唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的藥效學(xué)及分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年胃癌新增病例達(dá)1089103例，死亡人數(shù)為768793例，是全球第五大常見癌癥和第四大癌癥死亡原因。在我國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，每年新發(fā)病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半。更為嚴(yán)峻的是，多數(shù)中國胃癌患者確診時(shí)已處于中晚期，治療難度顯著增加，死亡率居高不下，5年相對生存率僅為6%左右。例如，早期胃癌患者手術(shù)治療后的5年生存率超過90%，其中始發(fā)階段小胃癌及微小胃癌的10年生存率可達(dá)100%；而晚期胃癌患者的生存期往往不超過1年，這鮮明的對比凸顯出胃癌早期診斷和有效治療的緊迫性。目前，胃癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除是關(guān)鍵的治療方式，但對于中晚期患者，單純手術(shù)治療效果有限，且術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高。化療雖能在一定程度上抑制腫瘤生長，但由于其缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。放療也存在類似問題，會對周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷。靶向治療和免疫治療雖為胃癌治療帶來了新的希望，但這些新型療法僅對部分特定患者有效，且價(jià)格昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，尋找安全、有效、低毒的新型抗胃癌藥物或治療方法，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要課題。唐古特鐵線蓮（Clematistangutica(Maxim.)Korsh）是毛茛科鐵線蓮屬的多年生草本植物，作為一種傳統(tǒng)藏藥，在藏藥文獻(xiàn)中早有記載，其具有祛寒、增生胃火、活血通瘀、破痞瘤積聚等功效，常用于治療消化不良、痞瘤病、寒性腫瘤、黃水病及浮腫等疾病?，F(xiàn)代研究表明，唐古特鐵線蓮的藥理作用與其所含豐富的皂苷類成分密切相關(guān)。皂苷是一類具有多種生物活性的化合物，在抗腫瘤、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等方面展現(xiàn)出顯著作用。已有研究證實(shí)，一些鐵線蓮屬植物中的皂苷對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，如肉瘤180（S180）、肝癌腹水型（HepA）和白血病腹水型（P388）等小鼠移植性腫瘤模型，鐵線蓮皂苷均表現(xiàn)出顯著的抑制效果。然而，目前對于唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的藥效學(xué)及分子機(jī)制研究尚處于起步階段，其具體的作用靶點(diǎn)和信號通路仍不明確。深入研究唐古特鐵線蓮皂苷類成分的抗胃癌藥效學(xué)及分子機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來看，有助于揭示唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的作用機(jī)制，豐富中藥抗腫瘤的理論體系，為進(jìn)一步研究其他天然產(chǎn)物的抗腫瘤作用提供思路和方法。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，若能明確唐古特鐵線蓮皂苷類成分的抗胃癌活性及作用機(jī)制，有望開發(fā)出新型的抗胃癌藥物或輔助治療手段，為胃癌患者提供更多的治療選擇，提高胃癌的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，同時(shí)也能推動(dòng)藏藥現(xiàn)代化進(jìn)程，促進(jìn)藏藥資源的開發(fā)利用。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1唐古特鐵線蓮皂苷類成分的研究進(jìn)展唐古特鐵線蓮作為傳統(tǒng)藏藥，其化學(xué)成分的研究受到了廣泛關(guān)注，尤其是皂苷類成分。研究人員已從唐古特鐵線蓮中分離鑒定出多種皂苷類化合物。牛江進(jìn)采用多種柱層析技術(shù)對唐古特鐵線蓮全草醇提物進(jìn)行分離、純化，共得到13個(gè)化合物，其中包括多種皂苷類成分。通過波譜分析（如1H-NMR、13C-NMR、DEPT等）鑒定了這些化合物的結(jié)構(gòu)，為深入研究唐古特鐵線蓮的化學(xué)成分奠定了基礎(chǔ)。劉小蘭等運(yùn)用紫外分光光度法對青海不同產(chǎn)地唐古特鐵線蓮中總皂苷的含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)唐古特鐵線蓮中總皂苷的含量與其部位和產(chǎn)地有關(guān)，其中葉部的總皂苷含量明顯高于其它部位。這一研究結(jié)果為唐古特鐵線蓮的質(zhì)量控制和資源開發(fā)提供了重要的參考依據(jù)。在皂苷類成分的分離制備技術(shù)方面，也取得了一定的進(jìn)展。例如，有研究采用大孔樹脂和高速逆流色譜相結(jié)合的方法，從唐古特鐵線蓮中成功富集和分離出皂苷類化合物。大孔樹脂柱色譜具有技術(shù)重復(fù)性好、吸附能力高、操作費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，可用于皂苷類化合物的富集；高速逆流色譜則克服了傳統(tǒng)硅膠柱色譜帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點(diǎn)，對于結(jié)構(gòu)類似且極性相近的皂苷類化合物具有良好的分離效果。這些技術(shù)的應(yīng)用，提高了皂苷類成分的分離效率和純度，為進(jìn)一步研究其生物活性和作用機(jī)制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。在生物活性研究方面，唐古特鐵線蓮皂苷類成分展現(xiàn)出了多種生物活性。除了前文提到的抗腫瘤活性外，還具有抗炎、抗菌等作用。有研究表明，唐古特鐵線蓮皂苷能夠抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)；對某些細(xì)菌和真菌也具有一定的抑制生長作用。這些生物活性的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步拓展了唐古特鐵線蓮皂苷類成分的應(yīng)用前景。1.2.2胃癌治療的研究進(jìn)展目前，胃癌的治療方法呈現(xiàn)多元化的發(fā)展趨勢。手術(shù)治療仍然是胃癌治療的重要手段之一，尤其是對于早期胃癌患者，根治性手術(shù)切除能夠取得較好的治療效果。對于中晚期胃癌患者，單純手術(shù)治療往往難以達(dá)到根治的目的，需要結(jié)合化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種方法進(jìn)行綜合治療?；熓侵型砥谖赴┚C合治療的重要組成部分，常用的化療藥物包括氟尿嘧啶、順鉑、紫杉醇等。這些藥物通過不同的作用機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和分裂。然而，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。放療則是利用放射線對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，可在一定程度上控制腫瘤的生長和擴(kuò)散。但放療同樣存在對周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷的問題，限制了其應(yīng)用范圍。隨著對腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，靶向治療和免疫治療為胃癌治療帶來了新的希望。靶向治療藥物能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的某些靶點(diǎn)，如HER2、VEGFR、FGFR等，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長信號傳導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。例如，抗HER2抗體曲妥珠單抗在HER2陽性胃癌患者的治療中顯示出了較好的療效，能夠延長患者的生存期。免疫治療則是通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如nivolumab、pembrolizumab等）在部分胃癌患者中取得了顯著的治療效果，尤其是對于腫瘤突變負(fù)荷高、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型的胃癌患者。這些新型治療方法的出現(xiàn)，為胃癌患者提供了更多的治療選擇，顯著改善了部分患者的預(yù)后。1.2.3唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的研究尚處于起步階段。已有一些研究初步探討了唐古特鐵線蓮提取物或皂苷類成分對胃癌細(xì)胞的抑制作用。有研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)唐古特鐵線蓮醇提物能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建胃癌荷瘤小鼠模型，給予唐古特鐵線蓮提取物或皂苷類成分，觀察到腫瘤生長受到一定程度的抑制，荷瘤小鼠的生存期有所延長。然而，這些研究大多停留在初步的藥效學(xué)觀察階段，對于唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的具體分子機(jī)制研究還相對較少。目前尚未明確其作用的具體靶點(diǎn)和相關(guān)信號通路，這限制了對其抗胃癌作用的深入理解和進(jìn)一步開發(fā)利用。1.2.4研究現(xiàn)狀分析與展望綜合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，雖然在唐古特鐵線蓮皂苷類成分的分離鑒定、生物活性以及胃癌治療等方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在諸多不足。在唐古特鐵線蓮皂苷類成分研究中，雖然已分離鑒定出多種皂苷，但對于其構(gòu)效關(guān)系的研究還不夠深入，不同結(jié)構(gòu)皂苷的生物活性差異及作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。在胃癌治療方面，現(xiàn)有的治療方法雖然取得了一定的療效，但仍存在諸多問題，如化療和放療的不良反應(yīng)、靶向治療和免疫治療的適用人群有限等。在唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌研究中，缺乏系統(tǒng)深入的研究，尤其是在分子機(jī)制方面，需要進(jìn)一步探索其作用靶點(diǎn)和信號通路，以明確其抗胃癌的作用機(jī)制。未來的研究可以從以下幾個(gè)方向展開：深入研究唐古特鐵線蓮皂苷類成分的構(gòu)效關(guān)系，通過結(jié)構(gòu)修飾和改造，尋找活性更強(qiáng)、毒性更低的皂苷類化合物；系統(tǒng)開展唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的藥效學(xué)研究，優(yōu)化給藥方案，提高其抗胃癌效果；運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的分子機(jī)制，明確其作用靶點(diǎn)和信號通路，為開發(fā)新型抗胃癌藥物提供理論依據(jù)；加強(qiáng)唐古特鐵線蓮皂苷類成分與現(xiàn)有胃癌治療方法的聯(lián)合應(yīng)用研究，探索協(xié)同增效的治療方案，提高胃癌的綜合治療水平。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分的抗胃癌藥效學(xué)及分子機(jī)制，為開發(fā)新型抗胃癌藥物提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體而言，擬通過一系列實(shí)驗(yàn)和分析，明確唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞和荷瘤小鼠的抑制作用，揭示其抗胃癌的分子機(jī)制，并評估其安全性和有效性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，將選用多種人胃癌細(xì)胞系，如SGC-7901、BGC-823等，通過MTT法、CCK-8法等檢測唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。利用流式細(xì)胞術(shù)分析皂苷類成分對胃癌細(xì)胞周期分布和凋亡的影響，通過Hoechst33342染色、AnnexinV-FITC/PI雙染等方法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的表達(dá)水平，以深入了解其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將采用BALB/c裸鼠或C57BL/6小鼠，通過皮下接種胃癌細(xì)胞構(gòu)建胃癌荷瘤小鼠模型。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為對照組、陽性對照組和不同劑量的唐古特鐵線蓮皂苷類成分實(shí)驗(yàn)組，連續(xù)給予相應(yīng)藥物干預(yù)一段時(shí)間后，測量腫瘤體積和重量，計(jì)算抑瘤率，觀察皂苷類成分對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用。通過免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白（如Ki-67）、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及血管生成相關(guān)因子（如VEGF）的表達(dá)，評估皂苷類成分對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成的影響。同時(shí)，檢測荷瘤小鼠的血常規(guī)、肝腎功能指標(biāo)，觀察其對機(jī)體重要臟器的影響，以評價(jià)唐古特鐵線蓮皂苷類成分的安全性。為了探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的分子機(jī)制，將采用基因芯片技術(shù)或RNA測序技術(shù)，分析皂苷類成分處理前后胃癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化，篩選出差異表達(dá)基因。通過生物信息學(xué)分析，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和信號通路富集分析，初步確定皂苷類成分作用的關(guān)鍵信號通路。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot對芯片或測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步明確關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)變化。采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)或小分子抑制劑，敲低或抑制關(guān)鍵信號通路中的關(guān)鍵基因或蛋白，觀察其對唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌作用的影響，從而驗(yàn)證關(guān)鍵信號通路在其抗胃癌機(jī)制中的作用。二、唐古特鐵線蓮皂苷類成分概述2.1唐古特鐵線蓮植物簡介唐古特鐵線蓮（Clematistangutica(Maxim.)Korsh），為毛茛科（Ranunculaceae）鐵線蓮屬（ClematisL.）多年生落葉藤本植物，又名甘青鐵線蓮。其植株長度在適宜環(huán)境下可達(dá)1-4米，而生于干旱沙地者則較為矮小，僅30厘米。主根粗壯且木質(zhì)化，為植株提供了穩(wěn)固的支撐和充足的養(yǎng)分儲存。莖部具有明顯的棱，幼時(shí)被長柔毛覆蓋，隨著生長，柔毛逐漸脫落，使莖表面變得相對光滑。唐古特鐵線蓮的葉片為一回羽狀復(fù)葉，通常由5-7片小葉組成。這些小葉形態(tài)豐富多樣，基部從淺裂、深裂到全裂不等，中央裂片較大，側(cè)裂片相對較小，整體呈卵狀長圓形、狹長圓形或披針形。葉片長度在3-4厘米，寬度為0.5-1.5厘米，頂端略顯鈍圓并帶有短尖頭，基部呈楔形，邊緣裝飾有不規(guī)則的缺刻狀鋸齒。葉面光滑或微有毛，而葉背則覆蓋有稀疏的長毛，這種葉片特征有助于其在高原環(huán)境中減少水分散失和抵御外界侵害。葉柄長度可達(dá)3-4厘米，為葉片提供了良好的支撐和物質(zhì)運(yùn)輸通道。其花朵單生或形成單聚傘花序，腋生，包含三朵花?；ㄐ蚬４謮?，長度在6-15厘米之間，表面附有柔毛，使得花序在風(fēng)中更加穩(wěn)固。萼片四枚，色彩獨(dú)特，外黃內(nèi)帶紫色，斜向上展開，形狀介于狹卵形與橢圓狀長圓形之間，長度為1.5-2.5厘米。頂端尖銳或急尖，邊緣外側(cè)附有短絨毛，中部則被柔毛覆蓋，內(nèi)側(cè)則相對光滑或近乎無毛。這種獨(dú)特的花部結(jié)構(gòu)和顏色特征，既有利于吸引傳粉昆蟲，又能保護(hù)花蕊免受外界傷害?；ńz基部略顯扁平，表面覆蓋展開的柔毛，花藥則光滑無毛，子房部分密被柔毛，這些特征與花朵的繁殖功能密切相關(guān)?；ㄆ跒?月至9月，果期為9月至10月，在這期間，唐古特鐵線蓮?fù)瓿闪藦拈_花到結(jié)果的生命周期。唐古特鐵線蓮具有廣泛的地理分布，主要分布于中國、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦、印度、尼泊爾、加拿大等地。在中國，其分布于新疆（海拔2160-2700米）、西藏（3150-4900米）、四川西部（1920-3800米）、青海（1370-2700米）、甘肅南部和東部（1800-3700米）、陜西等地。它通常生長在海拔1300-4900米的高原草地或灌叢中，這種高海拔的生長環(huán)境賦予了唐古特鐵線蓮獨(dú)特的生態(tài)適應(yīng)性。在野生狀態(tài)下，中國青海省的唐古特鐵線蓮5月初開始返青、出苗，出苗期為10-20天。5月15日左右進(jìn)入苗期，此時(shí)期持續(xù)到6月20日左右。6月15日以后，開始現(xiàn)蕾，6月24日左右開花。7月1日左右進(jìn)入盛花期，8月10日左右盛花期結(jié)束，歷時(shí)40余天。9月10日果開始成熟，但不飽滿，直至10月10日采收第一批果實(shí)，成熟期為10月10日-10月30日，歷時(shí)20天。這些物候特征與當(dāng)?shù)氐臍夂蚝铜h(huán)境條件密切相關(guān)，是唐古特鐵線蓮長期適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。作為傳統(tǒng)藏藥，唐古特鐵線蓮在藏藥文獻(xiàn)中早有記載，如《晶珠本草》和《藏藥志》等。其性辛、甘、溫，具有祛寒，增生胃火，活血通瘀，破痞瘤積聚等功效。在傳統(tǒng)藏醫(yī)臨床實(shí)踐中，常被用于治療消化不良、痞瘤病、寒性腫瘤、黃水病及浮腫等疾病。例如，在治療胃寒和消化不良時(shí)，唐古特鐵線蓮常與其他藥材配伍使用，以增強(qiáng)療效。其在藏藥中的應(yīng)用歷史悠久，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，為現(xiàn)代研究提供了重要的參考依據(jù)。2.2皂苷類成分的結(jié)構(gòu)與分類皂苷是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)中包含苷元（aglycone）和糖鏈（sugarchain）兩部分。在唐古特鐵線蓮中，皂苷類成分的苷元主要為三萜類化合物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，可分為常春藤皂苷元型和齊墩果酸型等類型。常春藤皂苷元型皂苷的苷元具有五環(huán)三萜的結(jié)構(gòu)，其基本骨架由30個(gè)碳原子組成，包含五個(gè)環(huán)（A、B、C、D、E）。在常春藤皂苷元的結(jié)構(gòu)中，C-3位羥基與糖鏈相連，形成苷鍵。糖鏈部分通常由多種單糖組成，如葡萄糖（glucose）、鼠李糖（rhamnose）、阿拉伯糖（arabinose）等。這些單糖通過不同的連接方式和順序形成復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)，例如，常春藤皂苷C（hederacosideC）是唐古特鐵線蓮中常見的一種常春藤皂苷元型皂苷，其糖鏈由β-D-葡萄糖、α-L-阿拉伯糖和α-L-鼠李糖組成，連接順序?yàn)棣?L-阿拉伯糖(1→3)-α-L-鼠李糖(1→4)-β-D-葡萄糖。這種獨(dú)特的糖鏈結(jié)構(gòu)不僅影響皂苷的物理性質(zhì)，如溶解性、穩(wěn)定性等，還可能對其生物活性產(chǎn)生重要影響。研究表明，常春藤皂苷元型皂苷具有多種生物活性，如心肌保護(hù)、抗缺血性腦損傷、抗腫瘤細(xì)胞和抗菌活性等。其抗腫瘤活性可能與糖鏈的結(jié)構(gòu)和組成密切相關(guān)，不同的糖鏈結(jié)構(gòu)可能影響皂苷與腫瘤細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，進(jìn)而影響其抗腫瘤效果。齊墩果酸型皂苷的苷元同樣是五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)，但與常春藤皂苷元型皂苷在結(jié)構(gòu)上存在一些差異。齊墩果酸的結(jié)構(gòu)中，C-3位羥基也可與糖鏈相連形成苷鍵。糖鏈部分的組成和連接方式與常春藤皂苷元型皂苷類似，但具體的糖基種類和連接順序可能有所不同。例如，從唐古特鐵線蓮中分離得到的一些齊墩果酸型皂苷，其糖鏈可能由葡萄糖、半乳糖（galactose）、木糖（xylose）等單糖組成。齊墩果酸型皂苷也具有一定的生物活性，如抗炎、抗氧化等。在抗炎作用方面，齊墩果酸型皂苷可能通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路，抑制炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎效果。皂苷類成分的結(jié)構(gòu)與活性之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。一般來說，苷元的結(jié)構(gòu)類型和糖鏈的組成、連接方式都會對皂苷的生物活性產(chǎn)生影響。不同類型的苷元由于其空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的差異，可能具有不同的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。糖鏈部分則可以通過影響皂苷的溶解性、穩(wěn)定性以及與生物分子的相互作用，進(jìn)而影響其生物活性。例如，糖鏈的長度和分支程度可能影響皂苷與細(xì)胞膜的親和力，從而影響其進(jìn)入細(xì)胞的能力和在細(xì)胞內(nèi)的作用效果。此外，糖鏈上的某些特殊糖基或糖基的修飾（如甲基化、乙酰化等）也可能對皂苷的活性產(chǎn)生重要影響。因此，深入研究唐古特鐵線蓮皂苷類成分的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系，對于揭示其藥理作用機(jī)制、開發(fā)新型藥物具有重要意義。2.3皂苷類成分的提取與分離技術(shù)從唐古特鐵線蓮中提取皂苷類成分是研究其抗胃癌活性及分子機(jī)制的基礎(chǔ)，常用的提取方法包括乙醇回流提取、超聲輔助提取和微波輔助提取等。乙醇回流提取是較為經(jīng)典的方法，將唐古特鐵線蓮干燥全草粉碎后，按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在加熱回流的條件下進(jìn)行提取。例如，將唐古特鐵線蓮全草干燥粉碎后，以1g：10-30ml的比例加入60%-95%的乙醇，在60-90℃下回流提取1-4次，每次1-4h。該方法利用乙醇對皂苷類成分的溶解性，通過加熱回流提高提取效率。其優(yōu)點(diǎn)是操作相對簡單，設(shè)備要求不高，能夠較好地提取出皂苷類成分；缺點(diǎn)是提取時(shí)間較長，能耗較大，且可能會破壞一些熱敏性成分。超聲輔助提取則是在提取過程中引入超聲波，利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等，加速皂苷類成分從植物細(xì)胞中溶出。具體操作時(shí)，將唐古特鐵線蓮粉末與提取溶劑混合后，置于超聲設(shè)備中，在一定功率、溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行提取。如在20-80℃、功率50-100w的條件下，提取20-100min，提取1-5次。這種方法能夠顯著縮短提取時(shí)間，提高提取率，同時(shí)減少溶劑的使用量。其作用機(jī)制主要是超聲波的空化作用產(chǎn)生的瞬間高壓和高溫，使植物細(xì)胞壁破裂，促進(jìn)皂苷類成分的釋放；機(jī)械效應(yīng)則使溶劑與植物細(xì)胞充分接觸，加速傳質(zhì)過程。微波輔助提取是利用微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，使植物細(xì)胞內(nèi)的極性分子快速振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，產(chǎn)生內(nèi)熱，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，從而使皂苷類成分釋放出來。在提取過程中，將唐古特鐵線蓮粉末與提取溶劑混合后，放入微波反應(yīng)器中，在特定的微波功率、時(shí)間和溫度條件下進(jìn)行提取。該方法具有提取速度快、效率高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備成本較高，對操作要求也較為嚴(yán)格。提取得到的唐古特鐵線蓮皂苷粗提物中往往含有多種雜質(zhì)，需要進(jìn)一步進(jìn)行分離純化。大孔樹脂柱色譜是常用的分離技術(shù)之一，其原理是利用大孔樹脂對不同成分的吸附和解吸能力差異，實(shí)現(xiàn)皂苷類成分的富集和初步分離。大孔樹脂具有較大的比表面積和孔徑，能夠通過物理吸附作用選擇性地吸附皂苷類成分。例如，將唐古特鐵線蓮皂苷粗提物用純水溶解后，以一定流速上大孔樹脂柱，先用低濃度乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再用高濃度乙醇洗脫收集皂苷類成分。不同類型的大孔樹脂對皂苷類成分的吸附性能有所差異，常用的大孔樹脂有HPD-100、X-5、HPD-400、AB-8等。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)皂苷類成分的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的大孔樹脂類型、洗脫劑濃度和洗脫流速等條件。硅膠柱色譜也是常用的分離手段，硅膠作為固定相，利用不同成分在硅膠表面的吸附和分配系數(shù)差異進(jìn)行分離。將唐古特鐵線蓮皂苷粗提物用適量溶劑溶解后，上硅膠柱，選擇合適的洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫。洗脫劑通常為不同比例的有機(jī)溶劑混合體系，如氯仿-甲醇-水等。通過調(diào)整洗脫劑的組成和比例，可以實(shí)現(xiàn)不同極性皂苷類成分的分離。硅膠柱色譜的優(yōu)點(diǎn)是分離效果好，適用范圍廣，但對于極性較大的皂苷類成分，可能存在拖尾現(xiàn)象，影響分離效果。高速逆流色譜（HSCCC）是一種高效的液-液分配色譜技術(shù)，其原理是利用樣品在互不相溶的兩相溶劑系統(tǒng)中連續(xù)分配，根據(jù)各成分在兩相中的分配系數(shù)差異實(shí)現(xiàn)分離。在唐古特鐵線蓮皂苷類成分的分離中，HSCCC克服了傳統(tǒng)硅膠柱色譜樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點(diǎn)，對于結(jié)構(gòu)類似且極性相近的皂苷類化合物具有良好的分離效果。例如，采用乙酸乙酯-正丁醇-水（1-4:1-4:1-4，v:v:v）作為溶劑系統(tǒng)，主機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，分離溫度為25-40℃，流動(dòng)相流速為1-4ml/min，采用“頭-尾”或“尾-頭”分離模式，可以有效地分離出多種皂苷類成分。該技術(shù)具有載樣量大、回收率高、效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠得到高純度的皂苷類化合物。三、胃癌的現(xiàn)狀與機(jī)制3.1胃癌的流行病學(xué)特征胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直處于較高水平，在各類惡性腫瘤中占據(jù)著顯著的位置。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，當(dāng)年胃癌新增病例達(dá)到了1089103例，在所有癌癥新發(fā)病例中位居第五；死亡人數(shù)則為768793例，成為全球第四大癌癥死亡原因。從地域分布來看，胃癌的發(fā)病存在明顯的地區(qū)差異。東亞地區(qū)，包括蒙古國、中國、韓國和日本，以及南美洲安第斯地區(qū)和東歐，是胃癌的高發(fā)區(qū)域。例如，日本的胃癌發(fā)病率一直處于較高水平，男性發(fā)病率超過70/10萬，女性超過30/10萬。而北美、北歐以及非洲和東南亞的大多數(shù)國家，胃癌發(fā)病率相對較低。在全球范圍內(nèi)，大約70%以上的胃癌發(fā)生在資源有限的國家。在中國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，形勢嚴(yán)峻。2019年中國國家癌癥中心的數(shù)據(jù)表明，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第二位和第三位，是我國發(fā)病率第一的消化道惡性腫瘤，遠(yuǎn)高于世界平均水平。2020年，中國的胃癌新發(fā)病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的43.9%，死亡病例數(shù)占全球死亡病例數(shù)的48.6%。我國胃癌發(fā)病具有明顯的地域性差別，西北與東部沿海地區(qū)的胃癌發(fā)病率明顯高于南方地區(qū)。農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于城市，偏遠(yuǎn)地區(qū)的發(fā)病率高于沿海地區(qū)，這可能與經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、環(huán)境因素以及生活飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)。例如，沿海地區(qū)居民的飲食中海鮮等富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸的食物相對較多，而內(nèi)陸偏遠(yuǎn)地區(qū)居民的飲食中腌制、熏烤等加工食品的比例可能更高，這些加工食品中往往含有較多的亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)，增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。近年來，胃癌的發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，這一現(xiàn)象引起了廣泛關(guān)注。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，19-35歲青年人的胃癌發(fā)病率明顯上升，比70年代增加了一倍，已占總病例的6%。導(dǎo)致胃癌年輕化的原因是多方面的。生活方式的改變是一個(gè)重要因素，現(xiàn)代社會快節(jié)奏的生活、不健康的作息和飲食習(xí)慣，如熬夜、暴飲暴食、過度飲酒、大量攝入腌制和熏烤食物等，都可能增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。例如，酗酒會使胃壁持續(xù)遭受乙醇的刺激，容易引起胃部慢性炎癥，進(jìn)而誘發(fā)胃及十二指腸潰瘍，在此基礎(chǔ)上若繼續(xù)酗酒，會使胃粘膜重度增生，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。過量吸煙也是青少年易患胃癌的重要因素，煙草中的尼古丁和其他化學(xué)物質(zhì)可導(dǎo)致胃黏膜損傷和炎癥，增加胃癌風(fēng)險(xiǎn)。此外，精神壓力過大也是一個(gè)不可忽視的因素，現(xiàn)代社會青年人的工作和生活節(jié)奏普遍加快，精神上處于持續(xù)應(yīng)激狀態(tài)，會反饋性地誘發(fā)胃癌。據(jù)調(diào)查，精神壓力過重，經(jīng)常發(fā)生情緒危機(jī)的人容易患胃癌，因?yàn)榫駹顟B(tài)能影響胃的蠕動(dòng)和分泌，易誘發(fā)或加重各種胃病，并降低人體的免疫功能。3.2胃癌的發(fā)病機(jī)制胃癌的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的多因素、多步驟過程，涉及多種致癌因素和分子生物學(xué)機(jī)制。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被公認(rèn)為是胃癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約50%的胃癌患者與Hp感染相關(guān)。Hp能夠產(chǎn)生多種毒力因子，如細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）和空泡毒素A（VacA）等。CagA蛋白可通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入胃上皮細(xì)胞，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K-Akt等，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡失衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。VacA則能誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞形成空泡，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)還可抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，為腫瘤的發(fā)生創(chuàng)造有利條件。此外，Hp感染引起的慢性炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致胃黏膜微環(huán)境改變，產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞和炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子可通過激活核因子-κB（NF-κB）等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。不良飲食習(xí)慣在胃癌的發(fā)生中也起著重要作用。長期食用高鹽食物是胃癌的重要危險(xiǎn)因素之一。高鹽飲食會破壞胃黏膜的保護(hù)屏障，使胃黏膜直接暴露于胃酸和其他有害物質(zhì)的刺激下，導(dǎo)致胃黏膜損傷和炎癥反應(yīng)。高鹽食物還可促進(jìn)幽門螺桿菌的生長和黏附，增強(qiáng)其致癌作用。腌制、熏烤等加工食品中通常含有較多的亞硝酸鹽和多環(huán)芳烴類化合物。亞硝酸鹽在胃內(nèi)酸性環(huán)境下可與胺類物質(zhì)結(jié)合形成亞硝胺，而亞硝胺是一類強(qiáng)致癌物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞發(fā)生基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。熏烤食物在制作過程中產(chǎn)生的多環(huán)芳烴類化合物，如苯并芘等，也具有致癌性，可通過損傷DNA，引發(fā)細(xì)胞癌變。此外，長期攝入新鮮蔬菜水果不足，導(dǎo)致維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等抗氧化劑攝入減少，無法有效清除體內(nèi)的自由基，也會增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。遺傳因素在胃癌的發(fā)病中也占有一定比例，約10%的胃癌患者具有家族遺傳傾向。家族性腺瘤性息肉?。‵AP）、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）等遺傳性疾病與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。在FAP患者中，由于APC基因突變，導(dǎo)致腺瘤性息肉在胃腸道內(nèi)大量生長，其中一部分息肉可發(fā)生癌變，進(jìn)而發(fā)展為胃癌。HNPCC患者則由于錯(cuò)配修復(fù)基因（如MLH1、MSH2等）的突變，導(dǎo)致DNA錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，使細(xì)胞在復(fù)制過程中容易發(fā)生基因突變，增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，一些與胃癌相關(guān)的易感基因，如E-cadherin、TP53、RUNX3等，其突變或多態(tài)性也可能影響個(gè)體對胃癌的易感性。例如，E-cadherin基因的突變可導(dǎo)致其編碼的蛋白表達(dá)減少或功能異常，破壞細(xì)胞間的黏附連接，使細(xì)胞容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，從而增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。從分子生物學(xué)機(jī)制角度來看，胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)信號通路的異常激活或抑制。PI3K-Akt信號通路在胃癌中常常被激活。PI3K可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募并激活A(yù)kt蛋白。激活的Akt可通過磷酸化多種下游底物，如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而推動(dòng)胃癌的發(fā)生發(fā)展。例如，Akt可通過磷酸化GSK-3β，抑制其活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等。Wnt/β-catenin信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。在正常情況下，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，參與細(xì)胞間的黏附連接，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中，β-catenin被由Axin、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、GSK-3β等組成的降解復(fù)合物磷酸化，隨后被泛素化降解。當(dāng)Wnt信號通路激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合，抑制降解復(fù)合物的活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移。在胃癌中，常常出現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，如β-catenin基因突變導(dǎo)致其不能被正常降解，或者Wnt信號通路相關(guān)的配體、受體或調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)，均可導(dǎo)致該信號通路的持續(xù)激活，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。此外，細(xì)胞周期調(diào)控異常、凋亡失衡、血管生成異常等也是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要分子生物學(xué)機(jī)制。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，CyclinD1、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的過度表達(dá)，以及p16、p21等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)降低，可導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，使細(xì)胞異常增殖。在凋亡失衡方面，Bcl-2家族蛋白的表達(dá)失衡，如Bcl-2蛋白高表達(dá)、Bax蛋白低表達(dá)，可抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞得以存活和增殖。血管生成異常則為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了必要的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。3.3現(xiàn)有治療方法及局限性目前，胃癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，每種治療方法都有其獨(dú)特的作用機(jī)制和應(yīng)用范圍，但也存在一定的局限性。手術(shù)切除是胃癌治療的重要手段之一，尤其是對于早期胃癌患者，根治性手術(shù)切除能夠取得較好的治療效果。早期胃癌患者，如病變僅局限于黏膜層或黏膜下層，通過手術(shù)切除腫瘤組織，5年生存率可達(dá)90%以上。然而，對于中晚期胃癌患者，由于腫瘤侵犯范圍廣，單純手術(shù)治療往往難以達(dá)到根治的目的，且術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中晚期胃癌患者術(shù)后5年生存率僅為20%-30%。此外，手術(shù)治療還會對患者的身體造成較大創(chuàng)傷，術(shù)后可能出現(xiàn)一系列并發(fā)癥，如出血、感染、吻合口瘺等，影響患者的康復(fù)和生活質(zhì)量。化療是中晚期胃癌綜合治療的重要組成部分，通過使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長和分裂。常用的化療藥物包括氟尿嘧啶、順鉑、紫杉醇等。這些藥物通過不同的作用機(jī)制，如干擾DNA合成、抑制微管蛋白聚合等，來殺傷腫瘤細(xì)胞?；熾m然能夠在一定程度上控制腫瘤的生長，但也存在明顯的局限性。化療藥物缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。這些不良反應(yīng)不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無法耐受化療，不得不中斷治療，從而影響治療效果。據(jù)報(bào)道，約有30%-50%的化療患者會因不良反應(yīng)而中斷治療。此外，長期使用化療藥物還可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，這也是化療面臨的一個(gè)重要難題。放療是利用放射線對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，可在一定程度上控制腫瘤的生長和擴(kuò)散。放療通常用于局部晚期胃癌患者，作為手術(shù)治療的輔助手段，或用于無法手術(shù)切除的患者。然而，放療同樣存在對周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷的問題，可能導(dǎo)致放射性胃炎、食管炎、腸炎等并發(fā)癥，限制了其應(yīng)用范圍。放療的療效也受到腫瘤的位置、大小、分期以及患者個(gè)體差異等多種因素的影響，對于一些對放療不敏感的腫瘤細(xì)胞，放療效果可能不理想。靶向治療是近年來發(fā)展起來的一種新型治療方法，通過特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的某些靶點(diǎn)，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長信號傳導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。常見的靶向治療靶點(diǎn)包括HER2、VEGFR、FGFR等。例如，抗HER2抗體曲妥珠單抗在HER2陽性胃癌患者的治療中顯示出了較好的療效，能夠延長患者的生存期。然而，靶向治療僅對部分特定患者有效，其適用人群有限。例如，HER2陽性胃癌患者僅占所有胃癌患者的10%-20%。此外，靶向治療藥物的價(jià)格昂貴，也限制了其廣泛應(yīng)用。而且，隨著治療時(shí)間的延長，腫瘤細(xì)胞也可能對靶向治療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。免疫治療是通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如nivolumab、pembrolizumab等）是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的免疫治療藥物。這些藥物通過阻斷免疫檢查點(diǎn)蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，解除腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的抑制，使免疫系統(tǒng)能夠識別和殺傷腫瘤細(xì)胞。免疫治療在部分胃癌患者中取得了顯著的治療效果，尤其是對于腫瘤突變負(fù)荷高、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型的胃癌患者。然而，免疫治療并非對所有胃癌患者都有效，其有效率相對較低，且可能會引起免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性肝炎、免疫性腸炎等。此外，免疫治療的費(fèi)用也較高，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。四、唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌藥效學(xué)研究4.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選擇與培養(yǎng)選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。SGC-7901細(xì)胞系是從一名57歲男性胃腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本中建立的，具有典型的胃癌細(xì)胞特征，在胃癌研究中被廣泛應(yīng)用。BGC-823細(xì)胞系則是從一名62歲男性胃低分化腺癌患者的腹水轉(zhuǎn)移灶中建立的，其生物學(xué)特性與胃癌臨床發(fā)病情況具有一定的相關(guān)性。細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的飽和水汽CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，即細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速拿回操作臺，輕敲培養(yǎng)瓶使細(xì)胞完全脫落。接著加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液。加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)需要凍存細(xì)胞時(shí)，選擇生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。首先按照傳代步驟將細(xì)胞消化并離心收集，用凍存液（90%FBS+10%DMSO）重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1×10^6-1×10^7個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1ml，并做好標(biāo)記。將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。在凍存和復(fù)蘇過程中，嚴(yán)格遵循操作規(guī)程，以確保細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性不受影響。4.1.2皂苷類成分對胃癌細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8法檢測不同濃度唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。將處于對數(shù)生長期的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10^3個(gè)/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200μl細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。設(shè)置空白對照組（只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞和皂苷類成分）、陰性對照組（含細(xì)胞和培養(yǎng)基，但不含皂苷類成分）以及不同濃度的皂苷類成分實(shí)驗(yàn)組。將唐古特鐵線蓮皂苷類成分用DMSO溶解，配制成高、中、低不同濃度的溶液，如100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml等。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。向?qū)嶒?yàn)組各孔中加入不同濃度的皂苷類成分溶液，使其終體積為200μl。對照組加入等體積的DMSO溶液。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前1-4小時(shí)，向每孔加入10μlCCK-8試劑。繼續(xù)培養(yǎng)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。反應(yīng)結(jié)束后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，公式為：細(xì)胞生長抑制率（%）=（陰性對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/陰性對照組OD值×100%。以皂苷類成分濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞生長抑制率為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。根據(jù)生長曲線，分析不同濃度皂苷類成分在不同時(shí)間點(diǎn)對胃癌細(xì)胞增殖的抑制效果。同時(shí)，通過計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），評估皂苷類成分對胃癌細(xì)胞增殖的抑制強(qiáng)度。IC50是指能夠抑制50%細(xì)胞生長的藥物濃度，它反映了藥物對細(xì)胞的抑制活性。一般來說，IC50值越低，說明藥物對細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。通過比較不同濃度皂苷類成分作用下胃癌細(xì)胞的IC50值，可以確定皂苷類成分對胃癌細(xì)胞增殖抑制作用的強(qiáng)弱。例如，如果在某一作用時(shí)間點(diǎn)，SGC-7901細(xì)胞在某皂苷類成分濃度作用下的IC50值為30μg/ml，而BGC-823細(xì)胞的IC50值為40μg/ml，則說明該皂苷類成分對SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)。4.1.3皂苷類成分對胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色等方法檢測唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)情況。將處于對數(shù)生長期的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞，以1×10^6個(gè)/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，向?qū)嶒?yàn)組加入不同濃度的皂苷類成分溶液，對照組加入等體積的DMSO溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)。收集細(xì)胞時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞2次，然后加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。待細(xì)胞變圓脫落后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心，棄去上清液。對于流式細(xì)胞術(shù)檢測，按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒的說明書進(jìn)行操作。向細(xì)胞沉淀中加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。AnnexinV是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，能夠與凋亡早期細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合。PI是一種核酸染料，能夠穿透壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。通過檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強(qiáng)度，可以將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）。分析不同實(shí)驗(yàn)組中早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例，評估皂苷類成分對胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。對于Hoechst染色檢測，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁并經(jīng)皂苷類成分處理后，取出蓋玻片。用PBS潤洗蓋玻片2次，然后將蓋玻片浸泡在4%多聚甲醛溶液中，室溫固定15-30分鐘。固定結(jié)束后，用PBS潤洗蓋玻片3次，每次5分鐘。向蓋玻片上滴加適量的Hoechst33342染液，室溫避光染色5-10分鐘。染色結(jié)束后，用PBS潤洗蓋玻片3次，以去除多余的染液。將蓋玻片置于載玻片上，滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，正常細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞核則呈現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮、邊緣化、核碎裂等特征，發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。通過觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量，進(jìn)一步分析皂苷類成分誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的情況。同時(shí)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。提取經(jīng)皂苷類成分處理后的胃癌細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃加熱5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（如抗Bcl-2、Bax、Caspase-3等抗體）在4℃孵育過夜。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）對PVDF膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光成像。分析不同實(shí)驗(yàn)組中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探討皂苷類成分誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其高表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡；Bax是一種促凋亡蛋白，與Bcl-2具有相互拮抗的作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如果在皂苷類成分處理后，胃癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，Caspase-3蛋白的活性形式（CleavedCaspase-3）表達(dá)增加，則說明皂苷類成分可能通過調(diào)節(jié)這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。4.1.4皂苷類成分對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell小室實(shí)驗(yàn)分為遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)，遷移實(shí)驗(yàn)使用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室，侵襲實(shí)驗(yàn)則使用鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室。Matrigel基質(zhì)膠模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)，能夠更真實(shí)地反映細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲過程。將處于對數(shù)生長期的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10^5個(gè)/ml。在上室中加入200μl細(xì)胞懸液，下室中加入600μl含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于侵襲實(shí)驗(yàn)，先將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育使基質(zhì)膠凝固。在實(shí)驗(yàn)組的上室和下室中分別加入不同濃度的皂苷類成分溶液，對照組加入等體積的DMSO溶液。將Transwell小室置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)（遷移實(shí)驗(yàn)）或48小時(shí)（侵襲實(shí)驗(yàn)）。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞。將小室用4%多聚甲醛固定15-30分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用清水沖洗小室，去除多余的染液。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量。通過比較不同實(shí)驗(yàn)組和對照組中穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，評估皂苷類成分對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。如果在皂苷類成分處理后，穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，則說明皂苷類成分能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)的操作如下，將胃癌細(xì)胞以1×10^6個(gè)/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2ml培養(yǎng)基。待細(xì)胞長滿至90%-100%融合時(shí)，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻地劃一條直線，制造劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞。然后加入含不同濃度皂苷類成分的無血清培養(yǎng)基，對照組加入含DMSO的無血清培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)，在顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，并拍照記錄。使用圖像分析軟件測量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率（%）=（0小時(shí)劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。通過比較不同實(shí)驗(yàn)組和對照組的劃痕愈合率，分析皂苷類成分對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。如果在皂苷類成分處理后，劃痕愈合率明顯降低，則說明皂苷類成分能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。綜合Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，全面評估唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制效果。這有助于深入了解皂苷類成分抗胃癌的作用機(jī)制，為開發(fā)新型抗胃癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型建立選用6-8周齡的BALB/c裸鼠或C57BL/6小鼠，體重18-22g，購自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商，并在SPF級動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。構(gòu)建胃癌荷瘤小鼠模型時(shí)，選取處于對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞系SGC-7901或BGC-823。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集后，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10^7-5×10^7個(gè)/ml。在無菌條件下，將0.2ml細(xì)胞懸液接種于小鼠右前肢腋下皮下。接種后，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，以及腫瘤生長情況。當(dāng)腫瘤體積長至約100-200mm3時(shí)，可認(rèn)為模型構(gòu)建成功，此時(shí)可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。腫瘤體積的計(jì)算公式為：V=0.5×a×b2，其中a為腫瘤的長徑，b為腫瘤的短徑。為了確保模型的成功建立，可對荷瘤小鼠進(jìn)行解剖觀察和病理組織學(xué)檢查。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，脫頸椎處死小鼠，完整取出腫瘤組織。觀察腫瘤的大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地等外觀特征。將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4-5μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式。若腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的胃癌細(xì)胞特征，如細(xì)胞異型性明顯、核大深染、核仁明顯、細(xì)胞排列紊亂等，則可確認(rèn)模型構(gòu)建成功。4.2.2給藥方案設(shè)計(jì)將建模成功的荷瘤小鼠隨機(jī)分為對照組、陽性對照組和不同劑量的唐古特鐵線蓮皂苷類成分實(shí)驗(yàn)組，每組8-10只小鼠。對照組給予等體積的生理鹽水，陽性對照組給予臨床常用的抗胃癌藥物，如5-氟尿嘧啶（5-FU），劑量為20-40mg/kg，腹腔注射。唐古特鐵線蓮皂苷類成分實(shí)驗(yàn)組分為低、中、高三個(gè)劑量組，低劑量組給予50mg/kg，中劑量組給予100mg/kg，高劑量組給予200mg/kg，灌胃給藥。給藥頻率為每天一次，連續(xù)給藥14-21天。在給藥過程中，密切觀察小鼠的體重變化、飲食情況、活動(dòng)狀態(tài)等，記錄小鼠的不良反應(yīng)，如腹瀉、嘔吐、脫毛、精神萎靡等。若出現(xiàn)不良反應(yīng)，根據(jù)具體情況調(diào)整給藥劑量或停止給藥。4.2.3腫瘤生長抑制觀察在給藥期間，每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=0.5×a×b2計(jì)算腫瘤體積。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤生長曲線，觀察唐古特鐵線蓮皂苷類成分對腫瘤生長的抑制情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。計(jì)算抑瘤率，公式為：抑瘤率（%）=（對照組平均腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量）/對照組平均腫瘤重量×100%。通過比較不同實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率，評估唐古特鐵線蓮皂苷類成分對腫瘤生長的抑制效果。例如，若對照組平均腫瘤重量為1.5g，某實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量為0.9g，則該實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率為（1.5-0.9）/1.5×100%=40%。4.2.4對小鼠免疫功能的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，迅速取出胸腺和脾臟，用PBS沖洗干凈，去除表面的血跡和結(jié)締組織。用電子天平稱取胸腺和脾臟的重量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，公式分別為：胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺重量（mg）/體重（g）；脾指數(shù)（mg/g）=脾臟重量（mg）/體重（g）。通過比較不同組小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，分析唐古特鐵線蓮皂苷類成分對小鼠免疫器官發(fā)育的影響。例如，若對照組小鼠的胸腺指數(shù)為3.5mg/g，某實(shí)驗(yàn)組小鼠的胸腺指數(shù)為4.2mg/g，則說明該實(shí)驗(yàn)組小鼠的胸腺發(fā)育可能得到了促進(jìn)，提示唐古特鐵線蓮皂苷類成分可能對小鼠的免疫功能有積極影響。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子的水平，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作，首先將小鼠血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品加入到包被有相應(yīng)抗體的酶標(biāo)板孔中，孵育一段時(shí)間后，洗板去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后加入酶標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育，使二抗與一抗結(jié)合。洗板后，加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，用酶標(biāo)儀在特定波長下測定各孔的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中細(xì)胞因子的含量。分析不同組小鼠血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化，探討唐古特鐵線蓮皂苷類成分對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。例如，若某實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IL-2水平顯著升高，而IL-6和TNF-α水平降低，則說明唐古特鐵線蓮皂苷類成分可能通過調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)小鼠的免疫功能。五、唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌分子機(jī)制研究5.1相關(guān)信號通路的研究5.1.1PI3K/Akt信號通路PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在多種腫瘤包括胃癌的發(fā)生發(fā)展中常常被異常激活。為了探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分對PI3K/Akt信號通路的影響，我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。選用處于對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823，分別用不同濃度的唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理細(xì)胞24小時(shí)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測細(xì)胞中PI3K、Akt以及p-Akt（磷酸化Akt）的蛋白表達(dá)水平。具體操作如下，收集經(jīng)皂苷類成分處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，然后加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃加熱5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（抗PI3K、抗Akt、抗p-Akt抗體）在4℃孵育過夜。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）對PVDF膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光成像。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著唐古特鐵線蓮皂苷類成分濃度的增加，p-Akt的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而PI3K和Akt的總蛋白表達(dá)水平無明顯變化。這表明唐古特鐵線蓮皂苷類成分能夠抑制PI3K/Akt信號通路的激活，可能是通過抑制Akt的磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們采用了磷酸化特異性ELISA試劑盒，定量檢測細(xì)胞中p-Akt的含量。按照試劑盒說明書操作，將細(xì)胞裂解液加入到包被有抗p-Akt抗體的酶標(biāo)板孔中，孵育一段時(shí)間后，洗板去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后加入酶標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育，使二抗與一抗結(jié)合。洗板后，加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，用酶標(biāo)儀在特定波長下測定各孔的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中p-Akt的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Westernblot結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了唐古特鐵線蓮皂苷類成分能夠抑制Akt的磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt信號通路。為了明確PI3K/Akt信號通路在唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌作用中的具體機(jī)制，我們利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)敲低胃癌細(xì)胞中Akt基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)并合成針對Akt基因的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至SGC-7901和BGC-823細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用不同濃度的唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低Akt基因表達(dá)后，唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強(qiáng)。這表明PI3K/Akt信號通路的激活可能是胃癌細(xì)胞對唐古特鐵線蓮皂苷類成分產(chǎn)生抗性的機(jī)制之一，抑制該信號通路能夠增強(qiáng)唐古特鐵線蓮皂苷類成分的抗胃癌效果。5.1.2MAPK信號通路MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38）等多條途徑，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。為了探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分對MAPK信號通路的影響，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。將處于對數(shù)生長期的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞分別用不同濃度的唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理24小時(shí)。采用Westernblot檢測細(xì)胞中ERK、p-ERK（磷酸化ERK）、JNK、p-JNK（磷酸化JNK）、p38和p-p38（磷酸化p38）的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)步驟與檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白類似，收集細(xì)胞后用RIPA裂解液裂解，測定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育以及顯色曝光等操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理后，胃癌細(xì)胞中p-ERK和p-JNK的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而p38的磷酸化水平無明顯變化。這說明唐古特鐵線蓮皂苷類成分可能主要通過抑制ERK和JNK的磷酸化，從而抑制MAPK信號通路中ERK和JNK途徑的激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們采用免疫熒光染色技術(shù)，觀察ERK和JNK在細(xì)胞內(nèi)的磷酸化水平和定位變化。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁并經(jīng)皂苷類成分處理后，取出蓋玻片。用PBS潤洗蓋玻片2次，然后將蓋玻片浸泡在4%多聚甲醛溶液中，室溫固定15-30分鐘。固定結(jié)束后，用PBS潤洗蓋玻片3次，每次5分鐘。用0.1%TritonX-100溶液處理蓋玻片10分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性。再用PBS潤洗蓋玻片3次，每次5分鐘。將蓋玻片與抗p-ERK或抗p-JNK抗體在37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS潤洗蓋玻片3次，每次5分鐘。然后將蓋玻片與熒光標(biāo)記的二抗在37℃孵育1小時(shí)。再次用PBS潤洗蓋玻片3次，每次5分鐘。最后，用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在對照組中，p-ERK和p-JNK主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號；而在唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理組中，p-ERK和p-JNK的熒光信號明顯減弱，且在細(xì)胞核中的分布減少。這進(jìn)一步證實(shí)了唐古特鐵線蓮皂苷類成分能夠抑制ERK和JNK的磷酸化，并影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位。為了深入研究唐古特鐵線蓮皂苷類成分通過抑制MAPK信號通路抗胃癌的作用機(jī)制，我們分別使用ERK和JNK的特異性抑制劑（如U0126抑制ERK，SP600125抑制JNK）預(yù)處理胃癌細(xì)胞，然后再用唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理。采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用ERK或JNK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，能夠部分抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；當(dāng)與唐古特鐵線蓮皂苷類成分聯(lián)合使用時(shí)，這種抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強(qiáng)。這表明唐古特鐵線蓮皂苷類成分通過抑制MAPK信號通路中ERK和JNK途徑，可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗胃癌作用。5.1.3Wnt/β-catenin信號通路Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，參與細(xì)胞間的黏附連接，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中，β-catenin被由Axin、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等組成的降解復(fù)合物磷酸化，隨后被泛素化降解。當(dāng)Wnt信號通路激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合，抑制降解復(fù)合物的活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移。在胃癌中，Wnt/β-catenin信號通路常常異常激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。為了探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分對Wnt/β-catenin信號通路的影響，我們將處于對數(shù)生長期的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞分別用不同濃度的唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理24小時(shí)。采用Westernblot檢測細(xì)胞中β-catenin、p-GSK-3β（磷酸化GSK-3β）以及Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因c-Myc、CyclinD1的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)步驟與上述檢測其他信號通路蛋白類似，收集細(xì)胞后進(jìn)行裂解、蛋白濃度測定、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育以及顯色曝光等操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理后，胃癌細(xì)胞中β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)下游靶基因c-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平也明顯下降。這表明唐古特鐵線蓮皂苷類成分能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，可能是通過促進(jìn)GSK-3β的活性，使其磷酸化β-catenin，從而加速β-catenin的降解，進(jìn)而抑制下游靶基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們采用免疫組化染色技術(shù)，觀察β-catenin在腫瘤組織中的表達(dá)和定位變化。構(gòu)建胃癌荷瘤小鼠模型，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為對照組和唐古特鐵線蓮皂苷類成分實(shí)驗(yàn)組，給予相應(yīng)處理后，取出腫瘤組織。將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4-5μm。進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟為，切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液處理10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。將切片與抗β-catenin抗體在37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。然后將切片與生物素標(biāo)記的二抗在37℃孵育30分鐘。再次用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，對照組腫瘤組織中β-catenin主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈現(xiàn)較強(qiáng)的棕色信號；而在唐古特鐵線蓮皂苷類成分實(shí)驗(yàn)組中，β-catenin的棕色信號明顯減弱，且在細(xì)胞核中的表達(dá)減少。這進(jìn)一步證實(shí)了唐古特鐵線蓮皂苷類成分能夠抑制β-catenin在腫瘤細(xì)胞中的積累和核轉(zhuǎn)位。為了深入研究唐古特鐵線蓮皂苷類成分通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抗胃癌的作用機(jī)制，我們利用siRNA技術(shù)敲低胃癌細(xì)胞中β-catenin基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)并合成針對β-catenin基因的siRNA，將其轉(zhuǎn)染至SGC-7901和BGC-823細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用不同濃度的唐古特鐵線蓮皂苷類成分處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低β-catenin基因表達(dá)后，唐古特鐵線蓮皂苷類成分對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用明顯增強(qiáng)。這表明Wnt/β-catenin信號通路的激活可能是胃癌細(xì)胞對唐古特鐵線蓮皂苷類成分產(chǎn)生抗性的機(jī)制之一，抑制該信號通路能夠增強(qiáng)唐古特鐵線蓮皂苷類成分的抗胃癌效果。5.2基因表達(dá)譜分析5.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本采集為深入探究唐古特鐵線蓮皂苷類成分抗胃癌的分子機(jī)制，設(shè)計(jì)基因表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)。選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823，將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。對照組加入等體積的DMSO，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（如IC50濃度）的唐古特鐵線蓮皂苷類成分溶液，處理24小時(shí)。在處理過程中，密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保細(xì)胞生長環(huán)境的一致性。處理結(jié)束后，迅速收集細(xì)胞樣本。先用預(yù)冷的PBS潤洗細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后加入適量的Trizol試劑，按照試劑說明書的要求，充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的RNA釋放出來。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，得到含有RNA的裂解液。為了保證樣本的質(zhì)量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。將提取的RNA樣本用核酸定量儀測定其濃度和純度，確保RNA的完整性和質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。一般來說，RNA的OD260/OD280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0，RIN值應(yīng)大于7.0。若RNA的質(zhì)量不符合要求，需重新提取RNA，直至滿足實(shí)驗(yàn)條件。5.2.2基因芯片或RNA-seq技術(shù)分析采用基因芯片技術(shù)或RNA-seq技術(shù)對采集的樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。若選擇基因芯片技術(shù)，將提取的RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后用熒光染料對cDNA進(jìn)行標(biāo)記，如Cy3或Cy5等。將標(biāo)記后的cDNA與基因芯片進(jìn)行雜交，在適宜的溫度和時(shí)間條件下，使cDNA與芯片上的探針充分結(jié)合。雜交結(jié)束后，用洗片液洗去未結(jié)合的cDNA，然后用芯片掃描儀掃描芯片，檢測熒光信號強(qiáng)度。通過分析熒光信號強(qiáng)度，獲取基因的表達(dá)水平信息?；蛐酒夹g(shù)能夠同時(shí)檢測大量基因的表達(dá)情況，具有高通量、快速等優(yōu)點(diǎn)，但也存在檢測范圍有限、靈敏度相對較低等缺點(diǎn)。若采用RNA-seq技術(shù)，首先將提取的RNA進(jìn)行片段化處理，然后以片段化的RNA為模板，合成雙鏈cDNA。對雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和連接測序接頭等操作，構(gòu)建測序文庫。將測序文庫進(jìn)行高通量測序，得到大量的測序讀段。通過生物信息學(xué)分析，將測序讀段比對到人類參考基因組上，計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量。RNA-seq技術(shù)具有檢測范圍廣、靈敏度高、能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和基因變異等優(yōu)點(diǎn)，近年來在基因表達(dá)譜分析中得到了廣泛應(yīng)用。利用相關(guān)的生物信息學(xué)軟件和數(shù)