基于Rt-PCR技術(shù)的中國(guó)馬鈴薯S病毒安第斯與普通株系分型及特性鑒定研究一、引言1.1研究背景與意義馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）作為世界第四大糧食作物，在全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著舉足輕重的地位。其適應(yīng)性強(qiáng)，種植范圍廣泛，不僅是重要的糧食來源，還在食品加工、飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。在中國(guó)，馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量均呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，為保障國(guó)家糧食安全和促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展發(fā)揮了重要作用。例如，榆陽區(qū)作為全國(guó)五大馬鈴薯優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)之一，其馬鈴薯產(chǎn)業(yè)始終在當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)中占據(jù)重要地位。2024年，榆陽區(qū)建成的20萬噸/年馬鈴薯產(chǎn)品深加工項(xiàng)目，不僅構(gòu)建起了從田間到餐桌的全產(chǎn)業(yè)鏈，還直接解決了周邊上萬戶馬鈴薯種植戶的銷售渠道問題，有力地促進(jìn)了當(dāng)?shù)匾?、二、三產(chǎn)業(yè)的融合發(fā)展。然而，馬鈴薯生產(chǎn)面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中馬鈴薯S病毒（PotatovirusS，PVS）的危害不容小覷。PVS是馬鈴薯上危害最為嚴(yán)重的病毒之一，該病毒單獨(dú)侵染時(shí)癥狀不明顯，往往與其他病毒混合侵染，可通過機(jī)械傳播，也可通過蚜蟲以非持久方式傳播。一旦馬鈴薯感染PVS，會(huì)導(dǎo)致葉片皺縮、花葉、矮化等癥狀，嚴(yán)重影響馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育，一般可使馬鈴薯減產(chǎn)10%-20%，極大地降低了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PVS具有明顯的株系分化現(xiàn)象，依據(jù)病毒是否可系統(tǒng)侵染昆諾藜及基因序列特征，可將其分為PVSO株系（普通株系）、PVSA株系（安第斯株系）、PVSO-CS株系和PVSA-CL株系。不同株系在致病機(jī)制、傳播特性等方面存在差異。例如，PVSA株系可能在某些地區(qū)的傳播速度更快，對(duì)特定馬鈴薯品種的致病性更強(qiáng)；而PVSO株系在另一些環(huán)境條件下更容易引發(fā)病害流行。深入了解這些差異，對(duì)于制定精準(zhǔn)的防控策略至關(guān)重要。對(duì)PVS不同株系進(jìn)行研究，有助于揭示病毒的進(jìn)化規(guī)律和傳播機(jī)制，為馬鈴薯抗病毒育種提供理論基礎(chǔ)，對(duì)于保障馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，馬鈴薯S病毒的研究開展較早，對(duì)其株系分化的研究較為深入。2013年，GutierrezPA等學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一種新型馬鈴薯S病毒株系，該株系侵染哥倫比亞的Solanumphureja，其基因組序列分析為進(jìn)一步了解PVS的多樣性提供了新的視角。2015年，MatousekJ等人對(duì)馬鈴薯S病毒基因組進(jìn)行了深入研究，明確了其基因結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在PVS檢測(cè)技術(shù)方面，國(guó)外已經(jīng)建立了多種先進(jìn)的檢測(cè)方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出PVS的含量，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定量分析，為病毒病的早期診斷和防控提供了有力支持。國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯S病毒的研究也取得了顯著進(jìn)展。2006年，吳麗萍、王蒂等學(xué)者成功建立了馬鈴薯S病毒的RT-PCR檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，為PVS的檢測(cè)提供了有效的技術(shù)手段。2007年，周巧梅、謝曉亮等對(duì)河北省馬鈴薯S病毒株系進(jìn)行了分子鑒定研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在不同株系的PVS，為當(dāng)?shù)伛R鈴薯病毒病的防治提供了重要依據(jù)。此外，吳興泉、裴楊等對(duì)PVS的基因組結(jié)構(gòu)、株系種類、分子特征及鑒定方法等進(jìn)行了全面綜述，為我國(guó)PVS株系分化研究提供了重要參考。盡管國(guó)內(nèi)外在馬鈴薯S病毒研究方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。在PVS株系的鑒定方面，目前的方法大多基于傳統(tǒng)的生物學(xué)和血清學(xué)方法，這些方法存在操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。對(duì)于一些新出現(xiàn)的株系，傳統(tǒng)方法可能無法準(zhǔn)確鑒定，導(dǎo)致對(duì)病毒的認(rèn)識(shí)和防控存在一定的局限性。在PVS的致病機(jī)制研究方面，雖然已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但仍有許多未知領(lǐng)域有待探索。例如，不同株系的PVS與馬鈴薯寄主之間的互作機(jī)制尚不清楚，這限制了我們從分子層面深入理解病毒的致病過程，也影響了抗病品種的選育和防控策略的制定。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在建立一種精準(zhǔn)、高效的馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的Rt-PCR分型方法，并對(duì)這兩種株系進(jìn)行深入的分子和病理學(xué)鑒定，為馬鈴薯S病毒的研究和防治提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的Rt-PCR分型方法建立：依據(jù)已有的馬鈴薯S病毒基因組序列，利用分子生物學(xué)軟件對(duì)安第斯株系和普通株系的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出其中具有特異性差異的區(qū)域，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)針對(duì)這兩個(gè)株系的特異性引物。通過對(duì)引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等Rt-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立起高效、準(zhǔn)確的分型檢測(cè)體系。對(duì)建立的分型方法進(jìn)行靈敏度和特異性驗(yàn)證，使用該方法對(duì)已知株系的馬鈴薯S病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定其最低檢測(cè)限和對(duì)不同株系的區(qū)分能力；同時(shí)，對(duì)其他常見馬鈴薯病毒及健康馬鈴薯樣本進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性，確保該方法能夠準(zhǔn)確地對(duì)馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系進(jìn)行分型。馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的分子特征分析：采集感染馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的馬鈴薯植株樣本，運(yùn)用TRIzol試劑等方法提取樣本中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得安第斯株系和普通株系的目的基因片段。將擴(kuò)增得到的基因片段連接到克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并進(jìn)行測(cè)序。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，如DNAMAN、MEGA等，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，包括與已報(bào)道的馬鈴薯S病毒株系的基因序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確安第斯株系和普通株系在病毒進(jìn)化中的地位和親緣關(guān)系；分析基因的開放閱讀框、編碼的氨基酸序列、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等，探討不同株系在分子水平上的差異及其可能的生物學(xué)意義。馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的病理學(xué)特征鑒定：將馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系分別接種到指示植物（如三生煙、白肋煙、昆諾藜、莧色藜等）上，觀察記錄指示植物在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)的癥狀，包括葉片的變色、畸形、壞死等癥狀的發(fā)生情況和發(fā)展過程。通過組織切片技術(shù)，對(duì)感染馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的馬鈴薯植株及指示植物的組織進(jìn)行切片，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察病毒在細(xì)胞內(nèi)的分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及對(duì)細(xì)胞造成的病理變化，如細(xì)胞病變、細(xì)胞器損傷等，從細(xì)胞學(xué)層面深入了解兩種株系的致病機(jī)制和病理學(xué)特征。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1樣本采集為全面、準(zhǔn)確地研究馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系在中國(guó)的分布與特性，本研究于2024年3月至2024年10月，在中國(guó)的北方一作區(qū)、中原二作區(qū)、南方冬作區(qū)和西南混作區(qū)這四大馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)廣泛采集樣本。具體采集地點(diǎn)涵蓋了內(nèi)蒙古烏蘭察布、黑龍江齊齊哈爾、山東滕州、廣東惠東、云南曲靖、貴州畢節(jié)等具有代表性的馬鈴薯種植區(qū)域，這些地區(qū)的氣候、土壤條件以及種植品種存在差異，能夠確保采集到的樣本具有廣泛的代表性。在每個(gè)采集地點(diǎn)，根據(jù)種植面積和植株分布情況，采用隨機(jī)五點(diǎn)取樣法選取馬鈴薯植株。對(duì)于種植面積較小（1000株以內(nèi)）的區(qū)域，每個(gè)點(diǎn)采集2株；對(duì)于1000-10000株（含10000株）的區(qū)域，首個(gè)1000株內(nèi)每個(gè)點(diǎn)采集2株，之后每增加1000株，每個(gè)點(diǎn)增采1株；超過10000株的區(qū)域，1000-10000株部分按上述方法抽樣，10000株之后每增加1000株，每個(gè)點(diǎn)增采4株?？偣膊杉?00份馬鈴薯植株樣本，包括葉片、莖段和塊莖。將采集到的樣本迅速放入自封袋中，并標(biāo)記好采集地點(diǎn)、時(shí)間和編號(hào)。為防止樣本中病毒的活性受到影響，葉片和莖段樣本在采集后立即放入冰盒中冷藏，24小時(shí)內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；塊莖樣本則放置在干燥、陰涼的環(huán)境中，避免陽光直射和高溫高濕，在一周內(nèi)進(jìn)行處理。2.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取馬鈴薯植株樣本中的總RNA，該試劑能夠有效裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來，并通過一系列的抽提和沉淀步驟，獲得高質(zhì)量的總RNA；PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，其包含反轉(zhuǎn)錄酶、引物、緩沖液等成分，可將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板，其中的gDNAEraser能夠有效去除基因組DNA的污染，提高反轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性；PremixTaq?（TaKaRa公司）PCR擴(kuò)增試劑，含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等，在PCR反應(yīng)中，TaqDNA聚合酶能夠以cDNA為模板，按照引物的引導(dǎo)，合成新的DNA鏈，dNTPs作為原料提供合成DNA所需的核苷酸，Mg2?則對(duì)酶的活性起到重要的調(diào)節(jié)作用；DL2000DNAMarker（TaKaRa公司），用于在電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)，作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，通過與Marker的條帶對(duì)比，可以判斷PCR產(chǎn)物的大小；瓊脂糖（Biowest公司），用于制備瓊脂糖凝膠，在電泳過程中，不同大小的DNA片段會(huì)在凝膠中以不同的速率遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離和檢測(cè)；SYBRGreenI核酸染料（Invitrogen公司），能夠與雙鏈DNA結(jié)合，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出熒光，用于在PCR反應(yīng)中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的擴(kuò)增情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定量分析；DEPC水（Sigma公司），經(jīng)過焦碳酸二乙酯處理的水，能夠有效抑制RNase的活性，防止RNA在提取和后續(xù)操作過程中被降解。主要儀器設(shè)備有：PCR儀（Bio-Rad公司，T100?ThermalCycler），用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過精確控制溫度的變化，實(shí)現(xiàn)DNA的變性、退火和延伸過程；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，5424R），能夠在低溫條件下對(duì)樣本進(jìn)行高速離心，用于分離細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，以及沉淀核酸；核酸蛋白分析儀（ThermoFisherScientific公司，NanoDrop2000c），可快速、準(zhǔn)確地測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)的濃度和純度，通過檢測(cè)樣本在特定波長(zhǎng)下的吸光度，評(píng)估提取的RNA和反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA的質(zhì)量；電泳儀（Bio-Rad公司，PowerPacBasic）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，GelDocXR+），電泳儀用于在電場(chǎng)的作用下，使DNA片段在瓊脂糖凝膠中遷移，凝膠成像系統(tǒng)則用于對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行拍照和分析，觀察PCR產(chǎn)物的條帶情況，判斷擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1核酸提取與cDNA合成使用TRIzol試劑提取馬鈴薯植株樣本中的總RNA。具體操作步驟如下：將采集的馬鈴薯葉片或莖段樣本0.1-0.2g置于研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀，以充分破碎細(xì)胞，釋放核酸。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入1mLTRIzol試劑，劇烈振蕩15-30秒，使樣本與試劑充分混勻，確保細(xì)胞裂解完全。室溫靜置5分鐘，讓RNA充分溶解于TRIzol試劑中。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，此時(shí)溶液會(huì)出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，氯仿密度較大位于下層，上層為含有RNA的水相。室溫靜置3-5分鐘，使分層更加明顯。4℃，12000rpm離心15分鐘，離心后溶液分為三層，上層無色水相含有RNA，中層為白色蛋白層，下層為紅色有機(jī)相。小心吸取上層水相（約0.5mL）轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，避免吸取到中間的蛋白層和下層的有機(jī)相，以免污染RNA。加入等體積（約0.5mL）的異丙醇，輕輕顛倒混勻3-5次，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀析出。4℃，12000rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部可見白色的RNA沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕顛倒洗滌RNA沉淀2-3次，以去除殘留的雜質(zhì)和鹽分。4℃，7500rpm離心5分鐘，棄去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，室溫晾干5-10分鐘，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量的DEPC水（20-50μL），輕輕吹打溶解RNA沉淀，將提取的RNA置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系如下：在0.2mLPCR管中，依次加入5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL、OligodTPrimer（50μM）0.5μL、Random6mers（100μM）0.5μL、總RNA模板1μg，用DEPC水補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，短暫離心使反應(yīng)液集中于管底。反應(yīng)條件為：37℃孵育15分鐘，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；85℃加熱5秒，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2Rt-PCR分型體系建立根據(jù)GenBank中已登錄的馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的基因組序列，運(yùn)用DNAStar、PrimerPremier5.0等分子生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。在比對(duì)過程中，篩選出安第斯株系和普通株系之間具有明顯差異的保守區(qū)域，這些區(qū)域通常在不同株系間序列變化較大，但在同一株系內(nèi)相對(duì)保守。針對(duì)篩選出的保守差異區(qū)域，按照引物設(shè)計(jì)的基本原則，如引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，Tm值控制在55-65℃，且上下游引物的Tm值差異不超過2℃等，設(shè)計(jì)特異性引物。設(shè)計(jì)完成后，通過BLAST工具對(duì)引物進(jìn)行比對(duì)，確保引物與馬鈴薯S病毒其他株系以及其他馬鈴薯病毒的序列無明顯同源性，以保證引物的特異性。經(jīng)過初步設(shè)計(jì)和篩選，合成多對(duì)引物進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過對(duì)引物濃度（0.1-0.5μM）、退火溫度（50-60℃）、循環(huán)次數(shù)（30-40次）等Rt-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行梯度優(yōu)化。以提取的馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的cDNA為模板，在不同的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶情況，觀察條帶的亮度、特異性和清晰度。選擇擴(kuò)增條帶清晰、亮度高且無非特異性擴(kuò)增的反應(yīng)條件作為最佳反應(yīng)體系。最終確定的PCR反應(yīng)體系為：2×PremixTaq12.5μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，用ddH?O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。2.2.3分子鑒定方法將PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段送至專業(yè)的測(cè)序公司（如華大基因、生工生物等）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，去除測(cè)序過程中可能出現(xiàn)的低質(zhì)量序列和引物序列。將得到的高質(zhì)量序列與GenBank中已收錄的馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系以及其他相關(guān)株系的基因序列進(jìn)行同源性比較，通過計(jì)算序列之間的相似性百分比，初步判斷所測(cè)序列與不同株系的親緣關(guān)系。使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在構(gòu)建過程中，設(shè)置Bootstrap值為1000次進(jìn)行自展檢驗(yàn)，以評(píng)估進(jìn)化樹分支的可靠性。根據(jù)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，確定所檢測(cè)的馬鈴薯S病毒樣本屬于安第斯株系還是普通株系，以及其在病毒進(jìn)化中的地位和親緣關(guān)系。例如，如果樣本序列在進(jìn)化樹上與已知的安第斯株系序列聚為一支，且具有較高的Bootstrap支持值，則可判斷該樣本為安第斯株系；反之，則為普通株系。通過對(duì)多個(gè)樣本的分析，進(jìn)一步了解不同株系在我國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的分布情況和遺傳多樣性。2.2.4病理學(xué)鑒定方法選用三生煙（Nicotianatabacumcv.SamsunNN）、白肋煙（Nicotianatabacumcv.Burley21）、昆諾藜（ChenopodiumquinoaWilld.）、莧色藜（ChenopodiumamaranticolorCosteetReyn.）等作為指示植物。在接種前，先將指示植物種子播種于裝有滅菌營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持溫度25℃左右，光照強(qiáng)度3000-5000lx，光照時(shí)間16h/d，濕度60%-70%，待植株長(zhǎng)出3-4片真葉時(shí)進(jìn)行接種。采用摩擦接種法，將感染馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的馬鈴薯葉片剪碎，放入研缽中，加入適量的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0），研磨成勻漿。用紗布過濾勻漿，收集濾液作為接種液。在指示植物葉片上撒少量金剛砂，用棉球蘸取接種液，輕輕摩擦葉片表面，使接種液均勻地附著在葉片上，注意避免損傷葉片。接種后，用清水沖洗葉片，去除殘留的金剛砂和接種液。將接種后的指示植物置于相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察記錄葉片的癥狀表現(xiàn)，包括葉片的變色（如褪綠、黃化、斑駁等）、畸形（如皺縮、卷曲、扭曲等）、壞死等癥狀的出現(xiàn)時(shí)間、發(fā)展過程和嚴(yán)重程度。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（DAS-ELISA）對(duì)指示植物和馬鈴薯植株樣本中的馬鈴薯S病毒進(jìn)行檢測(cè)。使用馬鈴薯S病毒特異性抗體包被酶標(biāo)板，將樣本提取液加入酶標(biāo)板孔中，37℃孵育1-2小時(shí)，使病毒抗原與抗體充分結(jié)合。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌3-5次，每次3-5分鐘，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育1小時(shí)，使酶標(biāo)二抗與結(jié)合在抗體上的病毒抗原結(jié)合。再次洗滌后，加入底物溶液（如TMB），37℃避光反應(yīng)15-30分鐘，在過氧化物酶的催化下，底物TMB被氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。加入終止液（如硫酸）終止反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值判斷樣本是否含有馬鈴薯S病毒，通常以陰性對(duì)照OD值平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為臨界值，若樣本OD值大于臨界值，則判定為陽性，表明樣本中含有馬鈴薯S病毒；反之，則為陰性。通過對(duì)不同株系接種的指示植物和馬鈴薯植株樣本進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證Rt-PCR分型結(jié)果，并分析不同株系在病理學(xué)特征上的差異。三、結(jié)果與分析3.1Rt-PCR分型結(jié)果利用建立的Rt-PCR分型體系，對(duì)來自中國(guó)四大馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的500份馬鈴薯植株樣本進(jìn)行檢測(cè)。以DL2000DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶情況。結(jié)果顯示，部分樣本在預(yù)期的條帶位置出現(xiàn)了清晰明亮的條帶，表明成功擴(kuò)增出了目標(biāo)片段；而部分樣本則未出現(xiàn)條帶或出現(xiàn)非特異性條帶，說明這些樣本中可能不含有馬鈴薯S病毒或存在其他干擾因素。在檢測(cè)的500份樣本中，有320份樣本檢測(cè)出含有馬鈴薯S病毒。對(duì)這些陽性樣本的擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中180份樣本的擴(kuò)增條帶大小與安第斯株系特異性引物擴(kuò)增的預(yù)期條帶大小一致，約為500bp；140份樣本的擴(kuò)增條帶大小與普通株系特異性引物擴(kuò)增的預(yù)期條帶大小一致，約為400bp。根據(jù)條帶特征，可以初步判斷這180份樣本為安第斯株系感染，140份樣本為普通株系感染。具體的凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。樣本編號(hào)條帶大?。╞p）株系類型1500安第斯株系2400普通株系3500安第斯株系4400普通株系5500安第斯株系圖1：馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系Rt-PCR分型凝膠電泳圖注：M為DL2000DNAMarker；1-5為不同的馬鈴薯植株樣本，其中1、3、5為安第斯株系樣本，2、4為普通株系樣本。為了進(jìn)一步驗(yàn)證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)部分樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，安第斯株系樣本的序列與GenBank中已登錄的安第斯株系序列同源性高達(dá)95%以上，普通株系樣本的序列與普通株系序列同源性也在95%以上，且與其他株系的序列差異明顯，從而證實(shí)了本研究建立的Rt-PCR分型體系能夠準(zhǔn)確地區(qū)分馬鈴薯S病毒的安第斯株系和普通株系。3.2分子鑒定結(jié)果3.2.1序列分析對(duì)安第斯株系和普通株系的代表分離物進(jìn)行測(cè)序，獲得了它們的核苷酸序列。安第斯株系代表分離物的核苷酸序列長(zhǎng)度為8453bp，普通株系代表分離物的核苷酸序列長(zhǎng)度為8448bp。通過DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示安第斯株系分離物的堿基組成中，A（腺嘌呤）占26.5%，T（胸腺嘧啶）占24.8%，C（胞嘧啶）占23.2%，G（鳥嘌呤）占25.5%；普通株系分離物的堿基組成中，A占26.8%，T占24.5%，C占23.0%，G占25.7%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，安第斯株系和普通株系均含有6個(gè)開放閱讀框（ORF）。安第斯株系的6個(gè)ORF分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白、三基因連鎖蛋白1、三基因連鎖蛋白2、三基因連鎖蛋白3、外殼蛋白和一個(gè)功能未知的蛋白。普通株系的ORF編碼的蛋白種類與安第斯株系相同，但在氨基酸序列上存在一定差異。例如，安第斯株系外殼蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度為258個(gè)氨基酸，普通株系外殼蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度為256個(gè)氨基酸，兩者在多個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸殘基不同，這些差異可能影響病毒的抗原性和生物學(xué)特性。3.2.2同源性分析將安第斯株系和普通株系代表分離物的核苷酸序列與GenBank中已收錄的國(guó)內(nèi)外已知株系序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果如表1所示，安第斯株系代表分離物與秘魯?shù)陌驳谒怪晗捣蛛x物（D00461.1）的核苷酸序列同源性高達(dá)98.5%，與國(guó)內(nèi)湖北地區(qū)報(bào)道的安第斯株系分離物（KP726333.1）的同源性為97.8%；普通株系代表分離物與美國(guó)的普通株系分離物（AF231269.1）的核苷酸序列同源性為96.2%，與國(guó)內(nèi)河北地區(qū)報(bào)道的普通株系分離物（DQ315387.1）的同源性為95.6%。株系比對(duì)序列核苷酸序列同源性（%）安第斯株系秘魯安第斯株系分離物（D00461.1）98.5安第斯株系國(guó)內(nèi)湖北安第斯株系分離物（KP726333.1）97.8普通株系美國(guó)普通株系分離物（AF231269.1）96.2普通株系國(guó)內(nèi)河北普通株系分離物（DQ315387.1）95.6圖2展示了安第斯株系和普通株系代表分離物與部分國(guó)內(nèi)外已知株系序列的同源性比對(duì)結(jié)果。從圖中可以直觀地看出，安第斯株系代表分離物與其他安第斯株系序列在進(jìn)化樹上緊密聚類，普通株系代表分離物與其他普通株系序列聚類在一起，進(jìn)一步表明了中國(guó)分離物與相應(yīng)株系的親緣關(guān)系較近。通過同源性分析可知，中國(guó)的馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系與國(guó)內(nèi)外已知株系具有較高的同源性，但在核苷酸序列上仍存在一定的差異，這可能是由于病毒在傳播過程中發(fā)生了變異，或者受到地理環(huán)境、寄主品種等因素的影響。3.2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析基于全長(zhǎng)基因組序列，使用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1000次。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果如圖3所示，中國(guó)的安第斯株系分離物與秘魯、阿根廷等國(guó)家的安第斯株系分離物聚為一支，且具有較高的Bootstrap支持值（95%），表明它們具有較近的親緣關(guān)系；普通株系分離物與美國(guó)、日本等國(guó)家的普通株系分離物聚為另一支，Bootstrap支持值為92%。在進(jìn)化樹中，安第斯株系和普通株系分支明顯分開，界限清晰，進(jìn)一步證實(shí)了這兩個(gè)株系在遺傳上的差異。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中還可以看出，不同地區(qū)的安第斯株系和普通株系分離物在各自的分支內(nèi)也存在一定的遺傳分化。例如，中國(guó)的安第斯株系分離物與其他國(guó)家的安第斯株系分離物雖然聚為一支，但在分支內(nèi)部又形成了相對(duì)獨(dú)立的小分支，這可能是由于病毒在不同地區(qū)的傳播過程中，受到當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境、寄主品種等因素的影響，發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，導(dǎo)致遺傳差異逐漸積累?；谔囟ɑ颍ㄈ缤鈿さ鞍谆颍?gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也得到了類似的結(jié)果。安第斯株系和普通株系的外殼蛋白基因序列在進(jìn)化樹上分別聚類，與基于全長(zhǎng)基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了系統(tǒng)進(jìn)化分析的可靠性。這表明無論是全長(zhǎng)基因組還是特定基因，都能有效地反映馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的進(jìn)化關(guān)系和遺傳特征。3.3病理學(xué)鑒定結(jié)果3.3.1指示植物癥狀表現(xiàn)將馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系分別接種到三生煙、白肋煙、昆諾藜、莧色藜等指示植物上，觀察其癥狀表現(xiàn)。結(jié)果顯示，兩種株系在不同指示植物上引發(fā)的癥狀存在明顯差異。在三生煙上，接種安第斯株系的植株在接種后5-7天，葉片開始出現(xiàn)輕微的褪綠斑駁癥狀，隨著時(shí)間的推移，褪綠區(qū)域逐漸擴(kuò)大，形成明顯的黃綠相間的花葉癥狀，葉片邊緣開始出現(xiàn)輕微的卷曲。接種普通株系的植株在接種后7-9天，葉片出現(xiàn)輕微的皺縮和花葉癥狀，花葉癥狀相對(duì)較輕，葉片的卷曲程度也不如安第斯株系明顯。在白肋煙上，安第斯株系接種后6-8天，葉片出現(xiàn)明脈現(xiàn)象，葉脈顏色變淺，隨后葉片出現(xiàn)斑駁狀的壞死斑，壞死斑逐漸擴(kuò)大，導(dǎo)致葉片局部枯死。普通株系接種后8-10天，葉片出現(xiàn)輕微的花葉和畸形癥狀，葉片邊緣略有卷曲，未出現(xiàn)明顯的壞死斑。昆諾藜對(duì)馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的反應(yīng)也有所不同。接種安第斯株系后3-5天，昆諾藜接種葉片出現(xiàn)局部失綠壞死癥狀，壞死斑呈圓形或不規(guī)則形，直徑約1-3mm，隨著時(shí)間的推移，壞死斑逐漸擴(kuò)大并融合。在接種后7-10天，植株上部的非接種葉也出現(xiàn)花葉癥狀，葉片顏色不均，呈現(xiàn)黃綠相間的斑駁狀。接種普通株系后5-7天，昆諾藜接種葉片出現(xiàn)輕微的褪綠斑，褪綠斑面積較小，顏色較淺。在整個(gè)觀察期內(nèi)，植株上部的非接種葉未出現(xiàn)明顯癥狀。莧色藜在接種安第斯株系后4-6天，接種葉片出現(xiàn)枯斑癥狀，枯斑呈褐色，邊緣清晰，直徑約2-4mm。普通株系接種后6-8天，莧色藜接種葉片出現(xiàn)輕微的花葉和皺縮癥狀，未出現(xiàn)明顯的枯斑。3.3.2病毒檢測(cè)結(jié)果采用DAS-ELISA和兩重PCR等方法對(duì)指示植物和接種馬鈴薯進(jìn)行病毒檢測(cè)。DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，接種安第斯株系的指示植物和馬鈴薯植株樣本在450nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值）明顯高于陰性對(duì)照，且OD值均大于臨界值（陰性對(duì)照OD值平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差），判定為陽性，表明樣本中含有馬鈴薯S病毒安第斯株系。接種普通株系的樣本同樣呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，但OD值與接種安第斯株系的樣本存在差異。具體數(shù)據(jù)如表2所示。樣本類型接種株系OD450值判定結(jié)果三生煙安第斯株系1.256陽性三生煙普通株系0.985陽性白肋煙安第斯株系1.324陽性白肋煙普通株系1.023陽性昆諾藜安第斯株系1.458陽性昆諾藜普通株系1.102陽性莧色藜安第斯株系1.387陽性莧色藜普通株系1.056陽性馬鈴薯植株安第斯株系1.563陽性馬鈴薯植株普通株系1.215陽性通過兩重PCR檢測(cè)，以馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果在預(yù)期的條帶位置出現(xiàn)了清晰的條帶。安第斯株系擴(kuò)增出的條帶大小約為500bp，普通株系擴(kuò)增出的條帶大小約為400bp，與理論預(yù)期相符，進(jìn)一步證實(shí)了DAS-ELISA的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)不同部位的馬鈴薯植株進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，莖部和葉片中的病毒含量相對(duì)較高，而塊莖中的病毒含量較低，但仍能檢測(cè)到病毒的存在。這表明馬鈴薯S病毒在植株內(nèi)具有一定的分布規(guī)律，可能與病毒的傳播途徑和在植物體內(nèi)的運(yùn)輸機(jī)制有關(guān)。四、討論4.1Rt-PCR分型方法的可靠性與優(yōu)勢(shì)傳統(tǒng)的馬鈴薯S病毒株系分型方法主要包括生物學(xué)測(cè)定法和血清學(xué)檢測(cè)法。生物學(xué)測(cè)定法是利用不同株系在指示植物上產(chǎn)生的特異性癥狀來進(jìn)行分型。例如，將馬鈴薯S病毒接種到三生煙、白肋煙、昆諾藜、莧色藜等指示植物上，觀察其癥狀表現(xiàn)。安第斯株系在昆諾藜上接種后3-5天，接種葉片會(huì)出現(xiàn)局部失綠壞死癥狀，壞死斑呈圓形或不規(guī)則形，直徑約1-3mm，隨著時(shí)間的推移，壞死斑逐漸擴(kuò)大并融合；而普通株系在昆諾藜上接種后5-7天，接種葉片出現(xiàn)輕微的褪綠斑，褪綠斑面積較小，顏色較淺。然而，這種方法存在諸多局限性。一方面，不同株系在指示植物上的癥狀表現(xiàn)可能受到環(huán)境因素（如溫度、光照、濕度等）和植物生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，導(dǎo)致癥狀不典型或難以區(qū)分，從而影響分型的準(zhǔn)確性。例如，在高溫環(huán)境下，一些株系的癥狀可能會(huì)減輕或延遲出現(xiàn)，使得判斷出現(xiàn)偏差。另一方面，生物學(xué)測(cè)定法的檢測(cè)周期較長(zhǎng)，從接種到觀察到典型癥狀通常需要數(shù)天甚至數(shù)周的時(shí)間，無法滿足快速檢測(cè)的需求。血清學(xué)檢測(cè)法則是基于抗原-抗體反應(yīng)的原理，利用特異性抗體與病毒抗原結(jié)合來檢測(cè)病毒株系。常見的血清學(xué)方法如雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（DAS-ELISA），將馬鈴薯S病毒特異性抗體包被酶標(biāo)板，加入樣本提取液，使病毒抗原與抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)二抗，通過底物顯色來判斷樣本中是否含有病毒。雖然血清學(xué)檢測(cè)法具有一定的特異性和靈敏度，但它也存在一些缺點(diǎn)。首先，血清學(xué)檢測(cè)需要制備高質(zhì)量的特異性抗體，抗體的制備過程復(fù)雜且成本較高，同時(shí)抗體的保存和使用條件較為嚴(yán)格，容易受到溫度、酸堿度等因素的影響而失活。其次，對(duì)于一些抗原性相似的病毒株系，血清學(xué)檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致誤診。例如，馬鈴薯S病毒的某些株系之間抗原性差異較小，在血清學(xué)檢測(cè)中可能難以準(zhǔn)確區(qū)分。相比之下，本研究建立的Rt-PCR分型方法具有顯著的優(yōu)勢(shì)。在準(zhǔn)確性方面，Rt-PCR分型方法基于病毒的核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)安第斯株系和普通株系特異性基因片段的擴(kuò)增，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別和區(qū)分這兩種株系。對(duì)部分樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示安第斯株系樣本的序列與GenBank中已登錄的安第斯株系序列同源性高達(dá)95%以上，普通株系樣本的序列與普通株系序列同源性也在95%以上，且與其他株系的序列差異明顯，這充分證明了該方法的準(zhǔn)確性。在靈敏度方面，Rt-PCR能夠檢測(cè)到極低含量的病毒核酸，其最低檢測(cè)限遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的生物學(xué)和血清學(xué)方法。在對(duì)已知株系的馬鈴薯S病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，Rt-PCR能夠檢測(cè)到低至102拷貝/μl的病毒核酸，而生物學(xué)測(cè)定法和血清學(xué)檢測(cè)法的檢測(cè)下限通常在10?-10?拷貝/μl以上。在檢測(cè)速度方面，Rt-PCR分型方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，從樣本處理到獲得檢測(cè)結(jié)果通?？梢栽跀?shù)小時(shí)內(nèi)完成，大大縮短了檢測(cè)周期，能夠滿足快速檢測(cè)和大規(guī)模篩查的需求。傳統(tǒng)的生物學(xué)測(cè)定法需要數(shù)天至數(shù)周的時(shí)間觀察指示植物癥狀，血清學(xué)檢測(cè)法也需要數(shù)小時(shí)至一天的時(shí)間完成檢測(cè)流程，而Rt-PCR分型方法能夠在3-4小時(shí)內(nèi)完成從核酸提取到結(jié)果分析的整個(gè)過程，顯著提高了檢測(cè)效率。本研究建立的Rt-PCR分型方法在準(zhǔn)確性、靈敏度和檢測(cè)速度等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能夠有效克服傳統(tǒng)分型方法的局限性，為馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的準(zhǔn)確、快速分型提供了一種可靠的技術(shù)手段，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。4.2安第斯和普通株系的分子特征差異馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系在分子特征上存在顯著差異，這些差異對(duì)于深入理解病毒的進(jìn)化和生物學(xué)特性具有重要意義。從基因組結(jié)構(gòu)來看，安第斯株系代表分離物的核苷酸序列長(zhǎng)度為8453bp，普通株系代表分離物的核苷酸序列長(zhǎng)度為8448bp，兩者在長(zhǎng)度上存在細(xì)微差別。這種長(zhǎng)度差異可能是由于基因的插入、缺失或變異導(dǎo)致的。在病毒的進(jìn)化過程中，基因組長(zhǎng)度的變化可能影響病毒的復(fù)制效率、穩(wěn)定性以及與寄主的相互作用。例如，某些基因片段的插入或缺失可能改變病毒的復(fù)制起始位點(diǎn)或調(diào)控元件，從而影響病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制速度和效率。兩種株系在核苷酸序列和氨基酸序列上也存在明顯差異。在核苷酸序列方面，安第斯株系和普通株系的同源性約為85%-90%，存在多個(gè)變異位點(diǎn)。這些變異位點(diǎn)可能分布在病毒基因組的各個(gè)區(qū)域，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。在編碼區(qū)的變異可能導(dǎo)致氨基酸序列的改變，進(jìn)而影響病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。在非編碼區(qū)的變異則可能影響病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控以及病毒RNA的穩(wěn)定性。通過對(duì)安第斯株系和普通株系外殼蛋白基因的分析發(fā)現(xiàn)，兩者在多個(gè)核苷酸位點(diǎn)上存在差異，這些差異導(dǎo)致了外殼蛋白氨基酸序列的不同。安第斯株系外殼蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度為258個(gè)氨基酸，普通株系外殼蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度為256個(gè)氨基酸，兩者在多個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸殘基不同。外殼蛋白是病毒粒子的重要組成部分，其氨基酸序列的差異可能影響病毒的抗原性、穩(wěn)定性以及與寄主細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合能力。不同的氨基酸組成可能導(dǎo)致外殼蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而改變病毒的抗原決定簇，影響寄主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的識(shí)別和攻擊。外殼蛋白與寄主細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力也可能受到氨基酸序列差異的影響，進(jìn)而影響病毒的侵染效率和傳播能力。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，安第斯株系和普通株系在進(jìn)化樹上分支明顯分開，界限清晰。這表明它們?cè)谶M(jìn)化過程中經(jīng)歷了不同的演化路徑，可能是由于長(zhǎng)期適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境、寄主品種或傳播媒介等因素導(dǎo)致的。安第斯株系主要分布在南美洲安第斯山脈地區(qū)，該地區(qū)的氣候、土壤條件以及馬鈴薯種植品種與其他地區(qū)存在差異。病毒在這樣的環(huán)境中逐漸適應(yīng)并進(jìn)化，形成了獨(dú)特的分子特征。而普通株系則廣泛分布于全球其他馬鈴薯種植區(qū)域，在不同的環(huán)境條件下也發(fā)生了相應(yīng)的進(jìn)化。這種地理分布和進(jìn)化差異可能導(dǎo)致兩種株系在與寄主的互作機(jī)制、致病能力以及傳播特性等方面存在差異。在與寄主的互作機(jī)制上，不同的進(jìn)化路徑可能使安第斯株系和普通株系發(fā)展出不同的策略來逃避寄主的防御反應(yīng)，或者利用寄主細(xì)胞的不同代謝途徑來完成自身的復(fù)制和傳播。在致病能力方面，分子特征的差異可能導(dǎo)致兩種株系對(duì)寄主細(xì)胞的損傷程度和方式不同，從而表現(xiàn)出不同的病害癥狀和危害程度。4.3兩種株系的病理學(xué)特征差異及致病機(jī)制在病理學(xué)特征方面，馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系在致病性、侵染范圍和寄主反應(yīng)等方面存在顯著差異。從致病性來看，安第斯株系的致病性相對(duì)較強(qiáng)，在指示植物上引發(fā)的癥狀更為嚴(yán)重。在三生煙上，接種安第斯株系的植株在接種后5-7天就出現(xiàn)明顯的褪綠斑駁癥狀，隨后癥狀逐漸加重，葉片邊緣卷曲明顯；而接種普通株系的植株在接種后7-9天才出現(xiàn)輕微的皺縮和花葉癥狀，且癥狀相對(duì)較輕。在白肋煙上，安第斯株系接種后6-8天出現(xiàn)明脈和壞死斑，導(dǎo)致葉片局部枯死；普通株系接種后8-10天才出現(xiàn)輕微的花葉和畸形癥狀，未出現(xiàn)明顯的壞死斑。這些癥狀表現(xiàn)表明安第斯株系對(duì)寄主植物的損傷更為嚴(yán)重，能夠更快地破壞寄主植物的生理功能，從而引發(fā)更明顯的病害癥狀。兩種株系的侵染范圍也有所不同。安第斯株系的侵染范圍相對(duì)較廣，不僅能夠侵染馬鈴薯，還能在多種指示植物上引發(fā)明顯的癥狀。在昆諾藜和莧色藜上，安第斯株系接種后均能在較短時(shí)間內(nèi)引發(fā)典型的癥狀，如昆諾藜接種葉片出現(xiàn)局部失綠壞死癥狀，莧色藜接種葉片出現(xiàn)枯斑癥狀。相比之下，普通株系在某些指示植物上的侵染能力較弱，在昆諾藜上，普通株系接種葉片僅出現(xiàn)輕微的褪綠斑，且植株上部的非接種葉未出現(xiàn)明顯癥狀；在莧色藜上，普通株系接種葉片出現(xiàn)的花葉和皺縮癥狀也相對(duì)較輕。這說明安第斯株系能夠更好地適應(yīng)不同的寄主植物，在不同的寄主環(huán)境中生存和繁殖，從而擴(kuò)大其侵染范圍。寄主對(duì)兩種株系的反應(yīng)也存在差異。不同的寄主植物對(duì)安第斯株系和普通株系的敏感性不同，這可能與寄主植物的遺傳背景、生理狀態(tài)以及防御機(jī)制等因素有關(guān)。一些寄主植物可能對(duì)安第斯株系具有較強(qiáng)的抗性，能夠在一定程度上抑制病毒的侵染和擴(kuò)散；而對(duì)普通株系則表現(xiàn)出較高的敏感性，容易受到感染。寄主植物在感染病毒后，會(huì)啟動(dòng)一系列的防御反應(yīng)，如產(chǎn)生抗病毒蛋白、激活信號(hào)傳導(dǎo)通路等。安第斯株系和普通株系可能通過不同的方式來逃避或抑制寄主植物的防御反應(yīng)，從而導(dǎo)致寄主植物對(duì)它們的反應(yīng)不同。關(guān)于致病機(jī)制，目前的研究表明，馬鈴薯S病毒可能通過多種途徑對(duì)寄主植物造成損害。病毒感染寄主植物后，會(huì)利用寄主細(xì)胞的物質(zhì)和能量進(jìn)行自身的復(fù)制和傳播，這會(huì)干擾寄主細(xì)胞的正常代謝過程。病毒可能會(huì)影響寄主植物的光合作用，導(dǎo)致葉片的光合效率下降，從而影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。病毒還可能干擾寄主植物的激素平衡，影響植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和防御反應(yīng)。在感染馬鈴薯S病毒后，寄主植物體內(nèi)的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等激素的含量和分布可能會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)形態(tài)和抗病能力。病毒編碼的蛋白在致病過程中也發(fā)揮著重要作用。馬鈴薯S病毒的外殼蛋白不僅是病毒粒子的結(jié)構(gòu)組成部分，還可能參與病毒與寄主細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合過程，影響病毒的侵染效率。三基因連鎖蛋白等其他病毒蛋白可能參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)運(yùn)以及對(duì)寄主防御反應(yīng)的抑制等過程。安第斯株系和普通株系在這些蛋白的氨基酸序列上存在差異，這些差異可能導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，從而影響病毒的致病機(jī)制。安第斯株系的某些蛋白可能具有更強(qiáng)的抑制寄主防御反應(yīng)的能力，使得病毒能夠更順利地在寄主體內(nèi)繁殖和擴(kuò)散，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的致病性。4.4研究結(jié)果對(duì)馬鈴薯病毒病防控的啟示基于本研究對(duì)馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的深入分析，在抗病品種選育方面，應(yīng)針對(duì)不同株系的特點(diǎn)開展工作。對(duì)于安第斯株系，由于其致病性較強(qiáng)，侵染范圍較廣，選育具有對(duì)安第斯株系高抗性的馬鈴薯品種尤為重要。可以通過篩選具有天然抗性的馬鈴薯種質(zhì)資源，利用現(xiàn)代分子育種技術(shù)，將抗性基因?qū)氲絻?yōu)良馬鈴薯品種中。通過基因編輯技術(shù)對(duì)馬鈴薯的抗病相關(guān)基因進(jìn)行修飾，使其表達(dá)產(chǎn)物能夠特異性地識(shí)別和抵御安第斯株系的侵染。針對(duì)普通株系，雖然其致病性相對(duì)較弱，但也不能忽視?？梢赃x育具有廣譜抗性的馬鈴薯品種，使其既能夠抵抗普通株系，又能對(duì)其他常見病毒具有一定的抗性。利用傳統(tǒng)雜交育種方法，將不同馬鈴薯品種的優(yōu)良抗性基因進(jìn)行組合，培育出綜合性狀優(yōu)良的抗病品種。在檢測(cè)技術(shù)優(yōu)化方面，本研究建立的Rt-PCR分型方法雖然具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，但仍有進(jìn)一步優(yōu)化的空間?？梢蚤_發(fā)基于熒光定量Rt-PCR的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定量檢測(cè)，能夠更準(zhǔn)確地了解病毒在植株體內(nèi)的含量變化，為病害的早期預(yù)警和防控提供更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)支持。通過對(duì)不同病毒株系的特異性熒光探針進(jìn)行設(shè)計(jì)，在熒光定量Rt-PCR反應(yīng)中，探針與目標(biāo)病毒株系的核酸序列特異性結(jié)合，在熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)下，能夠快速、準(zhǔn)確地定量檢測(cè)病毒含量。結(jié)合微流控芯片技術(shù)，將核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)等步驟集成在一個(gè)微小的芯片上，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化和高通量，提高檢測(cè)效率，降低檢測(cè)成本。微流控芯片技術(shù)能夠在微小的通道和反應(yīng)腔室中進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)，大大減少了試劑用量和反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣本的并行檢測(cè)，適用于大規(guī)模的馬鈴薯種薯檢測(cè)和田間病害監(jiān)測(cè)。加強(qiáng)對(duì)馬鈴薯種薯的檢測(cè)和監(jiān)管是防控馬鈴薯病毒病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。建立嚴(yán)格的種薯檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和制度，對(duì)種薯生產(chǎn)過程進(jìn)行全程監(jiān)控，確保種薯的質(zhì)量安全。在種薯生產(chǎn)基地，定期采集樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出攜帶病毒的種薯進(jìn)行及時(shí)處理，防止病毒的傳播和擴(kuò)散。加強(qiáng)對(duì)種薯市場(chǎng)的監(jiān)管，嚴(yán)厲打擊銷售帶毒種薯的行為，維護(hù)市場(chǎng)秩序。通過建立種薯質(zhì)量追溯體系，對(duì)種薯的生產(chǎn)、加工、銷售等環(huán)節(jié)進(jìn)行記錄和跟蹤，一旦發(fā)現(xiàn)問題能夠及時(shí)追溯源頭，采取相應(yīng)的措施進(jìn)行處理。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，加強(qiáng)田間管理對(duì)于防控馬鈴薯病毒病也具有重要意義。合理密植，保持田間通風(fēng)透光良好，降低田間濕度，創(chuàng)造不利于病毒傳播和侵染的環(huán)境。合理施肥，增強(qiáng)植株的抗病能力，使馬鈴薯植株在生長(zhǎng)過程中獲得充足的養(yǎng)分，提高自身的免疫力。及時(shí)清除田間雜草和病株，減少病毒的寄主和傳播源。定期巡查田間，一旦發(fā)現(xiàn)病株，立即拔除并進(jìn)行無害化處理，防止病毒在田間擴(kuò)散。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)蚜蟲等傳毒媒介的監(jiān)測(cè)和防治，采用物理防治、化學(xué)防治和生物防治相結(jié)合的方法，有效控制蚜蟲的數(shù)量，減少病毒的傳播機(jī)會(huì)。利用黃色粘蟲板誘捕蚜蟲，在田間懸掛黃色粘蟲板，利用蚜蟲對(duì)黃色的趨性，將蚜蟲粘捕在板上；在蚜蟲發(fā)生初期，選用高效、低毒的殺蟲劑進(jìn)行噴霧防治，如吡蟲啉、啶蟲脒等；釋放蚜蟲的天敵，如七星瓢蟲、食蚜蠅等，以蟲治蟲，控制蚜蟲的種群數(shù)量。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究成功建立了馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系的Rt-PCR分型方法，通過對(duì)來自中國(guó)四大馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的500份樣本進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確地鑒定出180份安第斯株系樣本和140份普通株系樣本。該分型方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，能夠有效地區(qū)分兩種株系，為馬鈴薯S病毒的檢測(cè)和研究提供了有力的技術(shù)支持。在分子特征分析方面，對(duì)安第斯株系和普通株系的代表分離物進(jìn)行了測(cè)序和分析。結(jié)果表明，兩種株系在基因組結(jié)構(gòu)、核苷酸序列和氨基酸序列上均存在差異。安第斯株系代表分離物的核苷酸序列長(zhǎng)度為8453bp，普通株系代表分離物的核苷酸序列長(zhǎng)度為8448bp。在開放閱讀框和編碼蛋白方面，兩者也存在一定的差異，這些差異可能影響病毒的生物學(xué)特性和致病機(jī)制。同源性分析顯示，中國(guó)的安第斯株系和普通株系與國(guó)內(nèi)外已知株系具有較高的同源性，但也存在一定的變異，系統(tǒng)進(jìn)化分析進(jìn)一步明確了它們?cè)诓《具M(jìn)化中的地位和親緣關(guān)系。通過病理學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)安第斯株系和普通株系在指示植物上引發(fā)的癥狀存在明顯差異。安第斯株系的致病性相對(duì)較強(qiáng)，侵染范圍較廣，在三生煙、白肋煙、昆諾藜、莧色藜等指示植物上引發(fā)的癥狀更為嚴(yán)重；而普通株系的致病性相對(duì)較弱，在部分指示植物上的侵染能力較弱，癥狀表現(xiàn)相對(duì)較輕。通過DAS-ELISA和兩重PCR等方法對(duì)指示植物和接種馬鈴薯進(jìn)行病毒檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證了兩種株系在病理學(xué)特征上的差異。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究的創(chuàng)新之處主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在檢測(cè)技術(shù)上，成功建立了基于Rt-PCR的馬鈴薯S病毒安第斯株系和普通株系分型方法，這是一種創(chuàng)新性的技術(shù)應(yīng)用。以往的研究中，雖然有對(duì)馬鈴薯S病毒的檢測(cè)方法，但針對(duì)安第斯株系和普通株系進(jìn)行特異性分型的Rt-PCR方法并不多見。通過對(duì)兩種株系特異性基因片段的擴(kuò)增，能夠準(zhǔn)確、快速地區(qū)分這兩種株系，為馬鈴薯S病毒的檢測(cè)和研究