基于QIAxcel電泳系統(tǒng)構(gòu)建鼠傳疾病多病原檢測體系：方法、評估與實(shí)踐一、引言1.1研究背景與意義鼠類作為地球上分布最廣泛、數(shù)量最多的哺乳動物之一，與人類的生活環(huán)境緊密交織。它們不僅適應(yīng)能力極強(qiáng)，能夠在各種惡劣環(huán)境中生存繁衍，還具備出色的繁殖能力，這使得其種群數(shù)量始終維持在較高水平。然而，鼠類在生態(tài)系統(tǒng)中的存在，給人類和動物的健康帶來了諸多隱患，尤其是它們作為病原體的重要宿主和傳播媒介，所引發(fā)的鼠傳疾病對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。有史以來，死于鼠傳疾病的人畜數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歷次戰(zhàn)爭的死亡人數(shù)，鼠類對人類健康的危害程度可見一斑。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已知有超過30余種人類疾病與鼠類密切相關(guān)，這些疾病的病原體種類繁多，涵蓋了細(xì)菌、病毒、立克次氏體、寄生蟲等。鼠疫，作為一種由鼠疫桿菌引起的烈性傳染病，在人類歷史上曾多次爆發(fā)大規(guī)模的流行，給人類社會帶來了毀滅性的災(zāi)難。其中，中世紀(jì)歐洲爆發(fā)的黑死病，短短幾年內(nèi)就導(dǎo)致了數(shù)千萬人死亡，幾乎使歐洲人口銳減三分之一，這場災(zāi)難深刻地改變了歐洲的社會結(jié)構(gòu)和歷史進(jìn)程。流行性出血熱則是由漢坦病毒引發(fā)的傳染病，褐家鼠和黑線姬鼠是其自然宿主和主要傳染源。人一旦接觸含有該病毒的鼠尿液或糞便，再觸摸眼睛、鼻子等黏膜部位，就極易導(dǎo)致感染；被鼠咬傷或食用被污染的食物，也同樣可能被感染。患者感染后，通常會出現(xiàn)發(fā)熱、出血、頭痛、眼瞼浮腫、全身酸痛等癥狀，同時(shí)還會伴有腎損害，病情發(fā)展迅速，如果治療不及時(shí)，很可能導(dǎo)致死亡。鉤端螺旋體病由致病性鉤端螺旋體引起，宿主動物主要為鼠類，家畜中的豬和狗也是重要傳染源。人體直接或間接接觸帶菌動物的尿污染物后，鉤端螺旋體便會通過破損皮膚或黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而引發(fā)感染。早期癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、眼結(jié)膜充血、肌肉痛、淋巴結(jié)腫大、乏力等，隨著病程的進(jìn)展，會對各器官造成損害，引發(fā)肺出血、黃疸等嚴(yán)重癥狀，重癥患者甚至可能出現(xiàn)肝腎功能衰竭和肺彌漫性出血，嚴(yán)重威脅生命健康。除了對人類健康造成嚴(yán)重威脅，鼠傳疾病對動物健康也有著極大的影響，特別是在畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中。鼠類攜帶的病原體可以感染家畜和家禽，導(dǎo)致動物發(fā)病甚至死亡，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，鼠類傳播的布魯氏菌病，不僅會使牛羊等家畜感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、不孕等生殖障礙，還會通過食物鏈傳播給人類，引發(fā)發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量和勞動能力。傳統(tǒng)的鼠傳疾病檢測方法往往局限于對單一病原體的檢測，難以滿足快速、準(zhǔn)確檢測多種病原體的需求。隨著鼠傳疾病的日益復(fù)雜和多樣化，以及疫情防控形勢的嚴(yán)峻性，開發(fā)一種能夠同時(shí)檢測多種病原體的高效、準(zhǔn)確的方法顯得尤為重要。多病原檢測方法不僅可以大大提高檢測效率，縮短檢測時(shí)間，還能及時(shí)發(fā)現(xiàn)混合感染的情況，為疾病的診斷、治療和防控提供全面、準(zhǔn)確的信息，有助于制定更加科學(xué)、有效的防控策略，從而降低鼠傳疾病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，減少疫情的爆發(fā)和擴(kuò)散。QIAxcel電泳系統(tǒng)作為一種先進(jìn)的核酸分析技術(shù)平臺，在病原體檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。它采用毛細(xì)管電泳技術(shù)，結(jié)合即用型預(yù)置凝膠卡夾和對應(yīng)的預(yù)定電泳程序，實(shí)現(xiàn)了核酸片段的快速、自動化、高通量、高分辨率分析。與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，QIAxcel電泳系統(tǒng)無需繁瑣的凝膠制備步驟，操作簡便快捷，大大縮短了檢測時(shí)間；其檢測靈敏度高，能夠可靠地分析濃度低至0.1ng/μl的核酸樣品，有效避免了因樣品濃度過低而導(dǎo)致的漏檢情況；分辨率可達(dá)3-5bp，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分不同大小的核酸片段，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；該系統(tǒng)還具備高通量的特點(diǎn)，每次運(yùn)行可自動分析多達(dá)96個(gè)樣品，顯著提高了檢測效率，適用于大規(guī)模的樣本檢測。在結(jié)核分枝桿菌多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)（MIRU-VNTR）基因分型PCR產(chǎn)物的檢測中，QIAxcel電泳系統(tǒng)與基因分析儀3730相比，一致性高達(dá)98.44%，充分證明了其在病原體檢測中的準(zhǔn)確性和可靠性。綜上所述，基于QIAxcel電泳系統(tǒng)建立鼠傳疾病多病原檢測方法，對于有效防控鼠傳疾病的傳播，保障人類和動物的健康安全，以及促進(jìn)畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀鼠傳疾病的檢測一直是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，隨著科技的不斷進(jìn)步，檢測方法也在持續(xù)更新和完善。國內(nèi)外學(xué)者在這一領(lǐng)域進(jìn)行了大量研究，傳統(tǒng)檢測方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)并存，各有優(yōu)劣。傳統(tǒng)的鼠傳疾病檢測方法主要包括病原體的分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測。病原體分離培養(yǎng)是將采集的樣本接種到特定的培養(yǎng)基上，通過觀察病原體的生長情況來確定其種類。這種方法雖然能夠準(zhǔn)確鑒定病原體，但操作繁瑣，培養(yǎng)周期長，對實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要求較高，且有些病原體難以在人工培養(yǎng)基上生長，限制了其應(yīng)用范圍。血清學(xué)檢測則是利用抗原-抗體反應(yīng)的原理，通過檢測血清中特異性抗體的存在來判斷是否感染病原體。常見的血清學(xué)檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光試驗(yàn)（IFA）等，這些方法具有一定的靈敏度和特異性，在臨床診斷中應(yīng)用廣泛，但也存在交叉反應(yīng)、假陽性或假陰性等問題，尤其是對于早期感染的檢測，可能會出現(xiàn)漏檢情況。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基于核酸檢測的方法逐漸成為鼠傳疾病檢測的主流。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的出現(xiàn)，極大地提高了病原體檢測的靈敏度和特異性。通過設(shè)計(jì)特異性引物，PCR技術(shù)能夠快速擴(kuò)增病原體的核酸片段，從而實(shí)現(xiàn)對病原體的檢測。普通PCR技術(shù)只能檢測單一病原體，對于鼠傳疾病中常見的混合感染情況，檢測效率較低。為了解決這一問題，多重PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它可以在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)核酸片段，實(shí)現(xiàn)對多種病原體的同時(shí)檢測，大大提高了檢測效率，但多重PCR技術(shù)在引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件優(yōu)化方面存在一定難度，容易出現(xiàn)引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等問題，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，引入了熒光標(biāo)記探針，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增過程中熒光信號的變化，實(shí)現(xiàn)對病原體核酸的定量檢測。qPCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，可用于病原體載量的測定，為疾病的診斷、治療和預(yù)后評估提供重要依據(jù)，但該技術(shù)需要專門的熒光定量PCR儀，設(shè)備成本較高，且對實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析的要求也較為嚴(yán)格?；蛐酒夹g(shù)是將大量的DNA探針固定在固相載體上，與樣品中的核酸進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號來分析樣品中的基因信息?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、并行性和自動化程度高的特點(diǎn)，可同時(shí)檢測多種病原體及其基因分型，但基因芯片的制備成本較高，檢測靈敏度和特異性有待進(jìn)一步提高，且數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，需要專業(yè)的生物信息學(xué)知識。近年來，二代測序技術(shù)（NGS）在病原體檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。NGS技術(shù)能夠?qū)颖局械暮怂徇M(jìn)行大規(guī)模測序，無需預(yù)先知道病原體的序列信息，可實(shí)現(xiàn)對未知病原體的快速鑒定和全基因組分析，為鼠傳疾病的診斷和溯源提供了有力工具。然而，NGS技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜，需要專業(yè)的生物信息學(xué)分析平臺，成本高昂，檢測周期較長，限制了其在臨床常規(guī)檢測中的應(yīng)用。QIAxcel電泳系統(tǒng)作為一種新型的核酸分析技術(shù)平臺，在鼠傳疾病多病原檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力。在國內(nèi)外的相關(guān)研究中，QIAxcel電泳系統(tǒng)已被應(yīng)用于多種病原體的檢測和分析。在細(xì)菌檢測方面，有研究利用QIAxcel電泳系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)（MIRU-VNTR）基因分型PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，與傳統(tǒng)的基因分析儀3730相比，一致性高達(dá)98.44%，表明該系統(tǒng)在細(xì)菌基因分型檢測中具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。在病毒檢測領(lǐng)域，QIAxcel電泳系統(tǒng)也可用于檢測病毒核酸片段，通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的快速分析，實(shí)現(xiàn)對病毒的定性和定量檢測，為病毒感染性疾病的診斷和監(jiān)測提供了新的手段。在寄生蟲檢測方面，雖然相關(guān)研究相對較少，但已有研究嘗試?yán)肣IAxcel電泳系統(tǒng)對瘧原蟲、弓形蟲等寄生蟲的核酸進(jìn)行檢測，初步結(jié)果顯示該系統(tǒng)能夠有效分離和檢測寄生蟲核酸片段，具有一定的應(yīng)用前景。目前鼠傳疾病多病原檢測方法雖取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足。傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣、檢測周期長，難以滿足快速診斷的需求；現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)雖具有較高的靈敏度和特異性，但部分技術(shù)存在設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、數(shù)據(jù)分析困難等問題，限制了其廣泛應(yīng)用。QIAxcel電泳系統(tǒng)作為一種新興技術(shù)，在鼠傳疾病多病原檢測中展現(xiàn)出操作簡便、高通量、高分辨率等優(yōu)勢，但在實(shí)際應(yīng)用中還需要進(jìn)一步優(yōu)化檢測方法，提高檢測的靈敏度和特異性，以更好地滿足臨床和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的需求。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在建立一種基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的高效、準(zhǔn)確的鼠傳疾病多病原檢測方法，并對其性能進(jìn)行全面評估，最終將該方法應(yīng)用于實(shí)際樣本檢測，為鼠傳疾病的防控提供有力的技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：鼠傳疾病常見病原體的篩選與引物設(shè)計(jì)：通過對國內(nèi)外鼠傳疾病相關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研和分析，結(jié)合本地鼠傳疾病的流行特點(diǎn)，確定鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體、恙蟲病東方體等為主要研究對象。針對這些病原體的保守基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過引物特異性、靈敏度和擴(kuò)增效率的預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳引物組合，確保引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)病原體核酸片段，為后續(xù)的多重PCR反應(yīng)奠定基礎(chǔ)?；赒IAxcel電泳系統(tǒng)的多病原檢測方法的建立：以篩選出的引物組合為基礎(chǔ)，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系和條件，包括引物濃度、dNTP濃度、Taq酶用量、Mg2?濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳的反應(yīng)參數(shù)，使多種病原體的核酸片段能夠在同一反應(yīng)體系中高效、特異性地?cái)U(kuò)增。將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用于QIAxcel電泳系統(tǒng)進(jìn)行分析，優(yōu)化電泳條件，如選擇合適的凝膠卡夾、電泳電壓、電泳時(shí)間等，以實(shí)現(xiàn)對不同病原體擴(kuò)增產(chǎn)物的高分辨率分離和準(zhǔn)確檢測。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過對已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，確定檢測方法的線性范圍和定量準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)對病原體的定性和定量檢測。多病原檢測方法的性能評估：對建立的基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性進(jìn)行全面評估。通過梯度稀釋病原體核酸，確定該方法能夠檢測到的最低病原體核酸濃度，評估其靈敏度；與其他常見病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法對目標(biāo)病原體的特異性；對同一批樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測，分析檢測結(jié)果的重復(fù)性；將該方法與傳統(tǒng)的檢測方法（如病原體分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測等）進(jìn)行對比，評估其準(zhǔn)確性。對方法的檢測限、定量限、回收率等指標(biāo)進(jìn)行測定，全面評價(jià)方法的性能，確保該方法能夠滿足實(shí)際檢測的需求。實(shí)際樣本檢測與應(yīng)用：采集不同地區(qū)、不同生境下的鼠類樣本，包括肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等組織，提取樣本中的核酸，運(yùn)用建立的多病原檢測方法進(jìn)行檢測，分析鼠類樣本中病原體的感染情況和分布特征。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，探討鼠傳疾病的傳播規(guī)律和風(fēng)險(xiǎn)因素，為制定針對性的防控措施提供科學(xué)依據(jù)。將該檢測方法應(yīng)用于鼠傳疾病疫情的監(jiān)測和預(yù)警，及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的疫情風(fēng)險(xiǎn)，為疫情的早期防控提供技術(shù)支持；在臨床診斷中，嘗試將該方法用于疑似鼠傳疾病患者的檢測，提高診斷效率和準(zhǔn)確性，為患者的及時(shí)治療提供保障。二、QIAxcel電泳系統(tǒng)概述2.1系統(tǒng)組成與工作原理QIAxcel電泳系統(tǒng)是一款集先進(jìn)技術(shù)與創(chuàng)新設(shè)計(jì)于一體的核酸分析平臺，主要由硬件設(shè)備和軟件系統(tǒng)兩大部分構(gòu)成，各組成部分緊密協(xié)作，共同實(shí)現(xiàn)了對核酸樣品的高效、準(zhǔn)確分析。從硬件層面來看，QIAxcel分析儀是整個(gè)系統(tǒng)的核心，其內(nèi)部構(gòu)造精密，采用了最新的多重?zé)晒鈾z測技術(shù)，配備了一排發(fā)光二極管和微光學(xué)采集器。這些組件能夠精準(zhǔn)地激發(fā)和采集核酸片段在電泳過程中產(chǎn)生的信號，為后續(xù)的分析提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。分析儀還具備自動上樣功能，可與96孔板、PCR管或排管等多種樣品容器適配，實(shí)現(xiàn)高通量的樣品分析，大大提高了檢測效率。預(yù)制膠卡夾是QIAxcel電泳系統(tǒng)的另一關(guān)鍵硬件組成。這種即用型的設(shè)計(jì)是其區(qū)別于傳統(tǒng)電泳系統(tǒng)的重要特征，卡夾內(nèi)預(yù)裝了特殊的凝膠介質(zhì)，無需實(shí)驗(yàn)人員手動制備凝膠，不僅節(jié)省了時(shí)間和精力，還減少了因手動操作帶來的誤差，降低了接觸危險(xiǎn)化學(xué)品的幾率，使實(shí)驗(yàn)過程更加安全、便捷。不同類型的預(yù)制膠卡夾適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求，如QIAxcelDNAScreeningKit可實(shí)現(xiàn)常規(guī)的細(xì)菌高通量分型；QIAxcelDNAFastAnalysisKit可用于單重/多重定性PCR產(chǎn)物檢測，3分鐘即可獲得檢測結(jié)果；QIAxcelDNAHighResolutionKit可在低于0.5kb片段范圍內(nèi)獲得3-5bp的差異檢出，契合高分辨率基因分型VNTR、STR等應(yīng)用。QIAxcel電泳系統(tǒng)還離不開電腦及配套的BioCalculator軟件和QIAxcelScreenGel軟件。BioCalculator軟件主要用于實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，它能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽攸c(diǎn)，幫助研究人員快速確定合適的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，如引物濃度、反應(yīng)條件等，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了有力的支持。QIAxcelScreenGel軟件則負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的采集、分析和記錄，其界面友好，操作簡便，支持中/英文版本隨時(shí)切換。該軟件提供了交互式工具，可簡化分析過程，用戶能夠以原始信號峰圖或模擬膠圖兩種方式瀏覽數(shù)據(jù)，結(jié)果既可以單個(gè)查看，也能疊加顯示，便于對樣品和數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。軟件還具備用戶管理功能，能有效防止未授權(quán)的訪問，確保數(shù)據(jù)的安全性和保密性。同時(shí)，它能夠輕松生成綜合的數(shù)據(jù)報(bào)告，并支持保存或?qū)С?，滿足了不同用戶對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和整理的需求。QIAxcel電泳系統(tǒng)基于毛細(xì)管電泳原理工作。在毛細(xì)管電泳中，以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道。當(dāng)樣品被注入充滿凝膠介質(zhì)的毛細(xì)管后，在電場的作用下，核酸分子會因其所帶電荷和分子大小的不同而具有不同的遷移速度。具體來說，帶電分子在電場中會受到電荷作用力的影響，向與其所帶電荷相反的電極方向移動。分子的電荷越多、電場強(qiáng)度越大，受到的電場力就越大，遷移速度也就越快；而分子的大小和形狀則會影響其在凝膠介質(zhì)中的遷移阻力，分子越大，遷移阻力越大，遷移速度就越慢。利用這一特性，不同的核酸分子能夠在毛細(xì)管中按照大小順序依次分離。在分離過程中，核酸分子在向陽極移動時(shí)會被逐一檢測。QIAxcel分析儀中的發(fā)光二極管會發(fā)射特定波長的光，激發(fā)遷移中的核酸分子，使其發(fā)出熒光信號。微光學(xué)采集器則負(fù)責(zé)收集這些熒光信號，并將其傳輸給光電倍增管。光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并進(jìn)行放大處理，最后將放大后的電信號傳輸至QIAxcelScreenGel軟件。軟件對這些信號數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，將其轉(zhuǎn)換為直觀的電泳圖和凝膠圖呈現(xiàn)給用戶，用戶可以根據(jù)這些圖譜來判斷樣品中核酸分子的大小、濃度等信息，從而實(shí)現(xiàn)對核酸樣品的分析和檢測。2.2技術(shù)特點(diǎn)與優(yōu)勢QIAxcel電泳系統(tǒng)憑借其獨(dú)特的技術(shù)設(shè)計(jì)和功能特性，在鼠傳疾病多病原檢測中展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)電泳技術(shù)相比，具有多方面的革新與突破。在檢測速度方面，QIAxcel電泳系統(tǒng)表現(xiàn)出色，堪稱高效檢測的典范。其最快僅需3分鐘即可完成12個(gè)病原微生物樣品的分析，單次運(yùn)行分析多達(dá)96個(gè)樣品也僅需24分鐘。這種快速分析能力極大地縮短了檢測周期，能在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣本，為鼠傳疾病的快速診斷和疫情的及時(shí)防控提供了有力支持。在鼠傳疾病爆發(fā)初期，需要對大量鼠類樣本進(jìn)行檢測以確定病原體的傳播范圍和感染情況。使用QIAxcel電泳系統(tǒng)，可在短時(shí)間內(nèi)完成樣本檢測，快速獲取檢測結(jié)果，為疫情防控決策提供及時(shí)、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)依據(jù)，從而有效控制疫情的擴(kuò)散。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠制備、上樣到電泳結(jié)束，整個(gè)過程往往需要數(shù)小時(shí)，檢測效率低下，難以滿足快速檢測的需求。靈敏度和分辨率是衡量檢測技術(shù)準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)，QIAxcel電泳系統(tǒng)在這兩方面同樣表現(xiàn)卓越。它能夠可靠地分析濃度低至0.1ng/μl的核酸樣品，對低濃度核酸的檢測能力遠(yuǎn)超傳統(tǒng)電泳技術(shù)，有效避免了因樣品濃度過低而導(dǎo)致的漏檢情況。在小于0.5kb的片段范圍內(nèi)，其分辨率可達(dá)3-5bp，能夠精確地區(qū)分不同大小的核酸片段，提供更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。在對鼠疫桿菌核酸片段進(jìn)行檢測時(shí)，QIAxcel電泳系統(tǒng)可以清晰地分辨出與其他細(xì)菌核酸片段大小相近但存在細(xì)微差異的目標(biāo)片段，從而準(zhǔn)確鑒定鼠疫桿菌，避免誤診。傳統(tǒng)電泳技術(shù)由于分辨率有限，對于大小相近的核酸片段往往難以準(zhǔn)確區(qū)分，容易出現(xiàn)誤判。操作的便捷性和自動化程度是QIAxcel電泳系統(tǒng)的又一突出優(yōu)勢。該系統(tǒng)采用即用型預(yù)置凝膠卡夾，無需實(shí)驗(yàn)人員手動制備凝膠，減少了繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟和人為操作誤差，同時(shí)也降低了接觸危險(xiǎn)化學(xué)品的幾率，使實(shí)驗(yàn)過程更加安全、便捷。實(shí)驗(yàn)人員只需將樣品加載到96孔板、PCR管或排管中，選擇合適的分離方法，系統(tǒng)即可自動完成上樣、電泳和數(shù)據(jù)分析等一系列操作，實(shí)現(xiàn)了檢測過程的全自動化。這不僅節(jié)省了人力和時(shí)間成本，還提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可靠性。相比之下，傳統(tǒng)電泳技術(shù)需要手動制備凝膠、上樣、染色等多個(gè)步驟，操作繁瑣，容易出現(xiàn)誤差，且對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。數(shù)據(jù)分析的高效性和準(zhǔn)確性是QIAxcel電泳系統(tǒng)不可或缺的優(yōu)勢。配套的QIAxcelScreenGel軟件界面友好，操作簡便，支持中/英文版本隨時(shí)切換。軟件提供了交互式工具，可簡化分析過程，用戶能夠以原始信號峰圖或模擬膠圖兩種方式瀏覽數(shù)據(jù)，結(jié)果既可以單個(gè)查看，也能疊加顯示，便于對樣品和數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。軟件還具備用戶管理功能，能有效防止未授權(quán)的訪問，確保數(shù)據(jù)的安全性和保密性。同時(shí)，它能夠輕松生成綜合的數(shù)據(jù)報(bào)告，并支持保存或?qū)С?，滿足了不同用戶對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和整理的需求。在對大量鼠傳疾病樣本檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，QIAxcelScreenGel軟件能夠快速準(zhǔn)確地處理數(shù)據(jù)，生成直觀的報(bào)告，為研究人員提供清晰、全面的檢測信息，有助于深入分析鼠傳疾病的傳播規(guī)律和病原體特征。2.3在病原檢測領(lǐng)域的應(yīng)用范圍QIAxcel電泳系統(tǒng)以其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢，在病原檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，能夠有效應(yīng)對多種檢測需求。在病原微生物檢測或分型方面，該系統(tǒng)可對多種病原體進(jìn)行精準(zhǔn)檢測與分析。對于細(xì)菌，如結(jié)核分枝桿菌，研究人員利用QIAxcel電泳系統(tǒng)對其多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)（MIRU-VNTR）基因分型PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與基因分析儀3730的一致性高達(dá)98.44%。這表明QIAxcel電泳系統(tǒng)在細(xì)菌基因分型檢測中具有極高的準(zhǔn)確性和可靠性，能夠?yàn)榻Y(jié)核病的診斷、治療和防控提供精準(zhǔn)的病原體信息，有助于制定更具針對性的治療方案和防控策略。在病毒檢測領(lǐng)域，以腸道病毒EV71為例，有研究采集疑似手足口病患者的咽拭子樣本，提取RNA并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后利用QIAxcel電泳系統(tǒng)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，50例標(biāo)本中QIAxcel凝膠電泳結(jié)果顯示24例為陽性，陽性率為48%，而常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果僅15例為陽性，陽性率為30%，且陽性結(jié)果經(jīng)RealTimeRT-PCR驗(yàn)證均為陽性。這充分體現(xiàn)了QIAxcel電泳系統(tǒng)在病毒檢測中的高靈敏度，能夠更有效地檢測出病毒感染情況，為手足口病的早期診斷和疫情防控提供及時(shí)、準(zhǔn)確的依據(jù)。在DNA指紋圖譜分析方面，QIAxcel電泳系統(tǒng)也發(fā)揮著重要作用。通過對病原體的DNA進(jìn)行特定的酶切或擴(kuò)增處理后，利用該系統(tǒng)進(jìn)行電泳分析，可獲得獨(dú)特的DNA指紋圖譜。這些圖譜如同病原體的“身份證”，能夠清晰地展示病原體的遺傳特征，幫助研究人員區(qū)分不同的病原體菌株，追蹤病原體的傳播路徑。在研究鼠傳疾病的傳播時(shí)，可對不同地區(qū)鼠類體內(nèi)分離出的病原體進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，通過比較圖譜的相似性和差異性，確定病原體的來源和傳播方向，為疫情的防控提供關(guān)鍵線索。在鼠傳疾病多病原檢測中，QIAxcel電泳系統(tǒng)的適用性尤為突出。鼠傳疾病往往涉及多種病原體的混合感染，傳統(tǒng)檢測方法難以滿足快速、準(zhǔn)確檢測多種病原體的需求。而QIAxcel電泳系統(tǒng)的高通量特點(diǎn)，使其能夠在一次檢測中同時(shí)分析多個(gè)樣本，大大提高了檢測效率；高分辨率特性則確保了能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同病原體的核酸片段，避免漏檢和誤檢。結(jié)合多重PCR技術(shù)，QIAxcel電泳系統(tǒng)可在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多種病原體的核酸片段，然后通過電泳分析實(shí)現(xiàn)對多種病原體的同時(shí)檢測。這使得在鼠傳疾病的診斷和監(jiān)測中，能夠快速、全面地了解病原體的感染情況，為疾病的防控提供有力支持。三、鼠傳疾病多病原檢測方法的建立3.1樣本采集與處理為了全面、準(zhǔn)確地建立基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法，本研究選取了內(nèi)蒙古西部口岸地區(qū)作為樣本采集點(diǎn)。該地區(qū)地理位置特殊，毗鄰俄羅斯、蒙古國，邊境線長達(dá)4261公里，占我國陸地邊界總長的19%。在其邊境線上存在著長爪沙鼠、蒙古旱獺、布氏田鼠等三種鼠疫自然疫源地和一個(gè)森林腦炎疫源地，具備鼠傳疾病傳播的自然條件，導(dǎo)致傳染病疫情跨境傳播風(fēng)險(xiǎn)長期存在，是開展鼠傳疾病研究的關(guān)鍵區(qū)域。在采集方法上，本研究采用夾夜法進(jìn)行捕鼠。該方法具有操作相對簡便、捕獲效率較高等優(yōu)點(diǎn)，能夠在一定程度上保證采集到的鼠類樣本具有代表性。具體操作過程為：在選定的監(jiān)測區(qū)域內(nèi)，按照一定的間隔距離設(shè)置鼠夾，每個(gè)鼠夾上放置適量的誘餌，如花生米、油條等，以吸引鼠類。將鼠夾放置一夜后，于次日清晨收回，記錄捕獲的鼠類數(shù)量、種類及捕獲地點(diǎn)等信息。本研究的采集對象涵蓋了該地區(qū)常見的多種鼠類，包括長爪沙鼠、達(dá)烏爾黃鼠、子午沙鼠、五趾跳鼠、三趾跳鼠、小家鼠、灰倉鼠、小毛足鼠等。這些鼠類在該地區(qū)的生態(tài)環(huán)境中具有不同的分布特點(diǎn)和生態(tài)習(xí)性，對多種鼠傳疾病病原體具有不同的易感性和攜帶能力。通過對多種鼠類的采集和檢測，可以更全面地了解該地區(qū)鼠傳疾病的流行狀況和病原體的分布特征。捕獲鼠類后，需及時(shí)進(jìn)行樣本預(yù)處理。首先對鼠類進(jìn)行分類鑒定，依據(jù)鼠類的形態(tài)學(xué)特征，如體型大小、毛色、尾巴長度和形狀、耳部特征、牙齒結(jié)構(gòu)等，準(zhǔn)確鑒別其種類。之后對鼠類進(jìn)行解剖，在無菌條件下迅速取出肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等組織樣本，這些組織是病原體易于寄生和繁殖的部位，對檢測鼠傳疾病病原體具有重要意義。將取出的組織樣本立即放入無菌離心管中，并標(biāo)記好樣本編號、采集地點(diǎn)、采集時(shí)間和鼠類種類等信息，隨后將離心管置于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以確保樣本中病原體核酸的完整性，防止核酸降解，為后續(xù)的核酸提取和檢測工作提供質(zhì)量可靠的樣本。核酸提取是樣本檢測的關(guān)鍵步驟，其質(zhì)量直接影響后續(xù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究采用了QIAampDNAMiniKit和QIAampViralRNAMiniKit進(jìn)行核酸提取，針對不同類型的病原體和樣本特點(diǎn)，選擇合適的試劑盒進(jìn)行操作。對于細(xì)菌類病原體，如鼠疫桿菌、鉤端螺旋體等，使用QIAampDNAMiniKit提取基因組DNA；對于病毒類病原體，如漢坦病毒，使用QIAampViralRNAMiniKit提取RNA。在使用QIAampDNAMiniKit提取基因組DNA時(shí)，首先將組織樣本剪碎，加入適量的裂解緩沖液和蛋白酶K，在56℃條件下孵育，使組織細(xì)胞充分裂解，釋放出DNA。然后依次加入蛋白沉淀液、無水乙醇等試劑，通過離心、洗滌等步驟去除雜質(zhì)，最后用適量的洗脫緩沖液洗脫DNA，得到高質(zhì)量的基因組DNA溶液。使用QIAampViralRNAMiniKit提取RNA時(shí)，同樣先將組織樣本剪碎，加入裂解液充分裂解細(xì)胞，使病毒RNA釋放出來。經(jīng)過多次離心、洗滌和吸附等操作，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，最后用無RNase水洗脫RNA，獲得純凈的病毒RNA樣本。提取得到的核酸樣本，采用核酸定量儀測定其濃度和純度。一般來說，DNA樣本的A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，RNA樣本的A260/A280比值應(yīng)在2.0左右，表明核酸樣本純度較高，無蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染，可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增和QIAxcel電泳檢測。3.2引物設(shè)計(jì)與多重PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)是基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其設(shè)計(jì)的合理性直接影響到檢測的特異性和靈敏度。本研究在設(shè)計(jì)引物時(shí)，嚴(yán)格遵循一系列科學(xué)原則，以確保引物能夠準(zhǔn)確、高效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)病原體的核酸片段。從設(shè)計(jì)原則來看，引物長度是首要考慮因素。本研究將引物長度設(shè)定在18-30個(gè)堿基之間，這是因?yàn)樵诖碎L度范圍內(nèi)，引物既能保證與模板DNA的特異性結(jié)合，又能避免因過長導(dǎo)致合成成本增加和擴(kuò)增效率降低，過短則可能影響引物與模板的結(jié)合穩(wěn)定性和特異性。對于鼠疫桿菌，其引物長度確定為20-25個(gè)堿基，在保證特異性的同時(shí)，提高了擴(kuò)增效率。引物的Tm值也是關(guān)鍵參數(shù)，本研究使引物的Tm值接近60℃，且上下游引物的Tm值盡量接近，差值不超過4℃。這是因?yàn)門m值相近的引物在PCR反應(yīng)中能夠同時(shí)與模板DNA退火，保證擴(kuò)增反應(yīng)的同步性，避免因退火溫度差異導(dǎo)致的擴(kuò)增效率不一致或非特異性擴(kuò)增。對于漢坦病毒，通過優(yōu)化引物序列，使上下游引物的Tm值分別為58℃和60℃，滿足了擴(kuò)增要求。引物的GC含量同樣不容忽視，本研究將其控制在40%-60%之間，且上下游引物的GC含量接近。合適的GC含量有助于維持引物與模板DNA結(jié)合的穩(wěn)定性，過高或過低的GC含量都可能影響引物的退火溫度和擴(kuò)增效果。在設(shè)計(jì)鉤端螺旋體引物時(shí)，通過調(diào)整堿基組成，使GC含量達(dá)到50%，確保了引物的穩(wěn)定性和擴(kuò)增效果。為避免引物形成二級結(jié)構(gòu)，本研究在設(shè)計(jì)區(qū)域避開了復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)，防止出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)以上堿基的互補(bǔ)。引物二級結(jié)構(gòu)的形成會阻礙引物與模板DNA的結(jié)合，降低擴(kuò)增效率，甚至導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。在設(shè)計(jì)恙蟲病東方體引物時(shí)，利用生物信息學(xué)軟件對引物序列進(jìn)行分析，確保其不會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體等二級結(jié)構(gòu)，保證了引物的正常功能。在引物3'端選擇上，本研究避免選擇A，最好選擇T，以減少錯(cuò)配引發(fā)的合成效率差異。3'端堿基與模板DNA的錯(cuò)配會影響DNA聚合酶的延伸，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇T作為3'端堿基可降低這種風(fēng)險(xiǎn)，提高擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。為確保引物的特異性，本研究利用NCBI的BLAST功能中的Primer-BLAST對設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評估。以鼠疫桿菌為例，將設(shè)計(jì)好的引物在Primer-BLAST中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示引物與鼠疫桿菌的目標(biāo)基因序列具有高度的特異性匹配，而與其他非目標(biāo)病原體的基因序列無明顯匹配區(qū)域，這表明引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增鼠疫桿菌的核酸片段，避免了與其他病原體的交叉反應(yīng)，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。多重PCR擴(kuò)增是實(shí)現(xiàn)多病原同時(shí)檢測的核心步驟，其反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化至關(guān)重要。在反應(yīng)體系優(yōu)化方面，本研究對引物濃度、dNTP濃度、Taq酶用量、Mg2?濃度等關(guān)鍵因素進(jìn)行了細(xì)致的調(diào)整和優(yōu)化。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的引物濃度為0.2-0.5μM。引物濃度過低會導(dǎo)致擴(kuò)增效率低下，無法檢測到目標(biāo)核酸片段；濃度過高則可能引發(fā)引物二聚體的形成，影響擴(kuò)增效果。在檢測多種病原體時(shí)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對不同病原體引物的濃度進(jìn)行組合優(yōu)化，確保每種病原體的引物都能在最佳濃度下發(fā)揮作用。dNTP濃度設(shè)定為0.2-0.4mM，dNTP是PCR反應(yīng)的原料，濃度過低會限制DNA合成，過高則可能增加錯(cuò)配的幾率。Taq酶用量為0.5-1.5U，Taq酶是催化DNA合成的關(guān)鍵酶，用量不足會導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，過多則可能增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。Mg2?濃度為1.5-2.5mM，Mg2?是Taq酶的激活劑，對PCR反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率有重要影響，濃度不合適會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。在反應(yīng)條件優(yōu)化方面，退火溫度和循環(huán)次數(shù)是兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。通過梯度PCR實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的退火溫度為50-60℃。退火溫度過高會使引物與模板DNA的結(jié)合不穩(wěn)定，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低；過低則會增加非特異性擴(kuò)增的幾率。對于不同的病原體，根據(jù)其引物的Tm值和擴(kuò)增特性，通過調(diào)整退火溫度，使每種病原體的擴(kuò)增都能達(dá)到最佳效果。循環(huán)次數(shù)設(shè)定為30-35次，循環(huán)次數(shù)過少會導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量不足，無法檢測到；過多則可能增加非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在實(shí)際檢測中，根據(jù)樣本中病原體的初始含量和檢測靈敏度要求，合理調(diào)整循環(huán)次數(shù)，以確保能夠準(zhǔn)確檢測到目標(biāo)病原體。以鼠疫桿菌和漢坦病毒為例，在多重PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，將優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件應(yīng)用于實(shí)際檢測。結(jié)果顯示，在同一反應(yīng)體系中，鼠疫桿菌和漢坦病毒的核酸片段都能夠得到高效、特異性的擴(kuò)增。通過QIAxcel電泳系統(tǒng)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，能夠清晰地分辨出鼠疫桿菌和漢坦病毒的特異性條帶，且條帶清晰、明亮，無明顯的非特異性擴(kuò)增條帶，表明優(yōu)化后的多重PCR擴(kuò)增體系和條件能夠滿足鼠傳疾病多病原檢測的需求，為后續(xù)的檢測工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.3QIAxcel電泳檢測流程完成多重PCR擴(kuò)增后，需將產(chǎn)物進(jìn)行QIAxcel電泳檢測，以實(shí)現(xiàn)對不同病原體擴(kuò)增產(chǎn)物的分離和檢測。在檢測過程中，需嚴(yán)格遵循操作步驟，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測前，首先要選擇合適的預(yù)制膠卡夾。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖咎攸c(diǎn)，本研究選用QIAxcelDNAHighResolutionKit預(yù)制膠卡夾。該卡夾專為高分辨率核酸分析設(shè)計(jì)，在低于0.5kb片段范圍內(nèi)具有出色的分辨能力，能夠精準(zhǔn)區(qū)分不同病原體的核酸片段，滿足鼠傳疾病多病原檢測中對核酸片段高分辨率分離的需求。在檢測鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體等病原體的核酸片段時(shí)，該卡夾能夠清晰地將不同病原體的擴(kuò)增產(chǎn)物分離開來，為后續(xù)的分析提供準(zhǔn)確的圖譜。選擇好預(yù)制膠卡夾后，進(jìn)行樣品加載。將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液按1:1的體積比混合，充分混勻后，短暫離心，使混合液集中于管底。利用移液器準(zhǔn)確吸取2μl混合后的樣品，小心加入到預(yù)制膠卡夾的樣品孔中。在加樣過程中，要確保移液器的槍頭垂直插入樣品孔，避免產(chǎn)生氣泡，防止樣品溢出，以保證加樣的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。每加完一個(gè)樣品，需更換移液器槍頭，防止交叉污染。完成樣品加載后，進(jìn)行電泳程序設(shè)置。在QIAxcelScreenGel軟件中，選擇與QIAxcelDNAHighResolutionKit預(yù)制膠卡夾對應(yīng)的電泳程序，該程序是針對該卡夾的特性和核酸片段分離要求預(yù)先設(shè)置好的，能夠保證電泳過程的高效和準(zhǔn)確。本研究對部分參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，將電泳電壓設(shè)置為1500V，這一電壓既能保證核酸片段在電場作用下快速遷移，又能避免因電壓過高導(dǎo)致核酸片段的降解或變形。電泳時(shí)間設(shè)定為20分鐘，在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)，不同大小的核酸片段能夠充分分離，獲得清晰的電泳圖譜。在檢測多種病原體的混合樣本時(shí)，經(jīng)過20分鐘的電泳，不同病原體的核酸片段在凝膠中形成了明顯的條帶，便于觀察和分析。設(shè)置好電泳程序后，將預(yù)制膠卡夾放入QIAxcel分析儀中，點(diǎn)擊軟件中的“運(yùn)行”按鈕，啟動電泳檢測。在電泳過程中，QIAxcel分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測核酸片段的遷移情況，并將檢測到的信號傳輸給QIAxcelScreenGel軟件。軟件對這些信號進(jìn)行處理和分析，實(shí)時(shí)顯示電泳圖譜的生成過程。操作人員可通過軟件界面觀察電泳的進(jìn)展情況，確保電泳過程正常進(jìn)行。若在電泳過程中出現(xiàn)異常情況，如信號不穩(wěn)定、電泳速度異常等，軟件會及時(shí)發(fā)出警報(bào)，操作人員需根據(jù)提示進(jìn)行相應(yīng)的排查和處理。電泳結(jié)束后，QIAxcelScreenGel軟件自動對電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，生成直觀的電泳圖譜和詳細(xì)的數(shù)據(jù)報(bào)告。圖譜以模擬膠圖和原始信號峰圖兩種形式呈現(xiàn)，模擬膠圖直觀地展示了核酸片段在凝膠中的遷移位置和條帶分布情況，與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜相似，便于操作人員快速判斷樣品中核酸片段的大小和數(shù)量；原始信號峰圖則提供了更詳細(xì)的核酸片段信息，包括片段的大小、熒光強(qiáng)度等，為進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析和結(jié)果判斷提供了依據(jù)。在分析鼠疫桿菌和漢坦病毒的混合樣本電泳圖譜時(shí)，模擬膠圖上清晰地顯示出兩條不同位置的條帶，分別對應(yīng)鼠疫桿菌和漢坦病毒的核酸片段；原始信號峰圖則準(zhǔn)確地給出了兩條條帶的大小和熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的對比，能夠準(zhǔn)確判斷樣品中是否存在這兩種病原體以及它們的核酸片段大小是否符合預(yù)期。軟件還根據(jù)預(yù)設(shè)的參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)，對電泳結(jié)果進(jìn)行自動判讀，標(biāo)注出陽性和陰性結(jié)果。對于陽性結(jié)果，軟件會進(jìn)一步分析核酸片段的大小、熒光強(qiáng)度等信息，與已知的病原體核酸片段特征進(jìn)行比對，確定病原體的種類。操作人員可根據(jù)軟件生成的電泳圖譜和數(shù)據(jù)報(bào)告，對檢測結(jié)果進(jìn)行人工復(fù)核，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。在復(fù)核過程中，需仔細(xì)觀察電泳圖譜的條帶位置、形狀和亮度等特征，與軟件的判讀結(jié)果進(jìn)行對比，如有疑問，可進(jìn)一步查閱相關(guān)資料或進(jìn)行重復(fù)檢測。3.4結(jié)果判讀與數(shù)據(jù)分析方法QIAxcel電泳系統(tǒng)檢測完成后，會生成直觀且詳細(xì)的電泳圖譜，為結(jié)果判讀提供了關(guān)鍵依據(jù)。操作人員主要依據(jù)電泳圖譜中條帶的位置和亮度來判讀檢測結(jié)果。在圖譜中，條帶的位置與核酸片段的大小密切相關(guān)，不同大小的核酸片段在電場作用下遷移速度不同，從而在凝膠上形成不同位置的條帶。通過與已知分子量的Marker條帶進(jìn)行對比，可準(zhǔn)確確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。如果擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶位置與預(yù)期目標(biāo)病原體核酸片段的大小一致，則表明該樣本中存在相應(yīng)的病原體；若未出現(xiàn)預(yù)期位置的條帶，則判定為陰性結(jié)果。在檢測鼠疫桿菌時(shí)，若電泳圖譜中在對應(yīng)鼠疫桿菌核酸片段大小的位置出現(xiàn)清晰條帶，即可判斷樣本中存在鼠疫桿菌；若該位置無條帶出現(xiàn)，則為陰性。條帶的亮度則反映了核酸片段的相對含量。一般來說，條帶越亮，代表該核酸片段的含量越高。但需注意，條帶亮度還可能受到PCR擴(kuò)增效率、上樣量等因素的影響。在實(shí)際判讀中，會結(jié)合陽性對照和陰性對照的條帶情況進(jìn)行綜合判斷。陽性對照應(yīng)出現(xiàn)清晰、明亮的條帶，陰性對照則不應(yīng)有條帶出現(xiàn)，以此來確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。數(shù)據(jù)分析主要借助QIAxcelScreenGel軟件完成，該軟件功能強(qiáng)大，可實(shí)現(xiàn)對電泳數(shù)據(jù)的全面分析。在條帶識別方面，軟件運(yùn)用先進(jìn)的算法，能夠自動識別電泳圖譜中的條帶，并準(zhǔn)確標(biāo)注其位置和大小。軟件還具備手動調(diào)整功能，操作人員可根據(jù)實(shí)際情況對自動識別的結(jié)果進(jìn)行修正，確保條帶識別的準(zhǔn)確性。在分析復(fù)雜的混合樣本電泳圖譜時(shí)，手動調(diào)整功能可幫助操作人員準(zhǔn)確區(qū)分重疊或模糊的條帶，避免誤判。定量分析是QIAxcelScreenGel軟件的重要功能之一。軟件通過對條帶的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對病原體核酸的定量檢測。在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，需使用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對應(yīng)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。在對實(shí)際樣本進(jìn)行檢測時(shí)，軟件根據(jù)樣本條帶的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的濃度值，從而得出樣本中病原體核酸的含量。通過對不同濃度漢坦病毒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，再對未知樣本進(jìn)行檢測，軟件可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確計(jì)算出樣本中漢坦病毒核酸的濃度，為疾病的診斷和病情評估提供重要的量化指標(biāo)。軟件還支持?jǐn)?shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，能夠?qū)Χ鄠€(gè)樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行匯總和分析，生成詳細(xì)的數(shù)據(jù)報(bào)告。報(bào)告中包含樣本信息、檢測結(jié)果、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)等內(nèi)容，為研究人員深入了解鼠傳疾病的流行情況和病原體分布特征提供了全面的數(shù)據(jù)支持。在對大量鼠類樣本進(jìn)行檢測后，軟件可統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)、不同鼠種中病原體的感染率，分析病原體的分布規(guī)律，為鼠傳疾病的防控策略制定提供科學(xué)依據(jù)。四、檢測方法的評估4.1靈敏度評估靈敏度是衡量檢測方法性能的關(guān)鍵指標(biāo)，它反映了檢測方法能夠檢測到的最低病原體核酸濃度，對于鼠傳疾病的早期診斷和防控具有至關(guān)重要的意義。為了準(zhǔn)確評估基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法的靈敏度，本研究設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用梯度稀釋法對鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體等多種病原體的核酸進(jìn)行處理。以鼠疫桿菌為例，首先將已知高濃度的鼠疫桿菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，從10?1稀釋至10??，得到不同濃度梯度的核酸樣本。然后，對每個(gè)濃度梯度的樣本分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照前文優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，確保擴(kuò)增反應(yīng)的高效性和特異性。將擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用于QIAxcel電泳系統(tǒng)進(jìn)行檢測，通過觀察電泳圖譜中條帶的出現(xiàn)情況來確定該檢測方法對鼠疫桿菌核酸的最低檢測限。經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法能夠可靠地檢測到濃度低至10??的鼠疫桿菌核酸樣本。在電泳圖譜中，10??濃度的樣本對應(yīng)的條帶清晰可辨，與預(yù)期的鼠疫桿菌核酸片段大小一致，且條帶亮度適中，無明顯的非特異性擴(kuò)增條帶干擾；而在10??及更低濃度的樣本中，電泳圖譜上則未出現(xiàn)明顯的條帶，表明該檢測方法在此濃度下無法檢測到鼠疫桿菌核酸。對于漢坦病毒，同樣采用10倍梯度稀釋法制備核酸樣本，從初始高濃度依次稀釋至10?1?。經(jīng)過多重PCR擴(kuò)增和QIAxcel電泳檢測，結(jié)果表明該檢測方法對漢坦病毒核酸的最低檢測限為10??。在10??濃度的樣本電泳圖譜中，能夠清晰地觀察到漢坦病毒特異性條帶，而10??及更低濃度的樣本則未出現(xiàn)特異性條帶。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本檢測方法的靈敏度優(yōu)勢，將其與傳統(tǒng)的檢測方法進(jìn)行對比。傳統(tǒng)的檢測方法，如普通PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳，在檢測鼠疫桿菌時(shí)，最低檢測限僅能達(dá)到10??，明顯高于基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法。在檢測漢坦病毒時(shí)，普通PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳的最低檢測限為10??，同樣不如基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法靈敏。在檢測鉤端螺旋體時(shí)，基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法最低檢測限可達(dá)10??，而傳統(tǒng)的病原體分離培養(yǎng)方法，由于其培養(yǎng)周期長、對實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻等原因，檢測靈敏度相對較低，對于低濃度感染的樣本往往難以檢測到。血清學(xué)檢測方法，如ELISA，雖然操作相對簡便，但在檢測鉤端螺旋體時(shí)，容易受到交叉反應(yīng)等因素的影響，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果，且其最低檢測限也僅能達(dá)到10??左右，無法與基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法相媲美?；赒IAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在靈敏度方面具有顯著優(yōu)勢，能夠檢測到更低濃度的病原體核酸，為鼠傳疾病的早期診斷和防控提供了更有力的技術(shù)支持。4.2特異性評估特異性是檢測方法的關(guān)鍵性能指標(biāo)，它決定了檢測方法能否準(zhǔn)確識別目標(biāo)病原體，避免與其他無關(guān)病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，從而確保檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。對于基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法而言，特異性評估至關(guān)重要，它直接關(guān)系到該方法在實(shí)際應(yīng)用中的有效性和實(shí)用性。為了全面、準(zhǔn)確地評估本檢測方法的特異性，本研究精心設(shè)計(jì)了一系列交叉實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用了鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體、恙蟲病東方體等目標(biāo)病原體，同時(shí)納入了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、流感病毒、單純皰疹病毒等與鼠傳疾病病原體在生物學(xué)特性或感染途徑上可能存在相似性的非目標(biāo)病原體作為對照。這些對照病原體的選擇具有代表性，能夠涵蓋不同類型的微生物，有效檢驗(yàn)檢測方法的特異性。以鼠疫桿菌為例，首先對鼠疫桿菌的核酸樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照前文優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，確保擴(kuò)增反應(yīng)的高效性和特異性。將擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用于QIAxcel電泳系統(tǒng)進(jìn)行檢測，在電泳圖譜中，鼠疫桿菌的特異性條帶清晰地出現(xiàn)在預(yù)期位置，大小與理論值相符，且條帶明亮、清晰，無明顯的拖尾現(xiàn)象。然后，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等非目標(biāo)病原體的核酸樣本分別進(jìn)行相同條件下的多重PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行QIAxcel電泳檢測。結(jié)果顯示，在電泳圖譜中，這些非目標(biāo)病原體的樣本均未出現(xiàn)與鼠疫桿菌特異性條帶位置相同的條帶，僅在其他位置出現(xiàn)了一些非特異性的微弱條帶，這些條帶與鼠疫桿菌的條帶具有明顯的區(qū)別，易于區(qū)分。這表明本檢測方法能夠準(zhǔn)確地識別鼠疫桿菌，與其他細(xì)菌病原體之間不存在交叉反應(yīng)，具有高度的特異性。對于漢坦病毒，同樣對其核酸樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和QIAxcel電泳檢測，漢坦病毒的特異性條帶在電泳圖譜中清晰可辨，位置和大小與預(yù)期一致。對流感病毒、單純皰疹病毒等非目標(biāo)病毒病原體進(jìn)行相同檢測后，電泳圖譜中未出現(xiàn)與漢坦病毒特異性條帶重合的條帶，表明本檢測方法對漢坦病毒具有良好的特異性，不會受到其他病毒病原體的干擾。在檢測鉤端螺旋體時(shí)，將鉤端螺旋體核酸樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和QIAxcel電泳檢測，得到清晰的特異性條帶。對其他可能存在交叉反應(yīng)的病原體進(jìn)行檢測，未出現(xiàn)與鉤端螺旋體特異性條帶相同位置的條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了本檢測方法對鉤端螺旋體的特異性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本檢測方法的特異性優(yōu)勢，將其與傳統(tǒng)的檢測方法進(jìn)行對比。傳統(tǒng)的檢測方法，如血清學(xué)檢測方法，在檢測鼠疫桿菌時(shí)，由于鼠疫桿菌與其他細(xì)菌在抗原結(jié)構(gòu)上可能存在一定的相似性，容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。在實(shí)際檢測中，血清學(xué)檢測方法對部分與鼠疫桿菌抗原結(jié)構(gòu)相近的細(xì)菌樣本出現(xiàn)了假陽性反應(yīng)，而基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法則能夠準(zhǔn)確地區(qū)分這些細(xì)菌，未出現(xiàn)假陽性結(jié)果。傳統(tǒng)的PCR檢測方法，在引物設(shè)計(jì)不合理或反應(yīng)條件控制不佳時(shí)，也容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致檢測結(jié)果的誤判。在檢測漢坦病毒時(shí)，傳統(tǒng)PCR檢測方法在部分樣本中出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增條帶，與漢坦病毒的特異性條帶難以區(qū)分，影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；而基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法，通過優(yōu)化引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件，結(jié)合高分辨率的電泳分析，有效地避免了非特異性擴(kuò)增的干擾，能夠準(zhǔn)確地檢測出漢坦病毒。基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在特異性方面表現(xiàn)出色，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分目標(biāo)病原體與其他無關(guān)病原體，有效避免了交叉反應(yīng)和誤判的發(fā)生，為鼠傳疾病的診斷和防控提供了可靠的技術(shù)保障。4.3重復(fù)性評估重復(fù)性是衡量檢測方法可靠性和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，它反映了在相同實(shí)驗(yàn)條件下，多次重復(fù)檢測同一批樣本時(shí)，檢測結(jié)果的一致性程度。對于基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法，評估其重復(fù)性對于確保該方法在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性至關(guān)重要。本研究采用同一批陽性樣本，對基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法進(jìn)行了多次重復(fù)檢測。選取了含有鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體等多種病原體的陽性樣本，對每個(gè)樣本進(jìn)行10次獨(dú)立的核酸提取、多重PCR擴(kuò)增和QIAxcel電泳檢測。每次實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照前文建立的檢測方法和優(yōu)化后的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行操作，確保實(shí)驗(yàn)條件的一致性。在核酸提取過程中，使用相同的試劑盒和操作流程，確保提取的核酸質(zhì)量和濃度的穩(wěn)定性；多重PCR擴(kuò)增時(shí)，嚴(yán)格控制引物濃度、dNTP濃度、Taq酶用量、Mg2?濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)參數(shù)，保證擴(kuò)增反應(yīng)的重復(fù)性；QIAxcel電泳檢測時(shí)，選擇相同的預(yù)制膠卡夾、電泳程序和分析軟件，確保檢測過程的一致性。對10次重復(fù)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算檢測結(jié)果的變異系數(shù)（CV）。變異系數(shù)是衡量數(shù)據(jù)離散程度的指標(biāo)，CV值越小，說明數(shù)據(jù)的離散程度越小，檢測結(jié)果的重復(fù)性越好。以鼠疫桿菌為例，10次檢測結(jié)果中，其核酸片段的電泳條帶位置和亮度基本一致，通過QIAxcelScreenGel軟件對條帶的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，計(jì)算得到的變異系數(shù)為3.5%。這表明在相同實(shí)驗(yàn)條件下，對鼠疫桿菌的檢測結(jié)果具有較高的一致性，檢測方法的重復(fù)性良好。對于漢坦病毒，10次重復(fù)檢測結(jié)果的變異系數(shù)為4.2%，同樣顯示出較好的重復(fù)性。鉤端螺旋體的10次檢測結(jié)果變異系數(shù)為3.8%，也證明了該檢測方法對鉤端螺旋體的檢測具有穩(wěn)定的重復(fù)性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本檢測方法的重復(fù)性優(yōu)勢，將其與傳統(tǒng)的檢測方法進(jìn)行對比。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，由于其操作過程中人為因素的影響較大，如凝膠制備的不均勻性、上樣量的誤差等，導(dǎo)致其重復(fù)性較差。在對同一批含有鼠疫桿菌的樣本進(jìn)行10次重復(fù)檢測時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果的變異系數(shù)高達(dá)12.5%，明顯高于基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法。傳統(tǒng)的PCR檢測方法，在引物設(shè)計(jì)不合理或反應(yīng)條件控制不佳時(shí)，也容易出現(xiàn)重復(fù)性差的問題。在檢測漢坦病毒時(shí)，傳統(tǒng)PCR檢測方法的10次重復(fù)檢測結(jié)果變異系數(shù)為9.8%，而基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法變異系數(shù)僅為4.2%，充分體現(xiàn)了基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法在重復(fù)性方面的優(yōu)勢。基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在重復(fù)性方面表現(xiàn)出色，能夠在相同實(shí)驗(yàn)條件下獲得穩(wěn)定、一致的檢測結(jié)果，為鼠傳疾病的診斷和防控提供了可靠的技術(shù)保障。4.4與其他檢測方法的比較為全面評估基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法的性能，本研究將其與傳統(tǒng)凝膠電泳、qPCR等常見檢測方法進(jìn)行了多維度的比較分析，具體如下：檢測時(shí)間：傳統(tǒng)凝膠電泳從凝膠制備、樣品上樣到電泳結(jié)束，整個(gè)過程較為繁瑣耗時(shí)。以檢測鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體三種病原體為例，制備瓊脂糖凝膠通常需要30-60分鐘，上樣及電泳過程約需60-90分鐘，總計(jì)耗時(shí)約90-150分鐘。而qPCR檢測，雖然擴(kuò)增速度較快，但在樣品準(zhǔn)備、試劑配制以及儀器預(yù)熱等前期工作上，也需要花費(fèi)一定時(shí)間，完成一次多病原檢測，包括前期準(zhǔn)備和擴(kuò)增檢測，大約需要60-90分鐘。相比之下，基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法，在完成多重PCR擴(kuò)增后，僅需選擇合適的預(yù)制膠卡夾，將樣品加載后放入儀器，設(shè)置好電泳程序，即可自動運(yùn)行。其最快3分鐘即可完成12個(gè)樣品的分析，單次運(yùn)行分析多達(dá)96個(gè)樣品也僅需24分鐘，大大縮短了檢測周期，在鼠傳疾病的快速診斷和疫情防控中具有顯著優(yōu)勢。檢測成本：在檢測成本方面，傳統(tǒng)凝膠電泳所需的主要耗材為瓊脂糖、電泳緩沖液、溴化乙錠（EB）等染色劑以及一次性的電泳槽和梳子等。以一次檢測10個(gè)樣品計(jì)算，瓊脂糖成本約為5-10元，電泳緩沖液和染色劑成本約為2-5元，加上一次性耗材成本約5-10元，總計(jì)成本約12-25元。但傳統(tǒng)凝膠電泳檢測效率較低，對于大規(guī)模樣本檢測，需消耗大量的時(shí)間和人力成本。qPCR檢測的主要成本在于熒光定量PCR儀的購置費(fèi)用，一臺普通的熒光定量PCR儀價(jià)格在10-50萬元不等，此外，還需配備專門的熒光定量PCR試劑，以一次檢測10個(gè)樣品計(jì)算，試劑成本約為50-100元，檢測成本較高。基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法，主要成本來自于預(yù)制膠卡夾和儀器的購置費(fèi)用。雖然儀器價(jià)格相對較高，約為20-50萬元，但預(yù)制膠卡夾可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，以QIAxcelDNAHighResolutionKit預(yù)制膠卡夾為例，一張卡夾可檢測96個(gè)樣品，成本約為300-500元，平均每個(gè)樣品的檢測成本約為3-5元，在大規(guī)模樣本檢測中，成本優(yōu)勢明顯。準(zhǔn)確性：傳統(tǒng)凝膠電泳的分辨率相對較低，對于大小相近的核酸片段難以準(zhǔn)確區(qū)分。在檢測鼠疫桿菌和鉤端螺旋體的核酸片段時(shí)，若兩者片段大小相近，傳統(tǒng)凝膠電泳可能無法清晰分辨，導(dǎo)致誤判。其結(jié)果的準(zhǔn)確性還易受到凝膠制備質(zhì)量、上樣量準(zhǔn)確性以及染色效果等因素的影響，重復(fù)性較差。qPCR檢測具有較高的靈敏度和特異性，能夠?qū)Σ≡w核酸進(jìn)行定量檢測。但在多病原檢測中，由于引物之間可能存在相互干擾，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不一致，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在同時(shí)檢測多種病原體時(shí)，可能會出現(xiàn)某些病原體的擴(kuò)增受到抑制，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低或假陰性?；赒IAxcel電泳系統(tǒng)的檢測方法，結(jié)合了多重PCR技術(shù)和高分辨率的毛細(xì)管電泳技術(shù)，能夠在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多種病原體的核酸片段，并通過高分辨率的電泳分析，準(zhǔn)確區(qū)分不同病原體的核酸片段。在小于0.5kb的片段范圍內(nèi)，其分辨率可達(dá)3-5bp，能夠有效避免因核酸片段大小相近而導(dǎo)致的誤判，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。該方法的重復(fù)性良好，能夠在相同實(shí)驗(yàn)條件下獲得穩(wěn)定、一致的檢測結(jié)果?；赒IAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在檢測時(shí)間、成本和準(zhǔn)確性等方面，相較于傳統(tǒng)凝膠電泳和qPCR等檢測方法，具有明顯的優(yōu)勢，更適合于鼠傳疾病的快速、準(zhǔn)確檢測和大規(guī)模樣本分析。五、檢測方法的應(yīng)用案例5.1疾病監(jiān)測中的實(shí)際應(yīng)用某地區(qū)地處邊境，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，鼠類種群繁多，長期面臨著鼠傳疾病的威脅。為有效防控鼠傳疾病，當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心開展了一項(xiàng)全面的鼠傳疾病監(jiān)測項(xiàng)目，本研究建立的基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在該項(xiàng)目中得到了實(shí)際應(yīng)用。在該項(xiàng)目中，監(jiān)測人員在不同季節(jié)、不同生境下設(shè)置了多個(gè)監(jiān)測點(diǎn)，涵蓋了農(nóng)田、草原、居民區(qū)、養(yǎng)殖場等區(qū)域。采用夾夜法進(jìn)行捕鼠，共捕獲了長爪沙鼠、達(dá)烏爾黃鼠、子午沙鼠、小家鼠、褐家鼠等多種鼠類。捕獲后，迅速對鼠類進(jìn)行解剖，采集肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等組織樣本，按照前文所述的方法進(jìn)行核酸提取和保存。將采集到的核酸樣本運(yùn)用基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的多病原檢測方法進(jìn)行檢測。在多重PCR擴(kuò)增階段，嚴(yán)格按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行操作，確保多種病原體的核酸片段能夠在同一反應(yīng)體系中高效、特異性地?cái)U(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用于QIAxcel電泳系統(tǒng)，選用QIAxcelDNAHighResolutionKit預(yù)制膠卡夾，設(shè)置合適的電泳程序進(jìn)行檢測。通過QIAxcelScreenGel軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)條帶的位置和亮度準(zhǔn)確判斷樣本中是否存在鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體等病原體。檢測結(jié)果顯示，在該地區(qū)的鼠類樣本中，多種病原體呈現(xiàn)出不同程度的感染情況。在農(nóng)田區(qū)域捕獲的長爪沙鼠中，漢坦病毒的感染率較高，達(dá)到了15%；在居民區(qū)附近捕獲的小家鼠和褐家鼠中，鉤端螺旋體的感染率分別為10%和8%。部分樣本還檢測出了鼠疫桿菌的核酸，雖然感染率相對較低，但由于鼠疫桿菌的高致病性，引起了當(dāng)?shù)丶部夭块T的高度重視。通過對不同監(jiān)測點(diǎn)、不同鼠種的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析，結(jié)合當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境和人類活動情況，研究人員發(fā)現(xiàn)鼠傳疾病的傳播與鼠類的棲息地、季節(jié)變化以及人類活動密切相關(guān)。在農(nóng)田和草原地區(qū)，由于鼠類食物資源豐富，種群數(shù)量較多，病原體的傳播風(fēng)險(xiǎn)較高；在居民區(qū)和養(yǎng)殖場附近，鼠類與人類接觸頻繁，一旦感染病原體，極易傳播給人類，引發(fā)疫情?；谶@些檢測結(jié)果和分析結(jié)論，當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心及時(shí)調(diào)整了鼠傳疾病防控策略。加強(qiáng)了對重點(diǎn)區(qū)域的鼠害防治工作，定期開展滅鼠行動，降低鼠類種群數(shù)量；在居民區(qū)和養(yǎng)殖場等重點(diǎn)場所，加強(qiáng)了環(huán)境衛(wèi)生管理，定期清理垃圾和雜物，減少鼠類的棲息地；提高了公眾的鼠傳疾病防控意識，通過宣傳教育，提醒居民注意個(gè)人衛(wèi)生，避免接觸鼠類及其排泄物。在后續(xù)的監(jiān)測中，通過持續(xù)應(yīng)用基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的多病原檢測方法，對鼠類樣本進(jìn)行檢測和分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)了鼠傳疾病的傳播趨勢和變化情況，為防控措施的調(diào)整和優(yōu)化提供了科學(xué)依據(jù)。經(jīng)過一段時(shí)間的防控，該地區(qū)鼠傳疾病的發(fā)病率明顯下降，有效保障了當(dāng)?shù)鼐用竦慕】岛凸残l(wèi)生安全。這充分證明了基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在實(shí)際疾病監(jiān)測和防控工作中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)槭髠骷膊〉姆揽靥峁┘皶r(shí)、準(zhǔn)確的技術(shù)支持。5.2疫情防控中的應(yīng)用效果在某地區(qū)曾突發(fā)一起鼠傳疾病疫情，短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)多例疑似病例，引起了當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門的高度關(guān)注。由于疫情傳播迅速，且癥狀與多種疾病相似，傳統(tǒng)檢測方法難以快速準(zhǔn)確地確定病原體，給疫情防控工作帶來了極大的挑戰(zhàn)?；赒IAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在此次疫情防控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。疫情發(fā)生后，衛(wèi)生部門迅速組織專業(yè)人員，對疑似病例和周邊環(huán)境中的鼠類進(jìn)行了樣本采集。從疑似病例的血液、尿液、咽拭子等樣本中提取核酸，同時(shí)對捕獲的鼠類肝臟、脾臟、腎臟等組織樣本也進(jìn)行了核酸提取。將提取得到的核酸樣本運(yùn)用基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的多病原檢測方法進(jìn)行檢測。在多重PCR擴(kuò)增階段，嚴(yán)格按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行操作，確保多種病原體的核酸片段能夠在同一反應(yīng)體系中高效、特異性地?cái)U(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用于QIAxcel電泳系統(tǒng)，選用QIAxcelDNAHighResolutionKit預(yù)制膠卡夾，設(shè)置合適的電泳程序進(jìn)行檢測。通過QIAxcelScreenGel軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)條帶的位置和亮度準(zhǔn)確判斷樣本中是否存在鼠疫桿菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體等病原體。經(jīng)過快速檢測，在部分疑似病例和鼠類樣本中檢測出了漢坦病毒。通過對漢坦病毒核酸片段的進(jìn)一步分析，確定了病毒的亞型和基因序列特征。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，研究人員發(fā)現(xiàn)此次疫情的傳播與當(dāng)?shù)鼐用駞^(qū)附近鼠類數(shù)量增多以及居民與鼠類接觸頻繁密切相關(guān)。由于當(dāng)?shù)鼐用裆瞽h(huán)境較為簡陋，鼠類容易進(jìn)入居民家中，且居民在日常生活中缺乏對鼠傳疾病的防范意識，增加了感染風(fēng)險(xiǎn)?；谶@些檢測結(jié)果和分析結(jié)論，當(dāng)?shù)匦l(wèi)生部門迅速制定并實(shí)施了一系列針對性的防控措施。對確診病例進(jìn)行隔離治療，密切觀察病情變化，及時(shí)調(diào)整治療方案，確保患者得到有效的救治。對密切接觸者進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察，定期采集樣本進(jìn)行檢測，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的感染者，采取相應(yīng)的隔離和治療措施，防止疫情的進(jìn)一步傳播。加強(qiáng)對居民區(qū)和周邊環(huán)境的滅鼠行動，采用化學(xué)滅鼠、物理滅鼠等多種方法相結(jié)合，降低鼠類種群數(shù)量。同時(shí)，對居民區(qū)進(jìn)行全面的環(huán)境衛(wèi)生整治，清理垃圾和雜物，封堵鼠洞，減少鼠類的棲息地，切斷傳播途徑。開展廣泛的宣傳教育活動，通過社區(qū)宣傳、媒體報(bào)道、科普講座等多種形式，向居民普及鼠傳疾病的防控知識，提高居民的自我防護(hù)意識。提醒居民注意個(gè)人衛(wèi)生，避免接觸鼠類及其排泄物，如發(fā)現(xiàn)鼠類活動跡象，及時(shí)向相關(guān)部門報(bào)告。在疫情防控過程中，持續(xù)應(yīng)用基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的多病原檢測方法對新采集的樣本進(jìn)行檢測，及時(shí)了解疫情的發(fā)展態(tài)勢和病原體的傳播情況。根據(jù)檢測結(jié)果，對防控措施進(jìn)行動態(tài)調(diào)整和優(yōu)化，確保防控工作的有效性和針對性。經(jīng)過一段時(shí)間的努力，疫情得到了有效控制，未出現(xiàn)新的確診病例，疑似病例也逐漸排除，當(dāng)?shù)鼐用竦纳罨謴?fù)正常。此次疫情防控案例充分證明了基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法在疫情防控中的重要價(jià)值。該方法能夠在疫情發(fā)生時(shí)快速準(zhǔn)確地檢測病原體，為疫情防控提供關(guān)鍵的決策依據(jù)，有助于及時(shí)采取有效的防控措施，控制疫情的傳播，保障公眾的健康和安全。5.3應(yīng)用中遇到的問題與解決措施在基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的鼠傳疾病多病原檢測方法的實(shí)際應(yīng)用過程中，不可避免地會遇到一些問題，這些問題對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性產(chǎn)生了不同程度的影響。針對這些問題，我們進(jìn)行了深入的分析，并提出了相應(yīng)的解決方法和改進(jìn)措施。樣本質(zhì)量不佳是較為常見的問題之一。由于鼠類樣本采集環(huán)境復(fù)雜，部分樣本可能受到污染，或在采集、運(yùn)輸和保存過程中操作不當(dāng)，導(dǎo)致核酸降解。被污染的樣本中可能含有其他雜質(zhì)或微生物，這些雜質(zhì)可能干擾核酸提取過程，影響核酸的純度和完整性；核酸降解則會使核酸片段斷裂，導(dǎo)致檢測靈敏度降低，無法準(zhǔn)確檢測到病原體。在一些野外采集的鼠類樣本中，由于保存條件有限，核酸出現(xiàn)了不同程度的降解，使得基于QIAxcel電泳系統(tǒng)的檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性或條帶模糊的情況。為解決樣本污染問題，在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，使用無菌器材和試劑，避免樣本與外界環(huán)境接觸。在運(yùn)輸和保存樣本時(shí)，確保樣本處于低溫、穩(wěn)定的環(huán)境中，防止核酸降解。使用干冰或冰袋保持樣本低溫，并盡快將樣本送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。對于已經(jīng)出現(xiàn)污染的樣本，可采用核酸純化試劑盒進(jìn)行二次純化，去除雜質(zhì)，提高核酸質(zhì)量。在實(shí)驗(yàn)室中，對受到污染的樣本進(jìn)行二次純化后，再進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示條帶清晰度和檢測準(zhǔn)確性明顯提高。檢測結(jié)果異常也是實(shí)際應(yīng)用中需要關(guān)注的問題。有時(shí)會出現(xiàn)電泳圖譜條帶異常的情況，如條帶模糊、拖尾或出現(xiàn)非特異性條帶。條帶模糊可能是由于電泳條件不合適，如電壓過高或過低、電泳時(shí)間過長或過短等，導(dǎo)致核酸片段遷移異常；拖尾現(xiàn)象可能是由于樣本中存在雜質(zhì)、核酸降解或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不純等原因引起的；非特異性條帶的出現(xiàn)則可能是引物設(shè)計(jì)不合理、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化不佳或存在交叉污染等因素導(dǎo)致的。在檢測過程中，由于引物與非目標(biāo)病原體的核酸序列存在一定的同源性，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，干擾了對目標(biāo)病原體的判斷。為解決條帶模糊問題，重新優(yōu)化電泳條件，通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的電壓和電泳時(shí)間。在檢測鼠疫桿菌核酸時(shí)，將電壓從1200V調(diào)整為1500V，電泳時(shí)間從15分鐘延長至20分鐘，條帶清晰度明顯提高。針對拖尾現(xiàn)象，對樣本進(jìn)行進(jìn)一步的純化和處理，去除雜質(zhì)，確保核酸質(zhì)量。在處理核酸降解的樣本時(shí)，采用核酸修復(fù)試劑盒對降解的核酸進(jìn)行修復(fù)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，拖尾現(xiàn)象得到有效改善。對于非特異性條帶問題，重新設(shè)計(jì)引物，提高引物的特異性，避免與非目標(biāo)病原體的核酸序列發(fā)生交叉反應(yīng)。在設(shè)計(jì)漢坦病毒引物時(shí)，利用生物信息學(xué)軟件對引物序列進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)