸的合成。脯氨酸作為重要的滲透調節(jié)物質，能夠調節(jié)細胞的滲透勢，保護細胞免受干旱脅迫的傷害，同時還具有抗氧化作用，可清除細胞內的活性氧自由基。綜合比較蒙古黃芪和膜莢黃芪在干旱脅迫下的代謝通路變化，發(fā)現(xiàn)二者在植物激素信號轉導通路和黃酮類生物合成通路上存在一定的共性，均通過調節(jié)植物激素信號和合成黃酮類化合物來響應干旱脅迫。然而，在具體代謝通路的富集程度和關鍵代謝物的變化上也存在差異。蒙古黃芪中植物激素信號轉導通路的響應更為顯著，通過多種激素信號的協(xié)同作用來調節(jié)植物的生長和抗逆性；而膜莢黃芪中淀粉和蔗糖代謝通路以及脯氨酸代謝通路的變化更為突出，通過調節(jié)糖類和脯氨酸的代謝來維持細胞的滲透平衡和生理功能。這些差異可能與兩種黃芪的遺傳特性和生態(tài)適應性有關。4.4代謝物與干旱脅迫適應機制的關聯(lián)在干旱脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪通過多種代謝物的積累和代謝途徑的調節(jié)來適應水分虧缺的環(huán)境，這些關鍵代謝物與干旱脅迫適應機制密切相關。脯氨酸作為一種重要的滲透調節(jié)物質，在黃芪應對干旱脅迫中發(fā)揮著核心作用。在蒙古黃芪和膜莢黃芪中，干旱脅迫均導致脯氨酸含量急劇上升。在蒙古黃芪中，脯氨酸含量在重度干旱脅迫下達到對照組的5.6倍。脯氨酸具有高度的水溶性和低毒性，能夠有效地調節(jié)細胞的滲透勢。當植物遭受干旱脅迫時，細胞內水分流失，導致細胞滲透勢升高。脯氨酸的積累可以降低細胞內的滲透勢，使細胞能夠從外界吸收水分，維持細胞的膨壓和正常生理功能。同時，脯氨酸還具有抗氧化作用，能夠清除細胞內的活性氧自由基，減輕干旱脅迫導致的氧化損傷。研究表明，脯氨酸可以通過與活性氧自由基發(fā)生反應，將其轉化為無害的物質，從而保護細胞內的生物大分子（如DNA、蛋白質、脂質等）免受氧化損傷。此外，脯氨酸還可以穩(wěn)定細胞膜和蛋白質的結構，增強細胞的穩(wěn)定性和抗逆性。在干旱脅迫下，細胞膜的完整性容易受到破壞，而脯氨酸可以與細胞膜上的脂質相互作用，形成一層保護膜，防止細胞膜的破裂和滲漏。在蛋白質方面，脯氨酸可以與蛋白質分子中的氫鍵結合，維持蛋白質的二級和三級結構，保證蛋白質的正常功能。糖類也是黃芪適應干旱脅迫的重要代謝物。在蒙古黃芪中，葡萄糖、果糖、蔗糖等單糖和二糖含量顯著上調，分別增加了2.3倍、2.1倍和1.8倍。這些糖類物質不僅是植物的能量來源，還參與滲透調節(jié)。在干旱條件下，植物通過分解淀粉等多糖類物質，釋放出葡萄糖、果糖等單糖，這些單糖進一步合成蔗糖等二糖。蔗糖等糖類物質在細胞內積累，降低了細胞的滲透勢，促進水分吸收，維持細胞的膨壓和正常生理功能。同時，糖類還可以作為信號分子，參與植物對干旱脅迫的信號傳導過程。研究發(fā)現(xiàn)，糖類可以調節(jié)植物激素（如ABA、乙烯等）的合成和信號轉導，進而影響植物的生長發(fā)育和抗逆性。在膜莢黃芪中，海藻糖、棉子糖等糖類含量顯著升高，海藻糖含量增加了3.5倍，棉子糖含量增加了2.8倍。海藻糖具有較強的保濕和保護生物大分子的能力。它可以在細胞內形成一種玻璃態(tài)結構，包裹和保護細胞膜、蛋白質、核酸等生物大分子，防止它們在干旱條件下發(fā)生變性和降解。同時，海藻糖還可以調節(jié)植物的抗氧化系統(tǒng)，增強植物的抗氧化能力。棉子糖則參與植物的滲透調節(jié)和抗氧化防御。棉子糖可以通過調節(jié)細胞的滲透勢，維持細胞的水分平衡。此外，棉子糖還具有抗氧化作用，能夠清除細胞內的活性氧自由基，減輕干旱脅迫導致的氧化損傷。黃酮類化合物在黃芪適應干旱脅迫中也具有重要作用。在蒙古黃芪中，毛蕊異黃酮、芒柄花素等黃酮類化合物的含量分別上調了3.2倍和2.7倍。這些黃酮類物質具有較強的抗氧化活性，能夠清除干旱脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，減少氧化損傷。研究表明，黃酮類化合物可以通過提供氫原子，與活性氧自由基發(fā)生反應，將其轉化為相對穩(wěn)定的物質，從而減輕氧化損傷對細胞的破壞。同時，黃酮類化合物還可以調節(jié)植物的氣孔運動，減少水分散失。黃酮類化合物可以通過影響植物激素（如ABA）的信號傳導，調節(jié)氣孔的開閉。在干旱脅迫下，黃酮類化合物的積累可以促進ABA信號的傳導，使氣孔關閉，減少水分蒸發(fā)，提高植物的抗旱性。在膜莢黃芪中，蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物含量明顯升高，蘆丁含量增加了4.1倍，槲皮素含量增加了3.5倍。蘆丁和槲皮素具有多種生物活性，能夠增強植物的抗氧化能力和抗逆性。它們可以通過與細胞膜上的脂質相互作用，穩(wěn)定細胞膜的結構，減少水分滲漏。同時，蘆丁和槲皮素還可以調節(jié)植物體內的激素平衡，促進植物對干旱脅迫的適應。研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁和槲皮素可以調節(jié)植物激素（如生長素、細胞分裂素等）的合成和信號轉導，影響植物的生長發(fā)育和抗逆性。五、兩種黃芪響應不同脅迫的代謝基礎差異比較5.1兩種脅迫下代謝物響應的異同在UV-B和干旱脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪的代謝物響應既有相同點，也存在明顯差異。從相同點來看，兩種脅迫均誘導了黃酮類化合物的積累。在UV-B脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪中黃酮類生物合成途徑顯著富集，毛蕊異黃酮、芒柄花素等黃酮類化合物含量顯著增加。在干旱脅迫下，這兩種黃芪中的黃酮類化合物同樣大量積累，如蒙古黃芪中的毛蕊異黃酮、芒柄花素含量分別上調了3.2倍和2.7倍，膜莢黃芪中的蘆丁、槲皮素含量分別增加了4.1倍和3.5倍。黃酮類化合物具有抗氧化和吸收UV-B輻射的能力，在兩種脅迫下的積累均有助于黃芪抵御脅迫傷害。一方面，黃酮類化合物可以通過自身的酚羥基結構，清除脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，減輕氧化損傷。研究表明，毛蕊異黃酮能夠有效地清除超氧陰離子自由基（O_2^-）、羥自由基（\cdotOH）等，保護細胞內的生物大分子免受氧化破壞。另一方面，黃酮類化合物的共軛雙鍵結構使其能夠吸收UV-B輻射，將光能轉化為熱能釋放，避免細胞直接受到UV-B輻射的傷害。同時，在干旱脅迫下，黃酮類化合物還可以調節(jié)植物的氣孔運動，減少水分散失，提高植物的抗旱性。然而，兩種脅迫下代謝物響應也存在諸多差異。在糖類代謝方面，UV-B脅迫下主要表現(xiàn)為部分糖類參與能量代謝的調整，以滿足植物應對脅迫時的能量需求；而干旱脅迫下，糖類的變化更為顯著，多種糖類物質參與滲透調節(jié)。在蒙古黃芪干旱脅迫中，葡萄糖、果糖、蔗糖等單糖和二糖含量顯著上調，分別增加了2.3倍、2.1倍和1.8倍，這些糖類物質的積累可以降低細胞的滲透勢，促進水分吸收，維持細胞的膨壓和正常生理功能。在膜莢黃芪中，海藻糖、棉子糖等糖類含量顯著升高，海藻糖含量增加了3.5倍，棉子糖含量增加了2.8倍，海藻糖具有保濕和保護生物大分子的能力，棉子糖參與滲透調節(jié)和抗氧化防御，有助于膜莢黃芪抵御干旱脅迫。在氨基酸代謝方面，UV-B脅迫主要影響部分氨基酸及其衍生物的合成或代謝途徑，導致其含量發(fā)生變化；干旱脅迫下，脯氨酸等氨基酸的積累則成為重要的響應特征。在UV-B脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪中部分氨基酸及其衍生物含量降低，可能是由于UV-B輻射影響了氨基酸的合成或代謝途徑。而在干旱脅迫下，蒙古黃芪中脯氨酸含量急劇上升，是對照組的5.6倍，膜莢黃芪中脯氨酸含量也顯著升高，為對照組的4.8倍。脯氨酸作為重要的滲透調節(jié)物質，能夠調節(jié)細胞的滲透勢，保護細胞免受干旱脅迫的傷害，同時還具有抗氧化作用，可清除細胞內的活性氧自由基。此外，在干旱脅迫下，膜莢黃芪中鳥氨酸、精氨酸等脯氨酸合成途徑的前體物質含量增加，進一步促進了脯氨酸的合成，增強了膜莢黃芪對干旱脅迫的適應能力。5.2代謝通路差異分析在UV-B和干旱脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪的代謝通路響應存在明顯差異。在UV-B脅迫下，蒙古黃芪的黃酮類生物合成途徑和苯丙烷生物合成途徑顯著富集。黃酮類生物合成途徑中，查耳酮合酶（CHS）、查耳酮異構酶（CHI）、黃酮醇合酶（FLS）等關鍵酶基因表達上調，促進黃酮類化合物的合成，這些黃酮類物質能夠吸收UV-B輻射并清除活性氧自由基，保護植物細胞免受損傷。苯丙烷生物合成途徑中，參與木質素合成的關鍵酶基因表達上調，增加木質素合成，增強細胞壁機械強度，提高對UV-B脅迫的耐受性。膜莢黃芪在UV-B脅迫下，黃酮類生物合成途徑同樣顯著富集，關鍵酶基因表達上調促進黃酮類化合物積累。此外，萜類骨架生物合成途徑也顯著富集，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（DXR）等關鍵酶基因表達上調，促進萜類化合物合成，萜類化合物具有揮發(fā)性，可作為信號分子調節(jié)植物生理過程，增強對UV-B脅迫的響應。在干旱脅迫下，蒙古黃芪的植物激素信號轉導通路和黃酮類生物合成途徑顯著富集。植物激素信號轉導通路中，脫落酸（ABA）合成途徑關鍵酶9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）基因表達上調，ABA含量增加，調節(jié)氣孔運動，減少水分散失，并誘導干旱響應基因表達。生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）等激素信號通路也受到影響，調節(jié)植物生長和抗逆性。黃酮類生物合成途徑中，關鍵酶基因表達上調，黃酮類化合物積累，清除活性氧自由基，調節(jié)氣孔運動，提高抗旱性。膜莢黃芪在干旱脅迫下，淀粉和蔗糖代謝通路以及脯氨酸代謝通路顯著富集。淀粉和蔗糖代謝通路中，蔗糖合成酶（SUS）基因表達上調，淀粉合成酶（SS）基因表達下調，淀粉分解為小分子糖類，如葡萄糖和果糖，滿足植物對能量和滲透調節(jié)物質的需求，維持細胞滲透勢和正常生理功能。脯氨酸代謝通路中，鳥氨酸-δ-氨基轉移酶（OAT）基因表達上調，促進脯氨酸合成，脯氨酸作為滲透調節(jié)物質，調節(jié)細胞滲透勢，清除活性氧自由基，保護細胞免受干旱脅迫傷害?？傮w而言，UV-B脅迫主要誘導與抗氧化、吸收UV-B輻射和增強細胞壁相關的代謝通路變化；干旱脅迫則主要引發(fā)與滲透調節(jié)、植物激素信號傳導和抗氧化相關的代謝通路響應。這些差異表明，黃芪在應對不同脅迫時，通過激活不同的代謝通路來適應環(huán)境變化，以維持自身的生長和發(fā)育。5.3關鍵代謝物的特異性與共性通過對UV-B和干旱脅迫下蒙古黃芪和膜莢黃芪代謝組學數(shù)據(jù)的深入分析，確定了在兩種脅迫下均重要的關鍵代謝物，以及僅對特定脅迫響應的代謝物。在兩種脅迫下均發(fā)揮重要作用的關鍵代謝物主要為黃酮類化合物。如毛蕊異黃酮和芒柄花素，在UV-B和干旱脅迫下，蒙古黃芪和膜莢黃芪中這兩種黃酮類化合物的含量均顯著增加。毛蕊異黃酮和芒柄花素具有多個酚羥基和共軛雙鍵結構，使其既能夠有效地清除脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，減輕氧化損傷，又能夠吸收UV-B輻射，將光能轉化為熱能釋放，保護細胞內的生物大分子免受傷害。在UV-B脅迫下，黃酮類化合物通過吸收UV-B輻射，避免細胞直接受到輻射損傷；在干旱脅迫下，它們則通過清除活性氧自由基，減少氧化損傷，同時調節(jié)氣孔運動，減少水分散失，提高植物的抗旱性。這種在兩種脅迫下的共性響應表明，黃酮類化合物是黃芪應對非生物脅迫的重要防御物質，在維持黃芪的生長和生存中發(fā)揮著關鍵作用。僅對UV-B脅迫響應的代謝物主要涉及與細胞壁強化和UV-B輻射吸收相關的物質。在蒙古黃芪中，木質素合成相關的代謝物在UV-B脅迫下顯著變化。如肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）等關鍵酶參與的代謝途徑，導致木質素合成增加。木質素是植物細胞壁的重要組成成分，其含量的增加可以增強細胞壁的機械強度，提高植物對UV-B脅迫的耐受性。此外，一些特殊的黃酮類糖苷衍生物，如毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷等，在UV-B脅迫下特異性上調。這些黃酮類糖苷衍生物可能具有更強的UV-B吸收能力或抗氧化活性，進一步增強了黃芪對UV-B脅迫的抵御能力。在膜莢黃芪中，萜類化合物是響應UV-B脅迫的特異性代謝物之一。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（DXR）等關鍵酶基因表達上調，促進了萜類化合物的合成。萜類化合物具有揮發(fā)性，可作為信號分子調節(jié)植物生理過程，增強對UV-B脅迫的響應。同時，某些萜類化合物還具有抗菌、抗氧化等活性，有助于膜莢黃芪抵御UV-B脅迫帶來的損傷。僅對干旱脅迫響應的代謝物主要集中在滲透調節(jié)和植物激素信號傳導相關物質。在蒙古黃芪中，脯氨酸作為重要的滲透調節(jié)物質，在干旱脅迫下含量急劇上升，是對照組的5.6倍。脯氨酸具有高度的水溶性和低毒性，能夠有效地調節(jié)細胞的滲透勢，保護細胞免受干旱脅迫的傷害。同時，脯氨酸還具有抗氧化作用，能夠清除細胞內的活性氧自由基，減輕干旱脅迫導致的氧化損傷。此外，植物激素脫落酸（ABA）在干旱脅迫下含量顯著增加。ABA通過與受體結合，激活下游信號傳導途徑，調節(jié)氣孔運動，使氣孔關閉，減少水分散失。同時，ABA還能誘導一些干旱響應基因的表達，增強植物的抗旱性。在膜莢黃芪中，海藻糖、棉子糖等糖類物質是響應干旱脅迫的特異性代謝物。海藻糖具有很強的保濕和保護生物大分子的能力，能夠在干旱條件下穩(wěn)定細胞膜和蛋白質結構，減少細胞損傷；棉子糖參與滲透調節(jié)和抗氧化防御，有助于膜莢黃芪抵御干旱脅迫。此外，膜莢黃芪中鳥氨酸、精氨酸等脯氨酸合成途徑的前體物質含量在干旱脅迫下增加，進一步促進了脯氨酸的合成，增強了膜莢黃芪對干旱脅迫的適應能力。5.4基于代謝差異的脅迫適應策略探討從代謝差異角度深入探討，蒙古黃芪和膜莢黃芪在應對UV-B和干旱脅迫時展現(xiàn)出獨特的適應策略，同時也存在一些共性機制。蒙古黃芪在UV-B脅迫下，高度依賴黃酮類生物合成途徑和苯丙烷生物合成途徑。通過上調黃酮類生物合成途徑中查耳酮合酶（CHS）、查耳酮異構酶（CHI）、黃酮醇合酶（FLS）等關鍵酶基因的表達，大量合成黃酮類化合物。這些黃酮類物質憑借其特殊的分子結構，既能吸收UV-B輻射，將光能轉化為熱能釋放，避免細胞內生物大