ICS

CCS

HNSPXH

河南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/HNSPXHXXX—XXXX

淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

Identificationofmaizeandcassava

componentsinstarchesandproducts-LMTIA

method

征求意見稿

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

河南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)發(fā)布

T/HNSPXHXXX—XXXX

淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。

本文件適用于淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的定性檢測(cè)。

本文件所規(guī)定方法的檢出限（LOD）為1%（質(zhì)量比）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T12104淀粉術(shù)語

GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

3術(shù)語和定義

GB/T12104界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

4方法提要

提取樣品DNA，用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對(duì)照，用已知不含玉米、木薯成分的

樣品DNA作陰性對(duì)照，滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照，使用特異性引物和探針，采用梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)

增技術(shù)，根據(jù)熒光信號(hào)和擴(kuò)增現(xiàn)象，判定是否存在玉米、木薯源性成分。

5原理

選擇Tm值曲線為梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特異性核酸片段為靶序列設(shè)計(jì)巢

式引物，將巢式引物的外引物與內(nèi)引物分別連接成一對(duì)引物作為等溫?cái)U(kuò)增用引物，借助外引物與核酸靶

序列上對(duì)應(yīng)片段的熔解溫度差異提供單鏈模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通過合成反應(yīng)與鏈替

代反應(yīng)對(duì)梯型Tm值曲線的靶標(biāo)核酸片段進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，進(jìn)行不同淀粉成分的定性分析。

2

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6試劑或材料

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。所有

試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。

6.1植物基因組DNA提取試劑盒。

6.2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)LMTIA試劑盒。Proofman探針法

6.3梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)LMTIA的引物和探針。玉米、木薯引物和探針詳見表1。玉米和木薯引

物擴(kuò)增的靶標(biāo)序列參見附錄A。

6.4梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)混合液（5μL（2X）通用型LMTIA預(yù)混液，0.4μL(100U/μL)(U，

Unit，酶學(xué)單位)Bst酶）。

表1玉米、木薯成分鑒定用引物和探針序列

名稱序列(5’→3’)靶基因

正向引物F:ACCTGGGGTCGCGGTTTTTATTCGGCCCTAAGGACCCAT

玉米反向引物B:CCCCAGGTCAGTCGGGTTTTATATGCTTAAACTCAGCGGGITS

環(huán)引物L(fēng)F:GGCAAGCTCGGTCGCT

探針:BHQ1-GGCAAGCTCGGTCGCC-FAM

正向引物F:GCCCACGGCCGTTTTCACGGCTATCGGTGGTTG

木薯反向引物B:CGGCCGTGGGCTTTTCCCGTTCGGCAGACGTTCITS

環(huán)引物L(fēng)F:TGTCCGAGGGTCTTC

探針:BHQ1-TGTCCGAGGGTCTTT-ROX

7儀器設(shè)備

7.1等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。

7.2恒溫水浴鍋。

7.3離心機(jī)：離心力≥12000g。

7.4微量移液器：0.5μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。

7.5恒溫混勻儀。

7.6渦旋震蕩器。

7.7pH計(jì)，精度為0.01。

7.8天平：感量0.01g。

7.9微量紫外-可見分光光度計(jì)。

3

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8檢測(cè)步驟

8.1DNA提取

采用市售的植物基因組DNA提取試劑盒提取。

將樣品研磨至粉末（淀粉樣品直接稱?。?，取100mg~200mg于2mL離心管中，詳見試劑盒說明

書進(jìn)行后續(xù)DNA的提取。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很

大影響。若用雙蒸水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)

物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

8.2DNA濃度與純度的檢測(cè)

使用核酸蛋白儀或微量紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度與純度。分別檢測(cè)260nm和280

nm處的吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次，取平均值。當(dāng)A260/A280比值在1.6～2.0時(shí)，可用于LMTIA擴(kuò)增。

8.3梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增

8.3.1梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系見表2。PCR八聯(lián)管中按表1依次加入反應(yīng)試劑，混勻。放入等溫?zé)?/p>

光擴(kuò)增儀。

表2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系（10μL）

試劑體積（μL）

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)混合液5.4

正向引物F（100μmol/L）0.16

反向引物B（100μmol/L）0.16

環(huán)引物L(fēng)F（100μmol/L）0.04

探針（10μmol/L）0.1

滅菌雙蒸水2.14

DNA模板2.0

8.3.2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序

按照表2配制玉米、木薯基因的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋旱葴責(zé)晒鈹U(kuò)增儀，玉米和木薯的檢測(cè)溫度

分別設(shè)置為61℃和62℃，設(shè)置40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)30s。在樣品等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)，檢測(cè)過程中應(yīng)分別

設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對(duì)照，用已知不含玉米、木薯成分的樣品DNA作陰性

對(duì)照，和空白對(duì)照（滅菌雙蒸水），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

4

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9結(jié)果判定

若有FAM熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢(shì)的曲線，則判定樣品含有玉米源性成

分，表述為“檢出玉米成分”;S曲線參考附錄B；

若有ROX熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢(shì)的曲線，則判定樣品含有木薯源性成

分，表述為“檢出木薯成分”;S曲線參考附錄B；

如無FAM熒光檢出，無S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含玉米源性成分，表述為“未檢出玉米成分”;

如無ROX熒光檢出，無S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含木薯源性成分，表述為“未檢出木薯成分”;

在樣品梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增陰性對(duì)照、梯型熔解溫度等溫

擴(kuò)增陽性對(duì)照和梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

10檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施

檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403-2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。

附錄A

（規(guī)范性）/（材料性）

玉米成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列

ATTCGGCCCTAAGGACCCATCGAGCGACCGAGCTTGCCCTCGGACCGCGACCCCAGGTCAGTCGG

GACTACCCGCTGAGTTTAAGCATAT

注:下劃線標(biāo)記處為引物位置。

木薯成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列

CACGGCTATCGGTGGTTGGAAGACCCTCGGACACGGCCGTGGGCGAACGTCTGCCGAACGGG

注:下劃線標(biāo)記處為引物位置。

5

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附錄B

玉米成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)的S型曲線

木薯成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)的S型曲線

6

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

《淀粉及其制品中玉米、木薯源性成

分梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法》

標(biāo)準(zhǔn)編制說明

標(biāo)準(zhǔn)起草工作組

2024年09月

一、制定標(biāo)準(zhǔn)的目的和意義

民以食為天，食以安為先，隨著人們生活水平的日漸提高，消費(fèi)者對(duì)食品的

質(zhì)量安全問題越來越關(guān)注。淀粉是現(xiàn)代食品工業(yè)中一種重要的生產(chǎn)原料，也可作

為一種重要的工業(yè)原料用于膠黏、填充等途徑中。目前常見的淀粉種類有馬鈴薯

淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、麥類淀粉等。其超微形態(tài)、糊化溫度等

理化性質(zhì)存在一定的差異，原材料成本及加工工藝的不同也造成了價(jià)格大有差別。

隨著淀粉加工、深加工產(chǎn)品的豐富，淀粉偽造或摻假問題日益突出。目前市

場(chǎng)上發(fā)現(xiàn)的摻假淀粉總體分為兩類，第一類是在淀粉及淀粉制品中摻入滑石粉、

白陶土、非食用色素等雜質(zhì)以次充好；第二類是摻入價(jià)格較低廉的植物淀粉投機(jī)

銷售，如在馬鈴薯淀粉中摻入玉米、苜蓿、蕎麥等；標(biāo)簽顯示為紅薯粉絲和山藥

粉絲的制品存在著玉米、木薯摻假現(xiàn)象。雖然第二類的摻假現(xiàn)象等不會(huì)對(duì)人體健

康造成嚴(yán)重影響，但理化性質(zhì)的差異會(huì)影響食品的成色、品質(zhì)，并且冒充高價(jià)格

的淀粉銷往市場(chǎng)謀取非法利潤(rùn)，嚴(yán)重?cái)_亂市場(chǎng)秩序，對(duì)合法生產(chǎn)者和消費(fèi)者來說

都是一種損害。

因此，加強(qiáng)對(duì)淀粉及其制品的鑒別檢驗(yàn)極為重要，準(zhǔn)確判定淀粉摻假，確保

食品標(biāo)簽制度的有效實(shí)施，需要靈敏、可靠的檢測(cè)方法鑒定植物源食品的物種來

源。淀粉的檢測(cè)主要由感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)3項(xiàng)綜合指標(biāo)組成。感官

檢測(cè)方法簡(jiǎn)單但檢測(cè)結(jié)果僅能作為輔助參考。理化檢測(cè)耗時(shí)費(fèi)力，并且對(duì)于第2

類摻假問題難以準(zhǔn)確鑒別。

針對(duì)玉米、木薯摻假現(xiàn)象，目前還尚未建立國家標(biāo)準(zhǔn)，缺少該方面的監(jiān)管。

我國現(xiàn)有的玉米、木薯淀粉國家標(biāo)準(zhǔn)與食品安全的要求存在較大的差距，目前玉

米淀粉的GB1353-2018《玉米》、GB/T10463-2008《玉米粉》、GB/T8885-2017

《食用玉米淀粉》和GB/T25219-2010《糧油檢驗(yàn)玉米淀粉含量測(cè)定近紅外

法》；木薯淀粉的GB2713-2015《淀粉制品》和國家標(biāo)準(zhǔn)GBT29343-2012bz《木

薯淀粉》中無食用淀粉及其制品中摻雜玉米、木薯淀粉質(zhì)量監(jiān)控的規(guī)定，對(duì)玉米、

木薯淀粉摻雜要求模糊，無法檢測(cè)。企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也參差不齊，沒有統(tǒng)一的規(guī)范性文

件，這都制約了淀粉產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定、快速發(fā)展，上述問題的存在已不能滿足

河南省內(nèi)紅薯粉條、山藥片、藕粉等的生產(chǎn)、流通和市場(chǎng)管理的要求，阻礙食用

淀粉產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

標(biāo)準(zhǔn)化是為了建立最佳秩序、促進(jìn)共同效益而開展的制定并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的活動(dòng)。

為了保證標(biāo)準(zhǔn)化活動(dòng)有序開展，促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)和效益的實(shí)現(xiàn)，就需要建立完善

的技術(shù)規(guī)則，起草高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化文件。通過確定文件的規(guī)范性要素，編制標(biāo)準(zhǔn)

化文件，從而對(duì)各類標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)象進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。一個(gè)完善的標(biāo)準(zhǔn)能夠起到規(guī)范整個(gè)

行業(yè)生產(chǎn)行為，提升行業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量，發(fā)揮促進(jìn)技術(shù)提升的重要作用。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)作

為國標(biāo)、行標(biāo)、地標(biāo)的有效補(bǔ)充，以堅(jiān)持市場(chǎng)主導(dǎo)和服務(wù)行業(yè)為原則，為促進(jìn)行

業(yè)的持續(xù)高效發(fā)展發(fā)揮著積極和引導(dǎo)作用。

因此，建立完善的淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)進(jìn)一步

規(guī)范生產(chǎn)企業(yè)工藝、提升產(chǎn)品質(zhì)量、維護(hù)人民群眾的食品安全，完善標(biāo)準(zhǔn)體系，

推動(dòng)河南特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)品發(fā)展具有重要的意義。

二、任務(wù)來源及編制原則和依據(jù)

（一）任務(wù)來源

隨著淀粉加工、深加工產(chǎn)品的豐富，淀粉偽造或摻假問題日益突出。目前市

場(chǎng)上發(fā)現(xiàn)的摻假淀粉總體分為兩類，第一類是在淀粉及淀粉制品中摻入滑石粉、

白陶土、非食用色素等雜質(zhì)以次充好；第二類是摻入價(jià)格較低廉的植物淀粉投機(jī)

銷售，如在馬鈴薯淀粉中摻入玉米、苜蓿、蕎麥等；標(biāo)簽顯示為紅薯粉絲和山藥

粉絲的制品存在著玉米、木薯摻假現(xiàn)象。雖然第二類的摻假現(xiàn)象等不會(huì)對(duì)人體健

康造成嚴(yán)重影響，但理化性質(zhì)的差異會(huì)影響食品的成色、品質(zhì)，并且冒充高價(jià)格

的淀粉銷往市場(chǎng)謀取非法利潤(rùn)，嚴(yán)重?cái)_亂市場(chǎng)秩序，對(duì)合法生產(chǎn)者和消費(fèi)者來說

都是一種損害。因此，加強(qiáng)對(duì)淀粉及其制品的鑒別檢驗(yàn)極為重要，準(zhǔn)確判定淀粉

摻假，確保食品標(biāo)簽制度的有效實(shí)施，需要靈敏、可靠的檢測(cè)方法鑒定植物源食

品的物種來源。

根據(jù)食用淀粉及其制品市場(chǎng)的需求，有必要制定食用淀粉及其制品有關(guān)玉米、

木薯成分鑒定的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，為食用淀粉及其制品提供標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)和標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。為此，

許昌市胖東來超市有限公司及相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)、高校和政府機(jī)構(gòu)于2024年9月3

日向河南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)提出立項(xiàng)《淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目建議書，根據(jù)《河南省食品科學(xué)

技術(shù)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》《河南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定程序》的

規(guī)定，同意許昌市胖東來超市有限公司就淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的

檢測(cè)向河南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)提出申請(qǐng)，由河南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)負(fù)責(zé)《淀

粉及其制品中玉米、木薯源性成分梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的

審定工作。

（二）編制原則和依據(jù)

1.編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)的制定主要遵循以下原則：一是科學(xué)實(shí)用原則。在尊重科學(xué)、緊密結(jié)

合實(shí)踐、廣泛征求意見及調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，緊貼食用淀粉及其制品中玉米、木

薯成分的鑒定的快速檢測(cè)方法，具有可操作性和實(shí)用性。二是協(xié)調(diào)性原則。以質(zhì)

量和安全為核心，符合我國現(xiàn)行有關(guān)法律、法規(guī)和相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)要求。三是因地制

宜原則。標(biāo)準(zhǔn)的制定堅(jiān)持從我省食品行業(yè)的實(shí)際出發(fā)，充分考慮相關(guān)食品企業(yè)的

現(xiàn)狀和技術(shù)條件，確保食用淀粉及其制品中的真實(shí)性和技術(shù)條件的可行性。

2.編制依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)的制定參考了GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化

文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》及其他國家相關(guān)法律、法規(guī)，嚴(yán)格按照GB-T1.1-2020

《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求組織實(shí)施

編寫，規(guī)定了范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、方法提要、原理、試劑或材

料、儀器設(shè)備、檢測(cè)步驟、結(jié)果判定、檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施等。本標(biāo)

準(zhǔn)依據(jù)相關(guān)最新的標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)進(jìn)行編寫，以適應(yīng)食品企業(yè)健康發(fā)展的需要。

三、編制過程

（一）編制大綱和標(biāo)準(zhǔn)文本初稿

時(shí)間：2024年07月8日-2024年9月2日

根據(jù)河南省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)提出的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求，報(bào)請(qǐng)河南省食品科

學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)同意立項(xiàng)，確定了總體工作方案，成立了項(xiàng)目起草小組。期間以許昌

市胖東來超市有限公司，許昌學(xué)院、、、、、等十余家企業(yè)、高校和政府機(jī)構(gòu)共

同收集和查閱相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料，采集樣品進(jìn)行檢測(cè)，并經(jīng)多次討論，試

驗(yàn)驗(yàn)證，形成了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)及編制說明初稿。

四、主要技術(shù)內(nèi)容的說明

1范圍

本文件規(guī)定了淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。

本文件適用于淀粉及其制品中玉米、木薯源性成分的定性檢測(cè)。

本文件所規(guī)定方法的檢出限（LOD）為1%（質(zhì)量比）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T12104淀粉術(shù)語

GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

3術(shù)語和定義

GB/T12104界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

4方法提要

提取樣品DNA，用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對(duì)照，用已知不含玉米、

木薯成分的樣品DNA作陰性對(duì)照，滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照，使用特異性引物和探針，采

用梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，根據(jù)熒光信號(hào)和擴(kuò)增現(xiàn)象，判定是否存在玉米、木薯源性成

分。

5原理

選擇Tm值曲線為梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特異性核酸片段為靶

序列設(shè)計(jì)巢式引物，將巢式引物的外引物與內(nèi)引物分別連接成一對(duì)引物作為等溫?cái)U(kuò)增用引物，

借助外引物與核酸靶序列上對(duì)應(yīng)片段的熔解溫度差異提供單鏈模板，在DNA聚合酶（大片

段）催化下通過合成反應(yīng)與鏈替代反應(yīng)對(duì)梯型Tm值曲線的靶標(biāo)核酸片段進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，進(jìn)

行不同淀粉成分的定性分析。

6試劑或材料

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的

規(guī)格。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。

6.1植物基因組DNA提取試劑盒。

6.2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)LMTIA試劑盒。Proofman探針法

6.3梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)LMTIA的引物和探針。玉米、木薯引物和探針詳見表1。玉

米和木薯引物擴(kuò)增的靶標(biāo)序列參見附錄A。

6.4梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)混合液（5μL（2X）通用型LMTIA預(yù)混液，0.4μL(100

U/μL)(U，Unit，酶學(xué)單位)Bst酶）。

表1玉米、木薯成分鑒定用引物和探針序列

名稱序列(5’→3’)靶基因

正向引物F:

玉米ACCTGGGGTCGCGGTTTTTATTCGGCCCTAAGGACCCATITS

反向引物B:

CCCCAGGTCAGTCGGGTTTTATATGCTTAAACTCAGCGGG

環(huán)引物L(fēng)F:GGCAAGCTCGGTCGCT

探針:BHQ1-GGCAAGCTCGGTCGCC-FAM

正向引物F:GCCCACGGCCGTTTTCACGGCTATCGGTGGTTG

木薯反向引物B:CGGCCGTGGGCTTTTCCCGTTCGGCAGACGTTCITS

環(huán)引物L(fēng)F:TGTCCGAGGGTCTTC

探針:BHQ1-TGTCCGAGGGTCTTT-ROX

7儀器設(shè)備

7.1等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。

7.2恒溫水浴鍋。

7.3離心機(jī)：離心力≥12000g。

7.4微量移液器：0.5μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。

7.5恒溫混勻儀。

7.6渦旋震蕩器。

7.7pH計(jì)，精度為0.01。

7.8天平：感量0.01g。

7.9微量紫外-可見分光光度計(jì)。

8檢測(cè)步驟

8.1DNA提取

采用市售的植物基因組DNA提取試劑盒提取。

將樣品研磨至粉末（淀粉樣品直接稱?。?00mg~200mg于2mL離心管中，詳見

試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)DNA的提取。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗

脫效率有很大影響。若用雙蒸水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降

低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

8.2DNA濃度與純度的檢測(cè)

使用核酸蛋白儀或微量紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度與純度。分別檢測(cè)260

nm和280nm處的吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次，取平均值。當(dāng)A260/A280比值在1.6～2.0時(shí)，

可用于LMTIA擴(kuò)增。

8.3梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增

8.3.1梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系見表2。PCR八聯(lián)管中按表1依次加入反應(yīng)試劑，混勻。

放入等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。

表2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系（10μL）

試劑體積（μL）

梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)混合液5.4

正向引物F（100μmol/L）0.16

反向引物B（100μmol/L）0.16

環(huán)引物L(fēng)F（100μmol/L）0.04

探針（10μmol/L）0.1

滅菌雙蒸水2.14

DNA模板2.0

8.3.2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序

按照表2配制玉米、木薯基因的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋旱葴責(zé)晒鈹U(kuò)增儀，玉米和木薯

的檢測(cè)溫度分別設(shè)置為61℃和62℃，設(shè)置40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)30s。在樣品等溫?cái)U(kuò)增的同

時(shí)，檢測(cè)過程中應(yīng)分別設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

用已知含玉米、木薯成分的樣品DNA作陽性對(duì)照，用已知不含玉米、木薯成分的樣品

DNA作陰性對(duì)照，和空白對(duì)照（滅菌雙蒸水），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

9結(jié)果判定

若有FAM熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢(shì)的曲線，則判定樣品含有

玉米源性成分，表述為“檢出玉米成分”;S曲線參考附錄B；

若有ROX熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢(shì)的曲線，則判定樣品含有

木薯源性成分，表述為“檢出木薯成分”;S曲線參考附錄B；

如無FAM熒光檢出，無S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含玉米源性成分，表述為“未檢

出玉米成分”;

如無ROX熒光檢出，無S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含木薯源性成分，表述為“未檢

出木薯成分”;

在樣品梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增陰性對(duì)照、梯型熔

解溫度等溫?cái)U(kuò)增陽性對(duì)照和梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

10檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施

檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403-2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。

五、標(biāo)準(zhǔn)與其他標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)比分析及采用情況

目前國內(nèi)還沒有食用淀粉以及制品中植物源成分鑒別方法的國家標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)

標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)玉米淀粉和木薯淀粉的包括由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化

管理委員會(huì)頒發(fā)的玉米淀粉的GB1353-2018《玉米》、GB/T10463-2008《玉

米粉》、GB/T8885-2017《食用玉米淀粉》和GB/T25219-2010《糧油檢驗(yàn)玉

米淀粉含量測(cè)定近紅外法》，以及木薯淀粉GB2713-2015《淀粉制品》和國家

標(biāo)準(zhǔn)GB/T2