2025年P(guān)CR培訓(xùn)理論練習(xí)題庫(試題及答案)一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共40分）1.PCR反應(yīng)中，引物的作用是（）A.提供DNA合成的3'-OH末端B.作為模板指導(dǎo)DNA合成C.激活TaqDNA聚合酶活性D.結(jié)合dNTP形成磷酸二酯鍵答案：A2.熒光定量PCR的“Ct值”指的是（）A.擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到平臺(tái)期的循環(huán)數(shù)B.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)C.引物與模板完全結(jié)合的溫度D.反應(yīng)體系中dNTP耗盡的時(shí)間點(diǎn)答案：B3.以下哪種物質(zhì)可抑制TaqDNA聚合酶活性？（）A.牛血清白蛋白（BSA）B.乙二胺四乙酸（EDTA）C.二甲基亞砜（DMSO）D.甘油答案：B4.PCR擴(kuò)增的延伸階段，最適溫度通常為（）A.55-65℃B.70-75℃C.90-95℃D.4℃答案：B5.用于檢測(cè)RNA模板的PCR技術(shù)是（）A.常規(guī)PCRB.多重PCRC.RT-PCRD.巢式PCR答案：C6.引物設(shè)計(jì)時(shí)，避免3'端互補(bǔ)的主要目的是（）A.減少引物二聚體形成B.提高擴(kuò)增效率C.降低退火溫度D.增加產(chǎn)物長度答案：A7.以下哪項(xiàng)不是PCR反應(yīng)體系的基本成分？（）A.模板DNAB.限制性內(nèi)切酶C.dNTPD.TaqDNA聚合酶答案：B8.熒光定量PCR中，SYBRGreenⅠ染料的作用是（）A.特異性結(jié)合目標(biāo)DNA序列B.非特異性插入DNA雙鏈發(fā)出熒光C.標(biāo)記引物用于信號(hào)檢測(cè)D.抑制非特異性擴(kuò)增答案：B9.PCR實(shí)驗(yàn)室中，“污染控制”的核心措施是（）A.增加反應(yīng)體系體積B.嚴(yán)格分區(qū)操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)）C.提高退火溫度D.延長延伸時(shí)間答案：B10.若PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果出現(xiàn)“smearedband（拖尾條帶）”，最可能的原因是（）A.引物濃度過低B.模板濃度過高C.退火溫度過高D.Taq酶量不足答案：B11.內(nèi)參基因（如GAPDH）在PCR中的主要作用是（）A.作為陽性對(duì)照驗(yàn)證反應(yīng)體系有效性B.定量目標(biāo)基因表達(dá)水平（校正模板量差異）C.提高擴(kuò)增特異性D.降低非特異性產(chǎn)物答案：B12.以下哪種方法可用于PCR產(chǎn)物的定量分析？（）A.瓊脂糖凝膠電泳B.紫外分光光度法C.熒光定量PCRD.聚丙烯酰胺凝膠電泳答案：C13.PCR反應(yīng)中，dNTP的最佳濃度范圍通常為（）A.0.01-0.1mMB.0.1-0.5mMC.1-5mMD.5-10mM答案：B14.模板DNA變性的溫度一般為（）A.55℃B.72℃C.94-98℃D.4℃答案：C15.多重PCR的特點(diǎn)是（）A.同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)片段B.僅用于RNA模板檢測(cè)C.必須使用熒光探針D.擴(kuò)增效率高于常規(guī)PCR答案：A16.以下哪種物質(zhì)可用于消除PCR反應(yīng)中的交叉污染？（）A.次氯酸鈉（NaClO）B.乙醇（75%）C.去離子水D.無水乙醇答案：A17.熒光探針法（如TaqMan）相比SYBRGreenⅠ法的優(yōu)勢(shì)是（）A.成本更低B.特異性更高（可區(qū)分同源序列）C.操作更簡單D.無需設(shè)計(jì)引物答案：B18.PCR擴(kuò)增效率（E）的理想范圍是（）A.80%-90%B.90%-110%C.110%-120%D.70%-80%答案：B19.若PCR陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，最可能的原因是（）A.模板濃度過高B.引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤C.交叉污染（如氣溶膠污染）D.延伸時(shí)間不足答案：C20.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于（）A.確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小B.計(jì)算目標(biāo)基因的絕對(duì)或相對(duì)拷貝數(shù)C.驗(yàn)證引物特異性D.檢測(cè)反應(yīng)體系中的抑制劑答案：B二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共30分，少選、錯(cuò)選均不得分）1.引物設(shè)計(jì)的基本原則包括（）A.長度18-25bpB.GC含量40%-60%C.3'端避免連續(xù)G/CD.引物間避免互補(bǔ)（尤其3'端）答案：ABCD2.影響PCR特異性的因素有（）A.退火溫度B.引物濃度C.Taq酶用量D.模板純度答案：ABCD3.PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括（）A.試劑的穩(wěn)定性檢測(cè)B.儀器（如PCR儀、離心機(jī)）的校準(zhǔn)C.樣本的正確采集與保存D.陽性/陰性對(duì)照的設(shè)置答案：ABCD4.熒光定量PCR的應(yīng)用場(chǎng)景包括（）A.基因表達(dá)量分析（如mRNA定量）B.病原體載量檢測(cè)（如病毒拷貝數(shù)）C.基因突變檢測(cè)（如SNP分型）D.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定答案：ABC5.PCR反應(yīng)中，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗的原因有（）A.模板中存在PCR抑制劑（如肝素、血紅蛋白）B.引物與模板不匹配（錯(cuò)配）C.dNTP濃度過低D.退火時(shí)間過短答案：ABCD6.以下屬于PCR污染來源的是（）A.實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的氣溶膠（如前一次擴(kuò)增產(chǎn)物）B.試劑或耗材（如離心管、槍頭）未嚴(yán)格滅菌C.樣本間交叉污染（如移液操作不當(dāng)）D.陽性對(duì)照的過度使用答案：ABCD7.常規(guī)PCR產(chǎn)物分析的方法包括（）A.瓊脂糖凝膠電泳（EB或GoldView染色）B.毛細(xì)管電泳C.測(cè)序驗(yàn)證（如Sanger測(cè)序）D.紫外分光光度法測(cè)濃度答案：ABCD8.關(guān)于TaqDNA聚合酶的描述，正確的是（）A.具有5'→3'聚合酶活性B.缺乏3'→5'外切酶活性（保真性較低）C.最適反應(yīng)溫度72℃D.可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)答案：ABC9.RT-PCR的關(guān)鍵步驟包括（）A.RNA的提?。ㄐ璞苊釸NA酶污染）B.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（需使用反轉(zhuǎn)錄酶）C.以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增D.直接以RNA為模板進(jìn)行PCR答案：ABC10.提高PCR擴(kuò)增效率的方法有（）A.優(yōu)化Mg2+濃度（通常1.5-2.5mM）B.調(diào)整退火溫度（通過梯度PCR確定最佳溫度）C.增加模板量（但需避免過高導(dǎo)致抑制）D.使用熱啟動(dòng)Taq酶（減少非特異性擴(kuò)增）答案：ABCD三、判斷題（每題2分，共20分，正確填“√”，錯(cuò)誤填“×”）1.TaqDNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性，因此保真性高。（）答案：×2.RNA模板需在無RNA酶的環(huán)境中處理，常用DEPC水溶解。（）答案：√3.引物退火溫度（Tm）計(jì)算公式為：Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，適用于長度<20bp的引物。（）答案：√4.內(nèi)參基因應(yīng)選擇在不同樣本中表達(dá)恒定的基因（如ACTB、18SrRNA）。（）答案：√5.dNTP濃度過高會(huì)導(dǎo)致Taq酶活性抑制，并增加非特異性擴(kuò)增。（）答案：√6.SYBRGreenⅠ法只能檢測(cè)單一目標(biāo)基因，而TaqMan探針法可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。（）答案：×（SYBRGreenⅠ法也可通過熔解曲線分析實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，前提是產(chǎn)物Tm值差異顯著）7.PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)“無條帶”可能是由于引物二聚體過多，消耗了反應(yīng)體系成分。（）答案：√8.陰性對(duì)照的作用是驗(yàn)證反應(yīng)體系是否被污染，陽性對(duì)照的作用是驗(yàn)證體系是否有效。（）答案：√9.PCR儀的溫度準(zhǔn)確性無需定期校準(zhǔn)，因?yàn)閮x器出廠時(shí)已達(dá)標(biāo)。（）答案：×（需定期使用溫度校準(zhǔn)儀驗(yàn)證）10.擴(kuò)增效率（E）=10^(-1/斜率)-1，理想斜率為-3.32（對(duì)應(yīng)E=100%）。（）答案：√四、簡答題（每題5分，共25分）1.簡述PCR反應(yīng)的三個(gè)基本步驟及對(duì)應(yīng)的溫度范圍。答案：PCR包括三步：①變性（94-98℃）：雙鏈DNA解鏈為單鏈；②退火（55-65℃）：引物與單鏈模板特異性結(jié)合；③延伸（70-75℃）：Taq酶以dNTP為原料，從引物3'端延伸合成新鏈。2.引物設(shè)計(jì)時(shí)需避免哪些問題？請(qǐng)列舉4項(xiàng)。答案：①引物二聚體（尤其3'端互補(bǔ)）；②發(fā)夾結(jié)構(gòu)（引物自身互補(bǔ)）；③錯(cuò)配（與非目標(biāo)序列結(jié)合）；④GC含量過高（>60%可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合）或過低（<40%影響退火穩(wěn)定性）；⑤3'端避免連續(xù)G/C（可能導(dǎo)致錯(cuò)配）。3.熒光定量PCR中，“相對(duì)定量”與“絕對(duì)定量”的區(qū)別是什么？答案：相對(duì)定量通過內(nèi)參基因校正，比較目標(biāo)基因在不同樣本中的表達(dá)差異（如2^-ΔΔCt法）；絕對(duì)定量需構(gòu)建已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算目標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)（如病毒載量）。4.PCR實(shí)驗(yàn)室為何要嚴(yán)格分區(qū)？請(qǐng)說明各區(qū)域的主要功能。答案：分區(qū)可避免交叉污染（尤其擴(kuò)增產(chǎn)物污染前區(qū)）。四區(qū)功能：①試劑準(zhǔn)備區(qū)：配制PCR反應(yīng)體系（無模板）；②樣本處理區(qū)：提取模板DNA/RNA；③擴(kuò)增區(qū)：進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；④產(chǎn)物分析區(qū)：檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果（如電泳、測(cè)序）。5.簡述非特異性擴(kuò)增（如多條雜帶）的常見原因及解決措施。答案：原因：①退火溫度過低；②引物濃度過高；③Taq酶量過多；④模板純度低（含雜質(zhì)抑制物）；⑤Mg2+濃度過高。解決措施：①提高退火溫度（通過梯度PCR優(yōu)化）；②降低引物濃度；③減少Taq酶用量；④純化模板；⑤降低Mg2+濃度（如從2.5mM降至1.5mM）。五、案例分析題（共25分）案例1（10分）：某實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)（RT-PCR），結(jié)果顯示陽性樣本Ct值均>38（正常范圍為18-35），陰性對(duì)照無擴(kuò)增，陽性對(duì)照Ct=25（正常）。分析可能原因及解決措施。答案：可能原因：①樣本中病毒載量過低（如恢復(fù)期患者或采樣不規(guī)范）；②反轉(zhuǎn)錄效率低（反轉(zhuǎn)錄酶活性下降或反應(yīng)條件不當(dāng)）；③PCR擴(kuò)增體系抑制（如樣本中存在肝素、血紅蛋白等抑制劑）；④引物/探針降解（保存不當(dāng)）。解決措施：①重復(fù)采樣（確保采樣深度）；②優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄條件（如調(diào)整溫度、延長時(shí)間）；③添加BSA或DMSO中和抑制劑；④檢測(cè)引物/探針濃度（紫外分光光度法），重新配制。案例2（8分）：某實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行常規(guī)PCR后，電泳結(jié)果顯示所有樣本（包括陰性對(duì)照）均出現(xiàn)目標(biāo)條帶。分析最可能的污染來源及預(yù)防措施。答案：污染來源：①氣溶膠污染（前一次擴(kuò)增產(chǎn)物形成的微小顆粒殘留于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境）；②試劑污染（如dNTP、引物或水被目標(biāo)DNA污染）；③操作交叉污染（移液槍未更換槍頭、離心管未密封）。預(yù)防措施：①實(shí)驗(yàn)室分區(qū)操作（嚴(yán)格單向流動(dòng)）；②使用帶濾芯槍頭；③