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文檔簡介
2T/XXXXXXX—XXXX燕麥品種真實(shí)性檢驗(yàn)規(guī)程——SSR標(biāo)記法本文件規(guī)定了利用簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記進(jìn)行燕麥(AvenasativaL.)品種鑒定的術(shù)語和定義、縮略語、原理、試驗(yàn)樣品、儀器設(shè)備及試劑、溶液配制、引物信息、操作步驟、數(shù)據(jù)記錄及統(tǒng)計、結(jié)果判定與表述。本文件適用于基于SSR標(biāo)記的燕麥品種DNA分子數(shù)據(jù)采集及品種真實(shí)性鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標(biāo)記法總則NY/T4498大蔥品種鑒定SSR分子標(biāo)記法DB62/T4094草品種真實(shí)性檢驗(yàn)規(guī)程SSR標(biāo)記法3術(shù)語和定義NY/T2594界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp:堿基對(basepair)。DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)。CTAB:十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammoniumbromide)。TBE:三羥甲基氨基甲烷-硼酸鹽-乙二胺四乙酸(Tris-borate-EDTA)。TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N,,N,-tetramethylethylenediamine)。PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)。PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)。SSR:簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeat)。TE:三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)。5原理燕麥品種基因組存在著大量能夠穩(wěn)定遺傳的SSR標(biāo)記,不同燕麥品種在同一SSR的重復(fù)次數(shù)存在差異,這種差異可通過PCR擴(kuò)增及電泳方法進(jìn)行檢測,進(jìn)而區(qū)分不同的燕麥品種。6試驗(yàn)樣品6.1樣品種類送檢樣品為種子或葉片組織。6.2樣品要求每份樣品檢測20個個體,種子、葉片混合提取DNA或先單獨(dú)提取DNA后取等量DNA混合。7儀器設(shè)備及試劑T/XXXXXXX—XXXX3見附錄A。8溶液配制見附錄B,所用試劑均為分析純試劑。9引物信息引物及序列見附錄C,引物相關(guān)信息見附錄D。利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測和LabchipGXTouch大分子分析系統(tǒng)檢測時選擇普通引物,利用熒光毛細(xì)管電泳檢測時選擇熒光標(biāo)記引物,熒光標(biāo)記位于正向引物5'端??衫酶戒汣中的引物序貫檢測,當(dāng)檢測到的差異位點(diǎn)數(shù)能判定送檢樣品與對照樣品不同時,停止檢測。10操作步驟10.1DNA提取稱取幼嫩組織混合樣本約200mg,經(jīng)液氮充分研磨后置于2.0ml圓底離心管中;每管加人600μL預(yù)熱至65℃的CTAB提取液,充分混合65℃水浴45min~60min,每隔15min輕緩顛倒混勻1次。每管加入與CTAB提取液等體積的三氯甲烷和異戊醇混合液,輕緩混勻后靜置10min,4℃,12000r/min離心10min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入等體積預(yù)冷的異丙醇,輕輕顛倒混勻,-20℃放置30min,4℃,12000r/min離心10min,棄上清液,用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液洗滌2遍,晾干,加入100μL雙蒸水或TE緩沖液充分溶解,檢測DNA濃度和質(zhì)量,-20℃保存?zhèn)溆谩W?以上為推薦的DNA提取方法,滿足PCR擴(kuò)增要求的其他DNA提取方法均適用于本文件。DNA溶液的紫外吸光度OD260與OD280的比值宜介于1.7~2.0。10.2PCR擴(kuò)增10.2.1反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積和各組分的終濃度參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T4498。10.2.2反應(yīng)程序反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,1個循環(huán),94℃變性30s,60℃退火(退火溫度依引物而定)30s,72℃延伸30s,35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。反應(yīng)程序中各反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)PCR擴(kuò)增儀型號、酶、引物等不同而做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。10.3擴(kuò)增產(chǎn)物分離10.3.1非變性PAGE垂直板電泳10.3.1.1制膠用洗滌劑清洗長玻璃板和凹玻璃板,再用雙蒸水、無水乙醇依次擦拭兩遍,晾干后,用紗布均勻?qū)⒂H水硅烷和疏水硅烷擦于玻璃板上,長板涂親和硅烷,短板涂剝離硅烷,待玻璃板徹底干燥后,將其組裝成電泳膠板,取100m1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的PAGE膠溶液,加入50μL四甲基乙二胺(TEMED)和500μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的過硫酸銨(APS),迅速混勻后將其加入兩玻璃板之間,直到液體出溢出為止,灌膠時避免產(chǎn)生氣泡,立即插入梳子,插入梳子時應(yīng)檢查梳子下是否有氣泡,聚合至少1小時以上,膠聚合后,清理膠板表面溢出的膠液,輕輕拔出梳子,用水清洗干凈備用。10.3.1.2預(yù)電泳將膠板安裝于電泳槽上,蓋上電泳槽電極蓋,在正極槽和負(fù)極槽(上下)加入1×TBE緩沖液,使其超出凝膠頂部2cm~3cm,在200V電壓下,使其預(yù)電泳20min~30min,使凝膠預(yù)熱。10.3.1.3電泳T/XXXXXXX—XXXX4用注射器吸取緩沖液沖洗凝膠頂端幾次,清除氣泡和凝膠碎片,同時將膠條撥正。每個加樣孔點(diǎn)2μl~4μl樣品,除待測樣品外同時加入?yún)⒄掌贩N擴(kuò)增產(chǎn)物。在200V恒壓下電泳1.5h~2.5h(電泳時間取決于擴(kuò)增片段的大小范圍),電泳結(jié)束后小心分開兩塊玻璃板,準(zhǔn)備銀染。10.3.1.4銀染將凝膠板置于裝有固定液的塑料盒內(nèi),輕輕搖蕩5min后取出,再用雙蒸水漂洗3min;將凝膠板放置新配銀染液中,避光輕輕搖蕩10min后取出,再用雙蒸水快速漂洗,時間不超過10s;將凝膠板放置于顯影液中,輕輕搖蕩,直至出現(xiàn)帶紋。待帶紋清晰后取出,迅速置于固定液中定影2min,然后在雙蒸水中漂洗2min;取出凝膠板室溫下自然晾干,放在膠片觀察燈上觀察,記錄結(jié)果,拍照保存。固定液、染色液、雙蒸水和顯影液用量,可依據(jù)膠板數(shù)量和大小調(diào)整,以沒過膠面為準(zhǔn)。10.3.1.5拍照或掃描保存凝膠數(shù)據(jù)拍照將凝膠呈現(xiàn)出的結(jié)果保存。10.3.2熒光毛細(xì)管電泳10.3.2.1PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)備根據(jù)預(yù)先確定的引物分組,分別取等體積不同熒光標(biāo)記引物的擴(kuò)增產(chǎn)物,混勻稀釋。吸取1μL混合液,加入DNA分析儀配套上樣板中。注:稀釋倍數(shù)通過熒光毛細(xì)管電泳預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。10.3.2.2變性上樣板各孔分別加人0.1μL分子量內(nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺,在PCR擴(kuò)增儀上95℃變性5min,取出后立即置于冰上,冷卻10min以上,瞬時離心10s后備用。10.3.2.3電泳按照DNA分析儀操作手冊進(jìn)行電泳并保留電泳原始數(shù)據(jù)。10.3.2.4LabchipGXTouch大分子分析系統(tǒng)10.3.2.4.1制備凝膠向1管(1100μL)凝膠基質(zhì)中加入13μL染料濃縮物,漩渦混勻后將混合物分別轉(zhuǎn)移至兩個旋轉(zhuǎn)過濾器中,在室溫下以9200rcf離心10min,確保所有凝膠都已通過過濾器后將過濾器丟棄。10.3.2.4.2芯片制備用雙蒸水沖洗活性孔兩次,最后一次要把孔里的液體吸干凈,使用反向移液技術(shù)將凝膠染料、DNAHiSensMarker添加到芯片孔中,用布子清潔芯片圓形窗的兩側(cè),將芯片放入槽中。10.3.2.4.3電泳吸取PCR產(chǎn)物30μL~40μL于96孔板中,編輯樣品表,運(yùn)行程序。10.3.2.4.4清洗將芯片從艙中拿出,用雙蒸水沖洗活性孔兩次,添加100μLStorageBuffer到活性孔中,將芯片放回艙中,確保緩沖管具有750μL雙蒸水,點(diǎn)擊清洗按鈕,清洗10min。11數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計每個SSR位點(diǎn)的等位變異參照擴(kuò)增片段大小確定,見附錄D。對于變性PAGE和LabchipGXTouch大分子分析系統(tǒng),將送檢樣品在某一位點(diǎn)擴(kuò)增片段的遷移位置與對應(yīng)的參照品種進(jìn)行比較,確定送檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異。對于熒光毛細(xì)管電泳,通過參照品種消除不同批次或者不同型號DNA分析儀可能存在的系統(tǒng)誤差,使用片段分析軟件讀取送檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異。T/XXXXXXX—XXXX5純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X,雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y,其中X、Y分別為該位點(diǎn)上的兩個等位變異,小片段數(shù)據(jù)在前,大片段數(shù)據(jù)在后。缺失位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為0/0。示例1:樣品在某個位點(diǎn)上僅出現(xiàn)一個等位變異,為160bp,則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/160。示例2:樣品在某個位點(diǎn)上有兩個等位變異,分別為,160bp、165bp,則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/165。12結(jié)果判定與表示結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照DB62/T4094-2020草品種真實(shí)性檢驗(yàn)規(guī)程SSR標(biāo)記法執(zhí)行。T/XXXXXXX—XXXX6(規(guī)范性)主要儀器設(shè)備及試劑A.1主要儀器設(shè)備——PCR擴(kuò)增儀。——高壓電泳儀:電壓大于200V,具有恒電壓、恒電流和恒功率功能。——垂直電泳槽及配套的制膠附件?!诫娪静奂芭涮椎闹颇z附件?!咚倮鋬鲭x心機(jī)?!″伝蚋墒胶銣亟饘僭 !贤夥止夤舛扔嫽蚝怂釢舛葴y定儀?!⒘恳埔浩鳎阂?guī)格分別為10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL?!椦醒心x。——電子天平。——LabchipGXTouch大分子分析系統(tǒng)?!嗤ǖ酪埔浩鳌!邏簻缇??!姛岷銣毓娘L(fēng)干燥箱?!訜岽帕嚢杵??!洹!⒉t?!z片觀察燈?!綋u床?!獢?shù)碼相機(jī)或凝膠成像系統(tǒng)?!票鶛C(jī)。A.2主要試劑——液氮?!叶匪囊宜幔‥thylenediamine-tetraaceticacid,EDTA)?!H和硅烷?!杷柰?。——過硫酸胺((NH3)2S2O3)。——冰醋酸?!跛徙y?!兹┤芤??!獰o水乙醇。——?dú)溲趸c。——去離子水?!?0×TBE緩存液?!?0%丙烯酰胺溶液?!z基質(zhì)(DNAHiSensGelMatrix)?!玖蠞饪s物(DNADyeConcentrate)。T/XXXXXXX—XXXX7(規(guī)范性)溶液配置B.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制B.1.1親和硅烷緩沖液49.75mL無水乙醇250μL冰醋酸,用去離子水定容至50mL,常溫避光干燥處保存?zhèn)溆谩.1.2剝離硅烷溶液將5μL親和硅烷原液和1mL親和硅烷緩沖液混合,常溫避光干燥處保存?zhèn)溆谩.1.310×TBE緩沖液稱取108.00g三羧甲基氨基甲烷和55.00g硼酸溶于水中,加入37mL0.5mol/L的EDTA溶液,用蒸餾水定容至1000mL,常溫避光干燥處保存?zhèn)溆?。B.1.41×TBE緩沖液量取500mL10×TBE緩沖液,用去離子水定容至5000mL,常溫避光干燥處保存?zhèn)溆?。B.1.510%過硫酸銨溶液稱取10.00g過硫酸銨溶于100mL水中。分裝后保存于冰箱冷凍室中備用。B.2銀染溶液的配制B.2.1固定液量取100mL冰醋酸,加入1000mL去離子水。B.2.2染色液稱取2.00g硝酸銀,溶于1000mL去離子水中。B.2.3顯影液稱取15.00g氫氧化鈉,溶于1000mL的蒸餾水中,使用之前加入6mL的甲醛。T/XXXXXXX—XXXX8(規(guī)范性)引物相關(guān)信息33AGTTCTAGCTTGCACAGTTA3AGGGGAATTTCTAAGGTTCAT56AGTGGCCCAATATCTCCTA722AGCAGTACATACACATACAC3AGTTCTAGCTTGCACAGTTA26AGTGGCCCAATATCTCCTA2AATTATGTACCTGACGTCGA436251T/XXXXXXX—XXXX9(規(guī)范性)數(shù)據(jù)統(tǒng)計記錄表/青引1號/隴燕3號隴燕4號/福瑞至穆思特///小金紅/T/XXXXXXX—XXXX(規(guī)范性)參照品種相關(guān)信息參照品種相關(guān)信息見表E.1表E.1參照品種相關(guān)信息序號品種名稱品種來源1壩莜內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)2林納北京正道種業(yè)有限公司3甜燕麥內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)4美達(dá)北京正道種業(yè)有限公司5楷模北京正道種業(yè)有限公司6愛沃北京正道種業(yè)有限公司7百世北京正道種業(yè)有限公司8艾博北京正道種業(yè)有限公司9福瑞至北京正道種業(yè)有限公司福星北京正道種業(yè)有限公司太陽神北京正道種業(yè)有限公司領(lǐng)袖北京正道種業(yè)有限公司青海444內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蒙飼燕1號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)青引2號內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蒙飼燕6號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)白燕7號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)阿爾山蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司青引1號內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院20燕麥10號蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司21穆思特北京正道種業(yè)有限公司22蒙農(nóng)大燕1號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)23隴燕1號甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)24壩莜18號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)25ZX-1129蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司26壩燕7號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)27ZX-4502蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司28隴燕4號甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)29甜燕2號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)30五寨三分三內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)31壩莜14號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)32貝勒北京正道種業(yè)有限公司33隴燕3號甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)34大莜麥內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)35261內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)36白燕17號吉林省白城市農(nóng)科院37白燕19號吉林省白城市農(nóng)科院38白燕21號吉林省白城市農(nóng)科院39烏燕3號蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司40ZX-8242蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司41皮燕麥P-4239-2212201709蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司42牧豐蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司43壩莜20號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)T/XXXXXXX—XXXX44壩燕8號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)45加燕2號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)46草莜1號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)47蒙燕3號內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)48ZX-1187蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司49ZX-5046蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司50丹8內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)
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