益母草美白凝膠面膜制備工藝的研究【摘要】目的：通過優(yōu)化益母草總黃酮提取工藝，進(jìn)而探究益母草總黃酮的美白功效，制備一款益母草美白凝膠面膜。方法：由單因素實(shí)驗(yàn)確定相關(guān)水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以優(yōu)化超聲提取益母草總黃酮成分的工藝條件，經(jīng)水沉純化，通過抑制酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證益母草具有美白功效，制成一款益母草美白凝膠面膜。結(jié)果：益母草總黃酮提取最佳工藝為，用70%乙醇濃度以1：30的料液比超聲30min，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得RSD為1.65%，平均含量為8.7mg/g。水沉純化得率為5.41%，益母草提取物酪氨酸酶抑制率最高可達(dá)80.4%，IC50為0.031mg/mL，證明具有一定的美白功效，所得益母草美白凝膠面膜符合感官指標(biāo)等。結(jié)論：益母草總黃酮具有一定的美白功效，所制得的益母草美白凝膠面膜可為相關(guān)藥妝的研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支撐?！娟P(guān)鍵詞】益母草；總黃酮；正交試驗(yàn)；凝膠面膜Researchontheformulationofawhiteninggelmaskcontainingmotherwortextract【Abstract】Objective:Theextractionprocessofmotherwort(Leonurusjaponicus)totalflavonoidswasoptimized,followedbyaninvestigationintothewhiteningeffectoftheseflavonoids,resultinginthepreparationofamotherwort(Leonurusjaponicus)whiteninggelmask.Methods:Basedonthesinglefactortestofethanolconcentration,solid-liquidratioandultrasonictime,theprocessconditionsofultrasonicextractionoftotalflavonoidsofmotherwort(Leonurusjaponicus)wereoptimizedbyorthogonaltest.Afterpurificationbywaterprecipitation,thewhiteningeffectofmotherwort(Leonurusjaponicus)wasverifiedbyinhibitionoftyrosinaseactivitytest.Results:Theoptimalextractionprocessoftotalflavonoidsfrommotherwort(Leonurusjaponicus)wasasfollows:ethanolconcentration70%,solid-liquidratio1:30,ultrasonictime30min.TheRSDwas1.65%,andtheaveragecontentwas8.7mg/g.Thehighesttyrosinaseinhibitionrateofmotherwort(Leonurusjaponicus)extractwas80.4%,andtheIC50was0.031mg/mL,whichprovedthatithadcertainwhiteningeffect,andthemotherwort(Leonurusjaponicus)whiteninggelmaskmetthesensoryindexes.Conclusion:Thetotalflavonoidsofmotherwort(Leonurusjaponicus)haveacertainwhiteningeffect,andthemotherwort(Leonurusjaponicus)whiteninggelmaskcanprovidecertaindatasupportfortheresearchanddevelopmentofrelatedcosmeceutical.【Keywords】motherwortTotalflavonoidsOrthogonaltestGelmask目錄TOC\o"1-3"\h\u256171前言 前言1.1研究背景及意義在古方醫(yī)藥著作中《圣濟(jì)總錄》、《外臺(tái)秘要》、《御藥院方》、《醫(yī)方類聚》、《事林廣記》、《本草拾遺》等均有記載益母草相關(guān)美容外用單方，《圣濟(jì)總錄》收錄“益母草涂方”有“令面光白潤(rùn)澤，即祛斑美白之效；益母草單方于《外臺(tái)秘要》中有所記載，傳說武則天常駐容顏秘訣為天后煉益母草澤面方，認(rèn)為其具“洽黯黑，退皺，令人皮膚光澤”（《御藥院方》），即可達(dá)去黑美白、除皺抗衰作用REF_Ref5266\r\h[1]；《醫(yī)方類聚》收錄有“玉女粉”，有活血化瘀、祛斑去粉刺等功效；《事林廣記》有“玉女桃花粉”等；《本草拾遺》有“入面藥，令人光澤，治粉刺”；明代《香奩潤(rùn)色》也記載了去粉痣等[2]。目前，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者針對(duì)益母草的研究，主要是在益母草具體藥理機(jī)制、益母草生物堿提取分離、生物堿抗氧化應(yīng)用等方面，尤其是針對(duì)益母草生物堿類藥理作用的研究已經(jīng)非常豐富，在益母草總黃酮提取工藝上也有一定的文獻(xiàn)支持，但存在工藝提取條件數(shù)據(jù)差異較大而參考數(shù)量少的問題，目前對(duì)于益母草總黃酮提取工藝優(yōu)化、其美白功效驗(yàn)證及應(yīng)用的領(lǐng)域的研究還有補(bǔ)充的空間。本課題將通過對(duì)該領(lǐng)域的深入研究，通過綜合分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探索益母草總黃酮超聲提取條件及其在美白凝膠面膜中的應(yīng)用潛力，為開發(fā)具有美白效果的化妝品提供參考，進(jìn)一步豐富有關(guān)益母草的研究?jī)?nèi)容。同時(shí)本課題利用超聲醇提法進(jìn)行研究，與水提法、回流法等傳統(tǒng)方法相比，超聲醇提法具有耗時(shí)短、提取率低、節(jié)約資源等優(yōu)點(diǎn)，可為實(shí)驗(yàn)相關(guān)研究、工業(yè)化生產(chǎn)提供高效的提取方法。1.2益母草的藥理性質(zhì)本品為唇形科植物益母草（LeonurusjaponicusHoutt.）的新鮮或干燥地上部分?？唷⑿?，微寒。歸肝、心包、膀胱經(jīng)[3]。《本草求真》中記載道：“消水行血，去瘀生新。”現(xiàn)代藥理研究表明，益母草共有44種成分，包括4種生物堿、20種黃酮類、2種苯丙素、17種有機(jī)酸和1種氨基酸[4]。益母草可活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，清熱解毒，在月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，惡露不盡等方面均有療效。其中益母草堿具有顯著的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用，通過調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1/ARE信號(hào)通路來減輕骨骼肌的氧化損傷REF_Ref16970\r\h[5]；總黃酮類成分具有抗心肌缺血、促進(jìn)心肌收縮力、興奮子宮、抗氧化等作用[6、7]。在美白相關(guān)文獻(xiàn)中，雷鐵池等人研究發(fā)現(xiàn)益母草乙醇提取物可以起到抑制酪氨酸酶活性的作用[8]。王理鳴證實(shí)了益母草鮮汁可抑制B-16黑素瘤細(xì)胞的增殖以及酪氨酸酶活性，因此能夠有效地去除黑色素、斑點(diǎn)以及美化肌膚[9]；程靜等人通過分光光度法證實(shí)益母草鮮汁可促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂及其合成和分泌膠原蛋白和彈性蛋白的能力，從而加快新陳代謝，促進(jìn)了皮膚彈性活力的恢復(fù)使皮膚潤(rùn)澤光白[10]，由文獻(xiàn)[8-11]可知，益母草提取物確有一定的抗黑素生成活性。由歷代古方記載初步確定益母草一藥，文獻(xiàn)相關(guān)查詢表明現(xiàn)代研究多基于益母草生物堿，目前關(guān)于益母草的總黃酮成分研究還相對(duì)較少，經(jīng)文獻(xiàn)資料了解，黃酮類成分具有一定的抑制酪氨酸酶活性的作用，具體成分包含蘆丁、槲皮素等，與益母草總黃酮成分存在一定的重疊，且較多文獻(xiàn)表明益母草提取液具有一定的抗黑素生成活性，但并未進(jìn)一步探究美白的具體成分，因此有必要進(jìn)一步深入探究益母草的美白機(jī)理，并基于此開發(fā)出更多的益母草美白產(chǎn)品，以滿足消費(fèi)者的需求。本課題的主要目的是以益母草總黃酮成分為主要研究對(duì)象，優(yōu)化益母草總黃酮成分的提取工藝，補(bǔ)足藥妝領(lǐng)域益母草總黃酮美白功效驗(yàn)證及其在中藥面膜中的應(yīng)用的空缺，為益母草在美容領(lǐng)域的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。1.3主要研究?jī)?nèi)容傳統(tǒng)益母草總黃酮類化合物的提取方法，包括水提法、回流提取法等，但這些傳統(tǒng)方法存在如耗時(shí)長(zhǎng)、提取雜質(zhì)多、提取率低等的缺點(diǎn)。而利用超聲醇提法進(jìn)行研究，有助于簡(jiǎn)化傳統(tǒng)水提法、回流法等的研究流程，與傳統(tǒng)方法相比，超聲醇提法具有耗時(shí)短、提取率低、節(jié)約資源等優(yōu)點(diǎn)[12]，故本實(shí)驗(yàn)采用超聲乙醇提取對(duì)益母草總黃酮類化合物的提取進(jìn)行了進(jìn)一步的工藝優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用蘆丁作為對(duì)照品繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其作為益母草總黃酮提取過程中含量測(cè)定的依據(jù)，并將考察指標(biāo)定為總黃酮提取量，通過文獻(xiàn)查詢，對(duì)益母草總黃酮類提取的主要影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，進(jìn)而通過正交試驗(yàn)方法以確定最佳超聲提取工藝條件。在此基礎(chǔ)上采用水沉法進(jìn)行純化。酪氨酸酶能夠利用羥基的催化，將L-酪氨酸變換為L(zhǎng)-多巴，再氧化L-多巴形成多巴醌，最終借助非酶促反應(yīng)來合成黑色素[7]。多數(shù)黃酮類具有酚羥基，與酪氨酸酶的底物L(fēng)-酪氨酸及L-多巴相似，易于底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酪氨酸酶[13]，本實(shí)驗(yàn)通過酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證益母草總黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，進(jìn)而驗(yàn)證益母草的美白作用?；谑袌?chǎng)需求及開發(fā)益母草相關(guān)藥妝的考慮，本實(shí)驗(yàn)通過酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)選取較佳提取液濃度，在已有文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上確定最終面膜配方，由配方制備出益母草美白凝膠面膜。2實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器表2-1藥品與試劑試劑級(jí)別生產(chǎn)廠家益母草飲片中山市仙逸堂中藥飲片有限公司無水乙醇分析純廣東廣試試劑科技有限公司亞硝酸鈉化妝品級(jí)天津市福晨化學(xué)試劑廠氫氧化鈉化妝品級(jí)廣東廣試試劑科技有限公司硝酸鋁化妝品級(jí)廣東廣試試劑科技有限公司酪氨酸酶化妝品級(jí)合肥巴斯夫生物科技有限公司十二水合磷酸氫二鈉分析純廣東廣試試劑科技有限公司磷酸二氫鈉分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所L-酪氨酸化妝品級(jí)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司曲酸化妝品級(jí)上海阿拉丁生化科技股份有限公司玫瑰花香香精日化級(jí)山東優(yōu)索化工科技有限公司透明質(zhì)酸鈉化妝品級(jí)山東銀河生物科技有限公司丙三醇日化級(jí)山東優(yōu)索化工科技有限公司1，2-丙二醇化學(xué)純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司尼泊金乙酯分析純天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司薄荷腦分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所表2-2儀器名稱廠家KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司紫外分光光度計(jì)上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司電子天平上海越平科學(xué)儀器有限公司循環(huán)水真空泵子華儀器有限責(zé)任公司PH計(jì)上海佑科儀器儀表有限公司攪拌機(jī)上海昂尼儀器儀表有限公司液晶智能全自動(dòng)孵化機(jī)山東省德州市天衢工業(yè)園水浴鍋江蘇科析儀器有限公司數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠高速離心機(jī)安徽嘉文儀器裝備有限公司表2-3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠家SPF級(jí)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心白萊杭雞受精蛋蛋掌門2.2益母草總黃酮提取2.2.1益母草總黃酮定量分析方法參考《中華人民共和國(guó)藥典》槐花項(xiàng)下總黃酮的含量測(cè)定方法[3]及相關(guān)文獻(xiàn)資料[14]進(jìn)行測(cè)定。2.2.1.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制對(duì)照品溶液：精密稱取蘆丁對(duì)照品8mg，往具塞錐形瓶中加入適量的70%乙醇，于水浴鍋上水浴溶解，放至室溫后，用25mL的容量瓶定容并搖勻。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL對(duì)照品溶液于25mL容量瓶，用70%乙醇補(bǔ)至4.0mL，加入NaNO2溶液1mL，搖勻后靜置6min，加入10%AL(NO3)3試液1mL，搖勻，靜置6min，加入NaOH試液10mL，70%乙醇定容，靜置15min，相應(yīng)試劑作為空白對(duì)照，于500nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中蘆丁對(duì)照品溶液濃度c（mg/mL）設(shè)為x軸，吸光度A為y軸。2.2.1.2總黃酮測(cè)定方法稱取1g益母草粗粉，至具塞三角瓶中，根據(jù)各條件加入乙醇用量，超聲提取，冷卻至室溫，25mL容量瓶定容。精密吸取2mL，在500nm下采用2.2.1項(xiàng)下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中的方法測(cè)定相應(yīng)吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程可得供試品溶液中蘆丁濃度，由此算出益母草中總黃酮含量。2.2.2提取工藝的單因素考察由相關(guān)文獻(xiàn)可知，料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間是益母草總黃酮提取量的主要影響因素[15]，單因素考察將以此三個(gè)因素展開。2.2.2.1料液比的選取稱取益母草粉末1g，以1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的料液比分別加入70%乙醇，先進(jìn)行30min藥粉浸泡，調(diào)節(jié)超聲儀器為50℃、100W，超聲時(shí)間為30min，抽濾，待冷卻至室溫后，用25mL容量瓶定容。精密量取2mL提取液，在500nm下采用2.2.1項(xiàng)下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中的方法測(cè)定相應(yīng)吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程計(jì)算出益母草總黃酮濃度，由此計(jì)算出益母草總黃酮提取量。2.2.2.2乙醇濃度的選取稱取5份益母草粉末，每份各1g，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇30mL，先進(jìn)行30min藥粉浸泡，調(diào)節(jié)超聲儀器為50℃、100W，超聲時(shí)間為30min，抽濾，待冷卻至室溫后，用25mL容量瓶定容。精密量取2mL提取液，在500nm下采用2.2.1項(xiàng)下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中的方法測(cè)定相應(yīng)吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程可得益母草總黃酮濃度，進(jìn)而計(jì)算出益母草總黃酮提取量。2.2.2.3超聲時(shí)間的選取稱取益母草粉末1g，分別加入70%乙醇溶液30mL，先進(jìn)行30min藥粉浸泡，調(diào)節(jié)超聲儀器為50℃、100W，超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60min，抽濾，待冷卻至室溫后，用25mL容量瓶定容。精密量取2mL提取液，在500nm下采用2.2.1項(xiàng)下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中的方法測(cè)定相應(yīng)吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程可得益母草總黃酮濃度，進(jìn)而計(jì)算出益母草總黃酮提取量。2.2.4正交優(yōu)化提取條件2.2.4.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)參考單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，分別于每個(gè)影響因素各選取三個(gè)水平，將益母草總黃酮提取量作為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)分析所選取的單因素對(duì)總黃酮提取量的影響，由結(jié)果確定最佳提取條件。2.2.4.2驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取益母草粉末1g，稱3份，按正交優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行提取，每份樣品平行測(cè)定3次，由所得吸光度確定益母草總黃酮的提取率，取均值。2.3總黃酮水沉提取取30g益母草粉末，按正交結(jié)果最終的最佳提取條件提取，獲得相應(yīng)提取液，按提取液20倍水進(jìn)行水沉，過夜后抽濾，晾干，干膏稱重，得得率。2.4抑制酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)2.4.1實(shí)驗(yàn)試劑50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8）：稱8.77gNa2HPO4·12H2O和3.98gNaH2PO4·2H2O溶于1000mL純化水中，配制1L。5mmol/L酪氨酸溶液：取185mg酪氨酸溶于200mL上述50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中。166ug/mL酪氨酸酶溶液：稱取33.2mg的酪氨酸酶粉末，溶于200mL50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液。0.1mmol/L曲酸溶液：取28.2mg溶100mL50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液。2mmol/L多巴溶液：稱取79mg多巴溶于200mL上述50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中。2.4.2實(shí)驗(yàn)方法表2-4樣品反應(yīng)液組成（mL）組別酪氨酸溶液樣品溶液酪氨酸酶溶液磷酸鹽緩沖溶液合計(jì)空白對(duì)照組(A0)00055對(duì)照組（Am）101補(bǔ)充至55樣品組（An）1各組適量1補(bǔ)充至55各實(shí)驗(yàn)組中分別加入5mmol/L酪氨酸溶液，166ug/mL酪氨酸酶溶液各1mL，各樣品組分別加1mL不同濃度樣品溶液于刻度試管中，用磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8）補(bǔ)充反應(yīng)體系至5mL，混勻。陽性對(duì)照中樣品用曲酸溶液代替樣品，其余步驟不變。室溫反應(yīng)30min，測(cè)定475nm處的吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算抑制率。A0空白對(duì)照An樣品Am無樣品對(duì)照2.5益母草美白凝膠面膜的制備及評(píng)價(jià)2.5.1配方設(shè)計(jì)2.5.1.1配方組成由文獻(xiàn)資料[16]可得美白凝膠面膜的配方，見表2-5。表2-5益母草美白凝膠面膜的配方組成添加量（g）卡波9402.25甘油12薄荷腦0.2丙二醇10透明質(zhì)酸鈉0.5對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.1玫瑰香精0.2去離子水添加至1002.5.1.1制備方法：（1）燒杯加入適量去離子水，稱取2.25g卡波940，卡波940均勻撒于液面上，充分溶脹過液，得到基質(zhì)1；（2）按配方依次稱取剩余各組分，充分?jǐn)噭虻没|(zhì)2;（3）基質(zhì)1加入基質(zhì)2，攪均后得混合基質(zhì)3;（4）取益母草提取物1g加入混合基質(zhì)3中，攪均，得益母草美白凝膠面膜，保鮮膜密封后避光陰涼處保存。2.5.2性能評(píng)價(jià)根據(jù)中華人民共和國(guó)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中面膜系列QB/T2872-2017的要求，進(jìn)行下列性能評(píng)價(jià)：2.5.2.1感官指標(biāo)（1）外觀方法：在室溫和非陽光直射下目測(cè)觀察。要求：呈透明或半透明凝膠狀。（2）香氣方法：用嗅覺進(jìn)行鑒別。要求：呈淡淡的玫瑰香氣。2.5.2.2理化指標(biāo)（1）ｐＨ（稀釋法）測(cè)定方法：精密稱取一份5.0g的樣品，加入經(jīng)煮沸冷卻后的45mL實(shí)驗(yàn)室用水，加熱至40℃，攪勻，冷卻至25℃，放一旁待用。校準(zhǔn)pH計(jì)后，平行測(cè)定3次取均值。要求：pH為4.0-8.5（2）耐熱實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法:將試樣分別取7g于裝入2支離心管，將一支待檢試管置于室溫下放置24h，作為對(duì)照，將第二支離心管放入恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)箱的溫度預(yù)先設(shè)定為（40±1）℃。24h后，將兩支離心管進(jìn)行目測(cè)比較。要求：兩支離心管狀態(tài)無明顯差異。（3）耐寒實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法：將試樣分別取7g于裝入2支離心管，將其中一支待檢試管置于室溫下24h，作為對(duì)照組，將第二支離心管放入恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)箱的溫度預(yù)先設(shè)定為（-8±2）℃。24小時(shí)后，將兩支離心管進(jìn)行目測(cè)比較。要求：兩支離心管狀態(tài)無明顯差異。（4）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法：通過離心的方式考察凝膠面膜的穩(wěn)定性，將試樣分別取7g于裝入2支離心管，其中一只離心管在3200r/min的離心條件下離心30min，離心后與另一只進(jìn)行對(duì)比觀察。要求：未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，與離心前狀態(tài)無明顯差異。2.5.3安全性評(píng)價(jià)2.5.3.1眼刺激安全性實(shí)驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)方法①受試物制備：取1g于燒杯中加入10mL去離子水稀釋成10%的樣品②取0.3mL樣品作用于絨毛尿囊膜（CAM）。③實(shí)驗(yàn)分組：每組6只雞胚，陰性對(duì)照為0.9%的NaCl溶液，陽性對(duì)照為0.1mol/LNaOH溶液。④于第9日挑選出合適的雞蛋，照出氣室位置用筆畫好標(biāo)記，使用開蛋器去除氣室蛋殼部分，然后滴適量生理鹽水充分地濕潤(rùn)蛋殼膜，小心的傾倒出生理鹽水，再用鑷子撕開蛋殼膜，并確保暴露出來的尿囊膜完好無損。⑤取0.3mL樣品作用于CAM。3min后，在30s內(nèi)用雙蒸水輕輕沖洗好CAM表面，傾出，觀察并給予評(píng)分(ES)。結(jié)果觀察表2-6現(xiàn)象嚴(yán)重程度對(duì)應(yīng)評(píng)分表現(xiàn)象無輕度中度重度出血0123凝血0123血管融解0123（3）結(jié)果分析表2-7刺激性分類表終點(diǎn)評(píng)分刺激性分類ES≤12無/輕刺激性12<ES<16中度刺激性ES≥16嚴(yán)重刺激性2.5.3.2皮膚安全性實(shí)驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)方法①實(shí)驗(yàn)開始前，取6只成年（7周）小鼠（雌雄各半），編號(hào)，用去毛膏及剃毛器去除小鼠軀干背部擬染毒區(qū)域的毛發(fā)；②確保小鼠背部毛發(fā)去除干凈后，利用棉簽按2000mg/kg的比例取樣品，將樣品均勻涂敷于小鼠剃毛區(qū)，剪取薄膠片覆蓋剃毛區(qū)，用無刺激膠布固定；（2）結(jié)果觀察及分析①在24h內(nèi)，定時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，24h后，拆除膠片和膠布，并用水清除殘留的樣品。其后定期進(jìn)行檢查。包括剃毛區(qū)皮膚及毛發(fā)情況、小鼠眼睛、黏膜、肢體運(yùn)動(dòng)、行為運(yùn)動(dòng)等情況；②觀察期間應(yīng)對(duì)小鼠定期稱重，觀察期結(jié)束將小鼠處死。3結(jié)果與討論3.1益母草總黃酮提取3.1.1定量分析曲線以蘆丁濃度c為x軸，吸光度A為y軸，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=11.528x-0.0008,R2=0.9996。線性范圍0.0064~0.0512mg/mL，見圖3-1。圖3-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計(jì)算益母草粉末總黃酮類化合物得濃度及提取量。計(jì)算公式如下：公式各項(xiàng)：A-吸光度；V-提取液體積(mL)：D-稀釋倍數(shù)：M-生藥量（g)3.1.2各個(gè)因子對(duì)提取率的影響3.1.2.1料液比圖3-2料液比對(duì)益母草總黃酮含量的影響隨著料液比的增加，益母草總黃酮含量呈現(xiàn)出先先升后降的趨勢(shì)，其中1：30是拐點(diǎn)。故選取1：20、1：30、1：40的料液比作為三水平，見圖3-2。3.1.2.2乙醇濃度圖3-3乙醇濃度對(duì)益母草總黃酮含量的影響隨著乙醇濃度的提高，益母草總黃酮含量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，其中70%是拐點(diǎn)，故選取60%、70%、80%的乙醇濃度作為三水平，見圖3-3。3.1.2.3超聲時(shí)間圖3-4超聲時(shí)間對(duì)益母草黃酮含量的影響隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，益母草總黃酮含量呈現(xiàn)出先升后平緩下降的趨勢(shì)，其中30min是拐點(diǎn)，故選取20、30、40min的超聲時(shí)間作為三水平，見圖3-4。3.1.3正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果根據(jù)單因素考察結(jié)果，采用三因素三水平對(duì)益母草總黃酮超聲提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，形成以下因素水平表：表3-1L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表組別A料液比B乙醇濃度（%）C超聲時(shí)間（min)120602023070303408040以益母草總黃酮提取量為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果如下：表3-2正交試驗(yàn)結(jié)果表實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD總黃酮提取量（mg/g）111116.880212228.344313338.046421237.639522318.100623127.802731326.121832136.582933217.124K123.27020.64021.26422.104K223.54123.02623.10722.267K319.82722.97222.26722.267k17.7576.8807.0887.368K27.8477.6757.7027.422K36.6097.6577.4227.422R1.1480.7950.6140.054表3-3方差分析表變異來源偏差平方和自由度均方F值顯著性A0.00420.002486.0830.002B0.00220.001210.3330.005C0.00120.00096.5830.010（R2=0.999）以益母草總黃酮提取量為考察指標(biāo)，極差分析中R值越大說明影響程度越大，由表3-2中R值結(jié)果表明，各因素對(duì)益母草總黃酮提取量的影響程度為：A（料液比）>B（乙醇濃度）>C(超聲時(shí)間）；由表3-3中方差分析結(jié)果可知，A（料液比）、B（乙醇濃度）因素均呈現(xiàn)0.01的顯著性水平（P<0.01），C（超聲時(shí)間）因素則呈現(xiàn)出0.05的顯著性水平（P<0.05）。而K值越大說明該水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越大，其中A因素：K2>K1>K3,B因素：K2>K3>K1,C因素：K2>K3>K1，以上結(jié)果說明益母草總黃酮提取工藝的最優(yōu)組合為A2B2C2，即采用30mL的70%乙醇為提取液，超聲30min，此時(shí)益母草總黃酮的提取率達(dá)到最高。 3.1.4最終優(yōu)化提取工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分別稱取三份益母草粉末，每份1g，各加入30mL的70%乙醇，浸泡半小時(shí)，于50℃的條件下分別以100W的功率超聲提取30min，趁熱抽濾，冷卻至室溫后，再轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶，定容并搖勻，精密量取2mL于新的25mL容量瓶中，參考2.2.1項(xiàng)下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中具體實(shí)驗(yàn)步驟，測(cè)定500nm下的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程可得益母草總黃酮濃度，進(jìn)而計(jì)算出益母草總黃酮提取率。表3-4最佳工藝驗(yàn)證批次總黃酮提取率（%）平均值（%）RSD（%）10.87520.8530.8701.65%30.881由表3-4可知，經(jīng)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得，益母草總黃酮提取率為0.870%（見圖3-4），RSD為1.65%（見圖3-4），說明此最佳提取工藝穩(wěn)定且合理。3.2益母草總黃酮水沉純化通過最佳提取工藝進(jìn)行益母草提取液制備，將提取液進(jìn)行水沉過夜后抽濾，晾干，可算得得率為5.41%。3.3抑制酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法所得最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：圖3-5益母草抑制酪氨酸酶活性由酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，益母草總黃酮提取物對(duì)酪氨酸酶表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且先隨著濃度越大，抑制率先增強(qiáng)后平緩下降，酪氨酸酶抑制率最高可達(dá)80.4%，此時(shí)對(duì)應(yīng)的益母草總黃酮提取液的質(zhì)量濃度為0.052mg/mL。其中益母草總黃酮提取液濃度（IC50）為0.031mg/mL，同條件下曲酸濃度（IC50）為0.024mg/mL，表明益母草的總黃酮成分具有一定的美白作用。3.4益母草美白凝膠面膜的制備及評(píng)價(jià)3.4.1凝膠面膜的制備根據(jù)酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)，選取0.052mg/mL濃度的益母草提取液制備美白凝膠面膜，根據(jù)配方制備出益母草美白凝膠面膜，見圖3-6。圖3-6益母草美白凝膠面膜樣品圖3.4.2性能評(píng)價(jià)對(duì)益母草美白凝膠面膜的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，已達(dá)到QB/T2872-2017標(biāo)準(zhǔn)，如下：3.4.2.1感官評(píng)價(jià)表3-5益母草美白凝膠面膜感官評(píng)價(jià)結(jié)果項(xiàng)目指標(biāo)要求結(jié)果外觀透明或半透明凝膠狀呈半透明凝膠狀香氣符合規(guī)定氣味呈淡雅清新的玫瑰香氣3.4.2.2理化評(píng)價(jià)表3-6益母草美白凝膠面膜理化指標(biāo)結(jié)果項(xiàng)目指標(biāo)要求結(jié)果PH（稀釋法）4.0~8.56.89，符合要求耐熱實(shí)驗(yàn)（40±1）℃保持24h，恢復(fù)至室溫后與實(shí)驗(yàn)前無明顯差異恢復(fù)至室溫后與實(shí)驗(yàn)前無明顯差異耐寒實(shí)驗(yàn)（-8±2）℃保持24h，恢復(fù)至室溫后與實(shí)驗(yàn)前無明顯差異恢復(fù)至室溫后與實(shí)驗(yàn)前無明顯差異穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（離心）3200r/min，離心30min不分層離心前后無明顯差異3.4.3安全性評(píng)價(jià)3.4.3.1眼刺激安全性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，陽性對(duì)照0.1mol/L氫氧化鈉，有明顯的出血、凝血現(xiàn)象，ES=16.0，有嚴(yán)重刺激性；陰性對(duì)照0.9%NaCl溶液，無出血、凝血或血管融解，ES=0.0，無刺激性；6批樣品血管無融解，部分批次出現(xiàn)輕微出血現(xiàn)象，平均ES=1.33，有輕微刺激性。(a)陽性對(duì)照(b)陰性對(duì)照(c)樣品(0.1mol/L氫氧化鈉)（0.9%NaCl溶液）（益母草美白凝膠面膜）圖3-7益母草美白凝膠面膜的眼刺激安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.4.3.2皮膚安全性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果圖3-8受試小鼠的體重變化(a)剃毛后(b)涂抹后(c)24h后（d）72h后圖3-9小鼠皮膚狀況圖由圖3-8可知，小鼠體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥區(qū)皮膚表面均無出現(xiàn)紅腫、脫毛等現(xiàn)象，且經(jīng)觀測(cè)小鼠行為狀態(tài)良好，未出現(xiàn)震顫、抽搐等不正常癥狀，結(jié)果表明樣品對(duì)皮膚無刺激性。4結(jié)論本文采用了較傳統(tǒng)更高效的超聲醇提法提取益母草中的總黃酮類成分，通過單因素考察后采用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，最終得到最佳工藝條件為：料液比1：30、乙醇溶液70%，超聲30min，此時(shí)益母草總黃酮提取率最高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行提取液純化所得得率為5.41%，酪氨酸酶抑制活性實(shí)驗(yàn)益母草總黃酮提取液濃度（IC50）為0.031mg/mL，其中，在0.052mg/mL的質(zhì)量濃度處酪氨酸酶抑制率最高可達(dá)80.4%，證明了益母草總黃酮成分具有一定的抑制黑色素作用?；诖碎_發(fā)的益母草美白凝膠面膜的感官評(píng)價(jià)、理化指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)及皮膚安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)證明該面膜有輕微眼刺激性、無皮膚刺激性，本文對(duì)于后期工業(yè)開發(fā)益母草藥妝產(chǎn)品具有一定的參考意義。參考文獻(xiàn)柴玉,劉學(xué)偉.古今美顏“神品”大盤點(diǎn)[J].中醫(yī)健康養(yǎng)生,2018,4(7):9-14.趙陽.《香奩潤(rùn)色》美容方劑的組方與用藥特點(diǎn)研究[D].黑龍江：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2016.國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(第四部2020版）[S]