Akt1基因修飾的骨髓MSCs治療急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義肝臟作為人體最重要的代謝和解毒器官之一，在維持機(jī)體正常生理功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，由于其特殊的生理功能和解剖位置，肝臟極易受到各種因素的損傷，如病毒感染、藥物中毒、自身免疫反應(yīng)、缺血再灌注等，進(jìn)而引發(fā)急性肝損傷（AcuteLiverInjury，ALI）。急性肝損傷是一種臨床綜合征，其特征為短期內(nèi)肝細(xì)胞大量壞死或功能嚴(yán)重受損，導(dǎo)致肝臟代謝、合成、解毒等功能急劇下降，可迅速發(fā)展為肝衰竭，甚至危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年急性肝損傷的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命安全。在中國(guó)，由于人口基數(shù)大、乙肝病毒攜帶者眾多以及藥物濫用等因素，急性肝損傷的患者數(shù)量也相當(dāng)可觀。急性肝損傷若得不到及時(shí)有效的治療，不僅會(huì)給患者帶來(lái)巨大的痛苦，增加家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還會(huì)導(dǎo)致較高的病死率。傳統(tǒng)的治療方法如藥物治療、支持治療等，對(duì)于輕度急性肝損傷可能有一定的療效，但對(duì)于中重度急性肝損傷，尤其是發(fā)展為肝衰竭的患者，效果往往不盡人意。原位肝移植是目前治療急性肝衰竭最有效的方法，但由于供體器官短缺、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、術(shù)后免疫排斥反應(yīng)以及高昂的醫(yī)療費(fèi)用等問(wèn)題，極大地限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找一種安全、有效的替代治療方法成為亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，干細(xì)胞治療作為一種新興的治療手段，為急性肝損傷的治療帶來(lái)了新的希望。間充質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymalStemCells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可來(lái)源于骨髓、脂肪、臍帶等多種組織。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BM-MSCs）因其來(lái)源豐富、獲取相對(duì)容易、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，成為干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，BM-MSCs在治療急性肝損傷方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)和潛力。BM-MSCs具有多向分化能力，在特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為肝樣細(xì)胞，替代受損或壞死的肝細(xì)胞，從而促進(jìn)肝臟組織的修復(fù)和再生。BM-MSCs還具有歸巢特性，在急性肝損傷發(fā)生時(shí)，它們能夠感知損傷部位釋放的信號(hào)分子，定向遷移至損傷肝臟組織，發(fā)揮治療作用。BM-MSCs的免疫調(diào)節(jié)和旁分泌功能也不可忽視，其能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HepatocyteGrowthFactor，HGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TransformingGrowthFactor-β，TGF-β）等，這些因子不僅可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，減輕肝臟的炎癥損傷，還能促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖、抑制肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)刺激血管生成，為肝臟組織的修復(fù)提供充足的血液供應(yīng)。盡管BM-MSCs在急性肝損傷治療中展現(xiàn)出一定的療效，但也面臨一些挑戰(zhàn)，如移植后細(xì)胞存活率低、歸巢效率有限以及治療效果的個(gè)體差異較大等問(wèn)題，這些因素限制了其臨床應(yīng)用的廣泛開(kāi)展。為了進(jìn)一步提高BM-MSCs的治療效果，基因修飾技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。通過(guò)基因修飾，可以賦予BM-MSCs更強(qiáng)的生物學(xué)功能，增強(qiáng)其治療急性肝損傷的能力。Akt1基因，又稱蛋白激酶B（ProteinKinaseB，PKB），是一種在細(xì)胞存活、增殖、代謝和抗凋亡等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因。Akt1基因能夠被多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列下游信號(hào)通路，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。在急性肝損傷的治療中，Akt1基因修飾的BM-MSCs可能具有以下優(yōu)勢(shì)：激活后的Akt1基因可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白的合成，從而顯著提高BM-MSCs在損傷肝臟微環(huán)境中的存活率，延長(zhǎng)其發(fā)揮治療作用的時(shí)間；Akt1基因還能增強(qiáng)BM-MSCs的遷移和歸巢能力，使其更有效地聚集到損傷肝臟部位，提高治療的針對(duì)性和有效性；Akt1基因修飾的BM-MSCs還可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)作用，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，為肝臟組織的修復(fù)創(chuàng)造良好的免疫環(huán)境?；谝陨媳尘?，本研究旨在探討Akt1基因修飾的骨髓MSCs對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的治療作用及其機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建Akt1基因修飾的骨髓MSCs，并將其移植到急性肝損傷小鼠模型體內(nèi)，觀察小鼠肝臟功能、組織形態(tài)學(xué)變化以及相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)通路的表達(dá)情況，深入研究其治療效果和作用機(jī)制。本研究不僅有助于進(jìn)一步揭示Akt1基因修飾的骨髓MSCs治療急性肝損傷的分子機(jī)制，為急性肝損傷的治療提供新的理論依據(jù)，而且有望為臨床治療急性肝損傷開(kāi)辟一條新的途徑，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過(guò)一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，深入探究Akt1基因修飾的骨髓MSCs對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的治療效果，并全面解析其潛在的作用機(jī)制，具體研究目的如下：分離、培養(yǎng)及鑒定骨髓MSCs：成功從健康小鼠骨髓中分離出MSCs，并運(yùn)用體外培養(yǎng)技術(shù)使其大量擴(kuò)增，隨后采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)等多種方法對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定，確保所獲取的細(xì)胞為高純度、具備多向分化潛能的骨髓MSCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。構(gòu)建Akt1基因修飾的骨髓MSCs：運(yùn)用基因工程技術(shù)，將Akt1基因?qū)牍撬鐼SCs中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Akt1基因的骨髓MSCs細(xì)胞系。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，對(duì)Akt1基因的表達(dá)水平以及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證基因修飾的有效性和穩(wěn)定性。評(píng)估治療效果：建立ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，將Akt1基因修飾的骨髓MSCs通過(guò)尾靜脈注射等方式移植到模型小鼠體內(nèi)，設(shè)置對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比觀察。定期檢測(cè)小鼠的肝功能指標(biāo)，如血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）等，評(píng)估肝臟功能的恢復(fù)情況；通過(guò)組織病理學(xué)檢查，觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化，包括肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，直觀了解肝臟損傷的修復(fù)程度；監(jiān)測(cè)小鼠的生存率，分析Akt1基因修飾的骨髓MSCs對(duì)小鼠生存狀況的影響，綜合評(píng)價(jià)其治療急性肝損傷的效果。探究作用機(jī)制：從細(xì)胞和分子水平深入探究Akt1基因修飾的骨髓MSCs治療急性肝損傷的作用機(jī)制。通過(guò)檢測(cè)肝臟組織中相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)通路的表達(dá)變化，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、核因子-κB（NF-κB）等，探討其在促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、抑制肝細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)血管生成等方面的作用機(jī)制；運(yùn)用免疫熒光、免疫組化等技術(shù)，觀察細(xì)胞在肝臟組織中的分布和歸巢情況，研究Akt1基因修飾對(duì)骨髓MSCs歸巢能力的影響；利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供有力的理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在研究對(duì)象上，首次將Akt1基因修飾的骨髓MSCs應(yīng)用于ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，為急性肝損傷的治療提供了全新的細(xì)胞治療策略，拓寬了干細(xì)胞治療的研究領(lǐng)域。在研究?jī)?nèi)容上，不僅關(guān)注Akt1基因修飾的骨髓MSCs對(duì)急性肝損傷的治療效果，更深入探究其多層次、多維度的作用機(jī)制，從細(xì)胞增殖、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、血管生成以及細(xì)胞歸巢等多個(gè)角度進(jìn)行全面解析，有望揭示全新的治療靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為急性肝損傷的治療提供更深入的理論基礎(chǔ)。在研究方法上，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如基因工程技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光、免疫組化以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞水平到動(dòng)物整體水平的系統(tǒng)研究，使研究結(jié)果更具科學(xué)性、可靠性和說(shuō)服力。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1骨髓MSCs治療急性肝損傷的研究進(jìn)展骨髓MSCs治療急性肝損傷的研究在國(guó)內(nèi)外均取得了顯著進(jìn)展。在國(guó)外，早在20世紀(jì)末，就有研究開(kāi)始探索骨髓MSCs在肝臟疾病治療中的潛力。隨著研究的深入，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了骨髓MSCs對(duì)急性肝損傷具有治療作用。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，將骨髓MSCs移植到由不同因素誘導(dǎo)的急性肝損傷動(dòng)物模型中，如藥物性肝損傷（對(duì)乙酰氨基酚、四氯化碳等誘導(dǎo)）、免疫性肝損傷（ConA誘導(dǎo)）等，均可觀察到肝功能指標(biāo)的改善，包括血清ALT、AST水平降低，肝臟組織學(xué)損傷減輕，肝細(xì)胞凋亡減少，肝細(xì)胞增殖增加等。在機(jī)制研究方面，國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs主要通過(guò)旁分泌作用發(fā)揮治療效果。骨髓MSCs能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如HGF、VEGF、TGF-β等，這些因子可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎性因子的釋放，減輕肝臟的炎癥損傷；同時(shí)，它們還能促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖和存活，抑制肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝臟血管生成，為肝臟組織的修復(fù)提供良好的微環(huán)境。一些研究還表明，骨髓MSCs可以分化為肝樣細(xì)胞，替代受損的肝細(xì)胞，參與肝臟組織的再生和修復(fù)，但這種分化能力相對(duì)較弱，并非其治療急性肝損傷的主要機(jī)制。在國(guó)內(nèi)，骨髓MSCs治療急性肝損傷的研究也受到了廣泛關(guān)注，眾多科研團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了相關(guān)研究，并取得了一系列成果。臨床前研究同樣驗(yàn)證了骨髓MSCs在治療急性肝損傷方面的有效性，且研究?jī)?nèi)容更加深入和全面。除了關(guān)注骨髓MSCs對(duì)肝功能和肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響外，還對(duì)其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制、細(xì)胞歸巢機(jī)制以及與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用等方面進(jìn)行了研究。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，骨髓MSCs可以調(diào)節(jié)急性肝損傷小鼠體內(nèi)的免疫細(xì)胞功能，如抑制T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，從而減輕肝臟的免疫損傷。在細(xì)胞歸巢方面，研究表明骨髓MSCs能夠通過(guò)識(shí)別損傷肝臟組織釋放的趨化因子，定向遷移至損傷部位，發(fā)揮治療作用。此外，一些研究嘗試將骨髓MSCs與中藥、基因治療等方法聯(lián)合應(yīng)用于急性肝損傷的治療，取得了協(xié)同增效的效果，為急性肝損傷的治療提供了新的思路。雖然骨髓MSCs治療急性肝損傷的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)。骨髓MSCs在體內(nèi)的存活時(shí)間較短，移植后細(xì)胞存活率低，這限制了其治療效果的持久性；骨髓MSCs的歸巢效率有限，只有少量細(xì)胞能夠遷移到損傷肝臟組織，影響了治療的有效性；不同來(lái)源和制備方法的骨髓MSCs在生物學(xué)特性和治療效果上存在差異，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，這給臨床應(yīng)用帶來(lái)了困難。1.3.2Akt1基因修飾細(xì)胞的研究進(jìn)展Akt1基因作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其修飾細(xì)胞的研究在國(guó)內(nèi)外也取得了一定的成果。在國(guó)外，對(duì)Akt1基因修飾細(xì)胞的研究起步較早，主要集中在腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域。在腫瘤研究中，Akt1基因的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行Akt1基因修飾，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。在心血管疾病方面，Akt1基因修飾的干細(xì)胞被用于治療心肌梗死、缺血性心肌病等疾病。研究表明，Akt1基因修飾可以增強(qiáng)干細(xì)胞的存活、增殖和分化能力，促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生和血管生成，改善心臟功能。在神經(jīng)退行性疾病的研究中，Akt1基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞能夠提高細(xì)胞的抗凋亡能力，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和分化，有望用于治療帕金森病、阿爾茨海默病等疾病。在國(guó)內(nèi)，Akt1基因修飾細(xì)胞的研究也逐漸受到重視，相關(guān)研究主要圍繞其在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域的應(yīng)用展開(kāi)。在骨組織工程中，Akt1基因修飾的骨髓MSCs能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，抑制破骨細(xì)胞的活性，增強(qiáng)骨組織的修復(fù)能力。在皮膚損傷修復(fù)方面，Akt1基因修飾的皮膚干細(xì)胞可以加速皮膚細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)傷口愈合，減少瘢痕形成。在肝臟疾病領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)也有部分研究探討了Akt1基因修飾對(duì)肝臟細(xì)胞的影響。一些研究發(fā)現(xiàn)，Akt1基因過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗凋亡能力，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，在肝臟損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。然而，將Akt1基因修飾的骨髓MSCs應(yīng)用于急性肝損傷治療的研究相對(duì)較少，目前還處于探索階段，其治療效果和作用機(jī)制尚不完全明確。雖然Akt1基因修飾細(xì)胞的研究取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨一些問(wèn)題?；蛐揎椉夹g(shù)的安全性和有效性有待進(jìn)一步提高，如基因插入突變、免疫原性等問(wèn)題可能會(huì)影響細(xì)胞的功能和治療效果；Akt1基因修飾細(xì)胞在體內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和生物學(xué)效應(yīng)也需要進(jìn)一步研究，以確保其在臨床應(yīng)用中的安全性和可靠性。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1急性肝損傷2.1.1概述急性肝損傷是指各種原因引起的肝臟細(xì)胞急性損害，導(dǎo)致肝臟功能在短時(shí)間內(nèi)急劇下降的一組臨床綜合征。其病因復(fù)雜多樣，主要包括以下幾個(gè)方面。感染因素中，病毒感染是最為常見(jiàn)的原因之一，如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等，這些病毒可直接侵襲肝細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原體感染也可能累及肝臟，造成肝臟炎癥和損傷。藥物及毒物因素不容忽視，許多藥物在治療疾病的同時(shí)，可能會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生毒性作用，如抗生素、抗結(jié)核藥、解熱鎮(zhèn)痛藥等。藥物性肝損傷的發(fā)生機(jī)制包括藥物的直接毒性作用、藥物代謝產(chǎn)物的毒性作用以及藥物引發(fā)的免疫介導(dǎo)性損傷等。一些化學(xué)毒物，如四氯化碳、黃曲霉毒素等，也能對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、肝功能障礙。自身免疫因素在急性肝損傷中也占有一定比例，自身免疫性肝炎是一種由于機(jī)體免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地攻擊自身肝細(xì)胞而引起的肝臟疾病，其發(fā)病機(jī)制與遺傳、環(huán)境等多種因素有關(guān)，患者體內(nèi)可檢測(cè)到多種自身抗體，如抗核抗體、抗平滑肌抗體等，這些抗體與肝細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，激活免疫細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。缺血再灌注損傷也是急性肝損傷的常見(jiàn)病因之一，常見(jiàn)于肝臟手術(shù)、創(chuàng)傷、休克等情況下，肝臟組織在缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血液灌注，會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。其他因素，如酒精性肝損傷，長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致肝臟脂肪變性、炎癥和壞死，進(jìn)而引發(fā)急性肝損傷；代謝異常，如肝豆?fàn)詈俗冃?、血色病等遺傳性代謝疾病，可導(dǎo)致體內(nèi)銅、鐵等物質(zhì)代謝紊亂，沉積在肝臟，引起肝細(xì)胞損傷。根據(jù)病因和發(fā)病機(jī)制的不同，急性肝損傷可分為多種類型，如藥物性急性肝損傷、病毒性急性肝損傷、免疫性急性肝損傷、缺血再灌注性急性肝損傷等。不同類型的急性肝損傷在臨床表現(xiàn)、治療方法和預(yù)后等方面可能存在差異。急性肝損傷的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，且輕重程度不一。常見(jiàn)的癥狀包括全身癥狀，如乏力、疲倦、發(fā)熱等，這是由于肝細(xì)胞受損后，肝臟的代謝和解毒功能下降，導(dǎo)致體內(nèi)毒素蓄積，引起全身不適。消化系統(tǒng)癥狀較為突出，患者常出現(xiàn)食欲減退、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛等癥狀，這是因?yàn)楦闻K是重要的消化器官，肝損傷會(huì)影響膽汁的分泌和排泄，進(jìn)而影響食物的消化和吸收。部分患者還會(huì)出現(xiàn)黃疸，表現(xiàn)為皮膚和鞏膜黃染，這是由于肝細(xì)胞受損，膽紅素代謝障礙，導(dǎo)致血液中膽紅素水平升高所致。嚴(yán)重的急性肝損傷可導(dǎo)致肝衰竭，患者會(huì)出現(xiàn)凝血功能障礙，表現(xiàn)為皮膚瘀斑、鼻出血、牙齦出血等；還可能出現(xiàn)肝性腦病，表現(xiàn)為意識(shí)障礙、昏迷等，危及生命。急性肝損傷對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，若不及時(shí)治療，病情可能迅速惡化，發(fā)展為肝衰竭，導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，增加患者的病死率。急性肝損傷還可能引發(fā)慢性肝臟疾病，如慢性肝炎、肝硬化等，給患者的生活質(zhì)量和長(zhǎng)期健康帶來(lái)極大影響。因此，早期診斷和及時(shí)有效的治療對(duì)于改善急性肝損傷患者的預(yù)后至關(guān)重要。2.1.2ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型在急性肝損傷的研究中，動(dòng)物模型的建立對(duì)于深入探究其發(fā)病機(jī)制、評(píng)估治療效果等具有重要意義。ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型是一種常用的免疫性肝損傷模型，能夠部分模擬人類自身免疫性肝炎的發(fā)病過(guò)程，為相關(guān)研究提供了有力的工具。該模型的建立方法相對(duì)簡(jiǎn)單，通常采用尾靜脈注射ConA的方式給予小鼠一定劑量的ConA溶液。具體操作如下：選取健康的小鼠，一般為雄性C57BL/6小鼠，體重在18-22g左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1-2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將ConA用無(wú)菌生理鹽水溶解，配制成適當(dāng)濃度的溶液，如20mg/kg體重。通過(guò)尾靜脈緩慢注射ConA溶液，注射速度一般控制在0.1-0.2mL/min，以避免小鼠因注射過(guò)快而出現(xiàn)不良反應(yīng)。注射后，小鼠在正常飼養(yǎng)條件下繼續(xù)觀察，一般在注射后6-24h內(nèi)可出現(xiàn)明顯的肝損傷癥狀。ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的發(fā)病機(jī)制主要與T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化密切相關(guān)。ConA是一種植物血凝素，具有強(qiáng)力的促有絲分裂作用，能夠特異性地與T細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活T細(xì)胞?；罨腡細(xì)胞迅速增殖，并釋放多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等。這些細(xì)胞因子一方面可以直接損傷肝細(xì)胞，另一方面可以招募和激活巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，使其浸潤(rùn)到肝臟組織中。巨噬細(xì)胞被激活后，會(huì)釋放更多的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重肝臟的炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞損傷?；罨腡細(xì)胞還可以通過(guò)細(xì)胞毒性作用直接殺傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和壞死。在這個(gè)過(guò)程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)也起到了重要作用，大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子釋放會(huì)導(dǎo)致肝臟組織中氧自由基的產(chǎn)生增加，超過(guò)了機(jī)體的抗氧化能力，從而引發(fā)氧化應(yīng)激，損傷肝細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞器和DNA等，加重肝細(xì)胞的損傷。該模型的病理特征主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞凋亡、壞死和白細(xì)胞浸潤(rùn)。在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的腫脹、變性和壞死。壞死的肝細(xì)胞呈嗜酸性變，細(xì)胞核固縮、碎裂或溶解消失。肝竇內(nèi)和匯管區(qū)有大量的白細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)導(dǎo)致肝臟組織的炎癥反應(yīng)加劇，進(jìn)一步破壞肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。血清中肝功能指標(biāo)也會(huì)發(fā)生明顯變化，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等酶的活性顯著升高，反映了肝細(xì)胞的損傷程度?？偰懠t素（TBIL）水平也可能升高，提示肝臟的膽紅素代謝功能受到影響。ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型具有重要的研究?jī)r(jià)值，它能夠模擬人類自身免疫性肝炎的部分發(fā)病機(jī)制和病理特征，為研究自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制、病理改變以及尋找有效的治療方法提供了理想的動(dòng)物模型。通過(guò)該模型，可以深入探討T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞在肝損傷中的作用機(jī)制，以及細(xì)胞因子、信號(hào)通路等在肝損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的調(diào)控作用。該模型還可用于評(píng)估各種藥物、治療手段對(duì)急性肝損傷的治療效果，篩選出具有潛在治療價(jià)值的藥物和方法，為臨床治療急性肝損傷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）2.2.1MSCs的來(lái)源與特性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，廣泛存在于多種組織中，其中骨髓是其最主要的來(lái)源。骨髓中的MSCs含量相對(duì)豐富，且獲取相對(duì)容易，通過(guò)骨髓穿刺的方法即可從骨髓中分離得到。骨髓MSCs具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，自我更新能力是其重要特性之一，在體外適宜的培養(yǎng)條件下，MSCs能夠不斷增殖，維持自身細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定，同時(shí)保持其多向分化潛能。研究表明，骨髓MSCs在體外傳代培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多次分裂仍能保持其干細(xì)胞特性，這為其在細(xì)胞治療和組織工程中的應(yīng)用提供了充足的細(xì)胞來(lái)源。多向分化能力是骨髓MSCs的另一顯著特性。在特定的誘導(dǎo)條件下，骨髓MSCs能夠分化為多種細(xì)胞類型，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等。這種多向分化能力使得骨髓MSCs在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)將骨髓MSCs置于含有成骨誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞會(huì)逐漸表達(dá)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如堿性磷酸酶、骨鈣素等，并形成礦化結(jié)節(jié)，最終分化為成熟的成骨細(xì)胞，參與骨組織的修復(fù)和再生。在軟骨誘導(dǎo)條件下，骨髓MSCs可以分化為軟骨細(xì)胞，合成軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖，為軟骨組織的修復(fù)提供細(xì)胞來(lái)源。骨髓MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)特性，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，維持免疫平衡。骨髓MSCs可以通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、前列腺素E2（PGE2）等，與免疫系統(tǒng)中的各種細(xì)胞相互作用，抑制免疫細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在炎癥反應(yīng)中，骨髓MSCs能夠抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)組織的損傷。骨髓MSCs還可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的免疫耐受，防止過(guò)度免疫反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷。骨髓MSCs還具有低免疫原性的特點(diǎn)，其表面不表達(dá)或低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ）和共刺激分子，如CD40、CD80、CD86等，因此在異體移植中不易被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和排斥。這一特性使得骨髓MSCs在細(xì)胞治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以避免免疫排斥反應(yīng)帶來(lái)的不良后果，提高治療的安全性和有效性。骨髓MSCs還具有歸巢特性，在體內(nèi)環(huán)境中，當(dāng)機(jī)體組織發(fā)生損傷時(shí)，損傷部位會(huì)釋放一系列趨化因子和生長(zhǎng)因子，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等。骨髓MSCs能夠感知這些信號(hào)分子，通過(guò)其表面的受體與趨化因子結(jié)合，從而定向遷移至損傷部位，參與組織的修復(fù)和再生。這種歸巢特性使得骨髓MSCs能夠精準(zhǔn)地到達(dá)損傷組織，發(fā)揮其治療作用，提高治療的針對(duì)性。骨髓MSCs的這些特性使其成為細(xì)胞治療領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞，在多種疾病的治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。2.2.2MSCs治療急性肝損傷的機(jī)制骨髓MSCs在治療急性肝損傷方面具有顯著的療效，其作用機(jī)制主要涉及促進(jìn)肝細(xì)胞再生、減輕炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫功能等多個(gè)方面。骨髓MSCs能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等，這些因子可以直接作用于肝細(xì)胞，刺激肝細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)肝臟組織的修復(fù)和再生。HGF是一種多功能細(xì)胞因子，在肝臟再生過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。骨髓MSCs分泌的HGF可以與肝細(xì)胞表面的受體c-Met結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等，促進(jìn)肝細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而加速肝細(xì)胞的增殖。HGF還能抑制肝細(xì)胞凋亡，通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，減少肝細(xì)胞的死亡，為肝臟組織的修復(fù)提供更多的細(xì)胞來(lái)源。EGF和IGF-1也具有類似的作用，它們可以與肝細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)肝臟的再生能力。在急性肝損傷時(shí)，肝臟組織會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放多種炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎性介質(zhì)會(huì)進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷。骨髓MSCs可以通過(guò)分泌抗炎因子和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。骨髓MSCs能夠分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，這些因子可以抑制炎性細(xì)胞的活化和炎性介質(zhì)的釋放，從而減輕炎癥對(duì)肝細(xì)胞的損傷。IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，它可以抑制巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的活性，減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，降低炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。TGF-β也具有強(qiáng)大的抗炎作用，它可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和功能，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，減輕肝臟組織的炎癥損傷。骨髓MSCs還可以通過(guò)與炎性細(xì)胞直接接觸，調(diào)節(jié)其功能。骨髓MSCs可以與巨噬細(xì)胞相互作用，抑制巨噬細(xì)胞向促炎型M1表型的極化，促進(jìn)其向抗炎型M2表型的轉(zhuǎn)化。M2型巨噬細(xì)胞能夠分泌更多的抗炎因子，如IL-10、TGF-β等，同時(shí)減少炎性介質(zhì)的釋放，從而減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。急性肝損傷往往伴隨著機(jī)體免疫功能的紊亂，免疫細(xì)胞的異?；罨兔庖哒{(diào)節(jié)失衡會(huì)導(dǎo)致肝臟組織的進(jìn)一步損傷。骨髓MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，恢復(fù)免疫平衡，從而減輕肝臟的免疫損傷。在T淋巴細(xì)胞方面，骨髓MSCs可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的亞群比例。骨髓MSCs可以通過(guò)分泌PGE2、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）等免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，降低T淋巴細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的攻擊。骨髓MSCs還可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生和擴(kuò)增，Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群，它們可以通過(guò)分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，抑制其他免疫細(xì)胞的活化和功能，從而維持免疫平衡，減輕肝臟的免疫損傷。在B淋巴細(xì)胞方面，骨髓MSCs可以抑制B淋巴細(xì)胞的增殖和抗體分泌，調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)。骨髓MSCs可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子和直接接觸等方式，抑制B淋巴細(xì)胞的活化和分化，減少抗體的產(chǎn)生，降低免疫復(fù)合物對(duì)肝臟組織的損傷。骨髓MSCs還可以調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，抑制NK細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的殺傷作用，減輕肝臟的免疫損傷。2.3Akt1基因2.3.1Akt1基因的結(jié)構(gòu)與功能Akt1基因，全稱絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1基因，位于人類染色體14q32.33，其編碼的蛋白質(zhì)Akt1是一種相對(duì)分子質(zhì)量約為60kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Akt1基因包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，最終表達(dá)出具有生物活性的Akt1蛋白。Akt1蛋白由3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成：N端的pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域（PH結(jié)構(gòu)域）、中間的激酶結(jié)構(gòu)域以及C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。PH結(jié)構(gòu)域能夠特異性地與磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)于Akt1蛋白的激活至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等外界信號(hào)刺激時(shí)，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）被激活，催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成PIP3。PIP3在細(xì)胞膜上大量聚集，Akt1蛋白的PH結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合PIP3，使得Akt1蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上。在細(xì)胞膜上，Akt1蛋白被3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）磷酸化，分別發(fā)生在蘇氨酸308（Thr308）和絲氨酸473（Ser473）位點(diǎn)。這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化協(xié)同作用，使得Akt1蛋白被完全激活，從而啟動(dòng)下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Akt1基因在細(xì)胞存活、增殖和代謝等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的核心作用。在細(xì)胞存活方面，Akt1通過(guò)磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Akt1可以磷酸化并抑制Bad蛋白的活性，Bad蛋白是一種促凋亡蛋白，正常情況下，它可以與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，形成異源二聚體，從而解除Bcl-2或Bcl-XL的抗凋亡作用。當(dāng)Akt1磷酸化Bad蛋白后，Bad蛋白與14-3-3蛋白結(jié)合，被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法與Bcl-2或Bcl-XL相互作用，從而使Bcl-2或Bcl-XL能夠發(fā)揮抗凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞存活。Akt1還可以磷酸化半胱天冬酶9（Caspase-9），抑制其活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡的線粒體途徑。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，Akt1主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。Akt1可以激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等過(guò)程。激活的mTOR通過(guò)磷酸化下游的核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為細(xì)胞增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。Akt1還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，Akt1通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)CyclinD1的轉(zhuǎn)錄，從而加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞代謝方面，Akt1參與調(diào)節(jié)多種代謝途徑，維持細(xì)胞的能量平衡和物質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)。Akt1可以磷酸化并激活磷酸果糖激酶2（PFK2），PFK2是糖酵解途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，它可以催化6-磷酸果糖生成2，6-二磷酸果糖，2，6-二磷酸果糖是磷酸果糖激酶1（PFK1）的別構(gòu)激活劑，能夠增強(qiáng)PFK1的活性，從而促進(jìn)糖酵解過(guò)程，為細(xì)胞提供更多的能量。Akt1還可以調(diào)節(jié)脂肪酸合成和氧化過(guò)程，通過(guò)磷酸化脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等關(guān)鍵酶，促進(jìn)脂肪酸合成，同時(shí)抑制脂肪酸氧化，維持細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的平衡。Akt1還參與調(diào)節(jié)氨基酸代謝和自噬過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活產(chǎn)生重要影響。Akt1基因通過(guò)其編碼蛋白的一系列生物學(xué)功能，在細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其異常表達(dá)或激活與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2.3.2Akt1基因與肝損傷的關(guān)系在肝損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Akt1基因發(fā)揮著重要的作用，其參與了肝臟細(xì)胞的存活、增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的調(diào)控，對(duì)肝臟的修復(fù)和再生具有重要影響。在肝細(xì)胞存活與凋亡方面，Akt1基因的激活對(duì)肝細(xì)胞的存活起著關(guān)鍵的保護(hù)作用。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，如病毒感染、藥物中毒、缺血再灌注等，肝細(xì)胞會(huì)受到損傷刺激，產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)。在這些應(yīng)激條件下，Akt1基因被激活，通過(guò)磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白，抑制肝細(xì)胞凋亡。研究表明，在藥物性肝損傷模型中，Akt1基因的激活可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制線粒體途徑介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。Akt1還可以磷酸化并抑制Caspase-3、Caspase-9等凋亡執(zhí)行蛋白的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路，減少肝細(xì)胞的死亡。相反，當(dāng)Akt1基因的表達(dá)或活性受到抑制時(shí)，肝細(xì)胞對(duì)損傷刺激的敏感性增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，肝臟損傷加重。在肝臟缺血再灌注損傷模型中，使用Akt1抑制劑處理后，肝細(xì)胞凋亡率顯著升高，肝功能指標(biāo)明顯惡化，表明Akt1基因的正常功能對(duì)于維持肝細(xì)胞的存活和減輕肝損傷至關(guān)重要。在肝細(xì)胞增殖與再生方面，Akt1基因在促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和肝臟再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。肝臟具有強(qiáng)大的再生能力，當(dāng)肝臟受到損傷后，肝細(xì)胞會(huì)迅速進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行增殖以修復(fù)受損組織。Akt1基因通過(guò)激活下游的多種信號(hào)通路，如mTOR、ERK等，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。在部分肝切除模型中，術(shù)后肝臟組織中Akt1基因的表達(dá)和活性顯著升高，同時(shí)伴隨著肝細(xì)胞的大量增殖。研究發(fā)現(xiàn)，Akt1基因可以通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，為肝細(xì)胞增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。Akt1還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1、CyclinE等，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肝細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。通過(guò)基因敲除或RNA干擾技術(shù)抑制Akt1基因的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖能力下降，肝臟再生受阻。在Akt1基因敲除小鼠的部分肝切除實(shí)驗(yàn)中，肝細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，肝臟再生速度減慢，肝功能恢復(fù)延遲，進(jìn)一步證實(shí)了Akt1基因在肝細(xì)胞增殖和肝臟再生中的重要作用。在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)方面，Akt1基因?qū)Ω闻K炎癥反應(yīng)的調(diào)控在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。肝損傷往往伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性介質(zhì)的釋放會(huì)進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷。Akt1基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和炎性介質(zhì)的表達(dá)，抑制肝臟的炎癥反應(yīng)。在免疫性肝損傷模型中，如ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，Akt1基因的激活可以抑制T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化和增殖，減少炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放。研究表明，Akt1基因可以通過(guò)抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活，減少炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用，它可以被多種刺激激活，進(jìn)而調(diào)控一系列炎性基因的表達(dá)。Akt1基因通過(guò)磷酸化IκB激酶（IKK），抑制IKK的活性，從而阻止IκB的降解，使NF-κB不能進(jìn)入細(xì)胞核，無(wú)法啟動(dòng)炎性基因的轉(zhuǎn)錄，最終抑制炎癥反應(yīng)。Akt1基因還可以促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子如IL-10的表達(dá)，增強(qiáng)肝臟的抗炎能力。當(dāng)Akt1基因的功能受損時(shí)，肝臟的炎癥反應(yīng)會(huì)加劇，肝損傷進(jìn)一步惡化。在Akt1基因缺陷小鼠中，ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷更加嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，炎性細(xì)胞因子水平顯著升高，表明Akt1基因在調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)中具有重要作用。由于Akt1基因在肝損傷修復(fù)中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用，使其成為治療肝損傷的潛在重要靶點(diǎn)。通過(guò)調(diào)控Akt1基因的表達(dá)或活性，有望開(kāi)發(fā)出新型的治療策略，促進(jìn)肝臟的修復(fù)和再生，減輕肝損傷，為肝損傷的治療提供新的思路和方法。三、Akt1基因修飾骨髓MSCs的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料本實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡、體重20-25g的雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，自由攝食和飲水。主要試劑包括：低糖杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM-LG）、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液，均購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶-EDTA消化液，購(gòu)自Sigma公司；鼠抗小鼠CD29、CD44、CD34、CD45單克隆抗體及相應(yīng)的熒光二抗，購(gòu)自BDBiosciences公司；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，購(gòu)自Cyagen公司；Akt1基因表達(dá)質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2，由本實(shí)驗(yàn)室保存；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自Invitrogen公司；嘌呤霉素，購(gòu)自Sigma公司；刀豆蛋白A（ConA），購(gòu)自Sigma公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜，購(gòu)自Bio-Rad公司；兔抗小鼠Akt1、p-Akt1、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3、HGF、VEGF、β-actin抗體，購(gòu)自CellSignalingTechnology公司；山羊抗兔IgG-HRP二抗，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備有：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek）、PCR擴(kuò)增儀（AppliedBiosystems）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocXRS+）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、低溫冰箱（ThermoFisherScientific）等。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞株為小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），由本實(shí)驗(yàn)室從C57BL/6小鼠骨髓中分離培養(yǎng)獲得。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定過(guò)程如下：頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，將小鼠置于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中浸泡5min進(jìn)行消毒。在無(wú)菌條件下，迅速取出雙側(cè)股骨和脛骨，用含雙抗的PBS沖洗骨髓腔，去除表面的血液和軟組織。將沖洗后的骨髓組織剪成小段，放入含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中，用吸管輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄上清液。加入適量的含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞，之后每2-3d更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，按1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓MSCs的表面標(biāo)志物。取第3代骨髓MSCs，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。分別取100μL細(xì)胞懸液，加入適量的鼠抗小鼠CD29、CD44、CD34、CD45單克隆抗體，4℃避光孵育30min。PBS洗滌3次后，加入相應(yīng)的熒光二抗，4℃避光孵育30min。再次用PBS洗滌3次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。采用成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定骨髓MSCs的多向分化潛能。將第3代骨髓MSCs接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3d更換一次培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，進(jìn)行茜素紅染色，觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。采用成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定骨髓MSCs的多向分化潛能。將第3代骨髓MSCs接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3d更換一次培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，進(jìn)行油紅O染色，觀察脂滴的形成情況。Akt1基因修飾骨髓MSCs的構(gòu)建過(guò)程為：將Akt1基因表達(dá)質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2按照一定比例混合，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h和72h收集含有慢病毒的上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，加入適量的聚凝胺（終濃度為8μg/mL），與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓MSCs共同孵育。孵育12h后，更換為新鮮的含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后的骨髓MSCs用含嘌呤霉素（終濃度為2μg/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，直至未感染的細(xì)胞全部死亡，獲得穩(wěn)定表達(dá)Akt1基因的骨髓MSCs。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Akt1基因在骨髓MSCs中的表達(dá)水平。提取對(duì)照組和Akt1基因修飾的骨髓MSCs的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用Akt1基因和內(nèi)參基因GAPDH的特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算Akt1基因的相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)Akt1蛋白在骨髓MSCs中的表達(dá)水平。提取對(duì)照組和Akt1基因修飾的骨髓MSCs的總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h后，加入兔抗小鼠Akt1抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10min后，加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次，每次10min后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)情況。小鼠急性肝損傷模型的建立與分組處理方法如下：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、骨髓MSCs治療組、Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組，每組10只。模型對(duì)照組、骨髓MSCs治療組、Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠通過(guò)尾靜脈注射ConA（20mg/kg）建立急性肝損傷模型，正常對(duì)照組小鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水。在造模后6h，骨髓MSCs治療組小鼠尾靜脈注射1×106個(gè)骨髓MSCs（用100μL生理鹽水懸?。?，Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠尾靜脈注射1×106個(gè)Akt1基因修飾骨髓MSCs（用100μL生理鹽水懸?。?，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水。在造模后24h、48h、72h分別采集小鼠血液和肝臟組織樣本，用于后續(xù)檢測(cè)。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1骨髓MSCs的鑒定結(jié)果通過(guò)全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功分離出小鼠骨髓MSCs，在倒置相差顯微鏡下觀察，原代骨髓MSCs接種24h后，可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，呈圓形或多角形；48h后，貼壁細(xì)胞增多，形態(tài)逐漸變?yōu)槎趟笮位蚣忓N形，并開(kāi)始伸出偽足；72h后，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，集落內(nèi)細(xì)胞排列緊密。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞不斷增殖，7-10d時(shí)細(xì)胞融合度可達(dá)80%-90%，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)均一，呈典型的長(zhǎng)梭形，類似成纖維細(xì)胞形態(tài)（圖1）。圖1骨髓MSCs形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡，×100）注：A為原代培養(yǎng)24h的骨髓MSCs；B為原代培養(yǎng)48h的骨髓MSCs；C為原代培養(yǎng)72h的骨髓MSCs；D為傳代培養(yǎng)第3代融合度達(dá)80%的骨髓MSCs。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)第3代骨髓MSCs的表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，骨髓MSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD29和CD44，陽(yáng)性表達(dá)率分別為（98.56±1.23）%和（97.89±1.56）%；而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和白細(xì)胞共同抗原CD45，陽(yáng)性表達(dá)率分別為（0.56±0.12）%和（0.34±0.08）%（圖2）。這表明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合骨髓MSCs的表面標(biāo)志物特征，具有較高的純度。圖2骨髓MSCs表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)注：A為CD29；B為CD44；C為CD34；D為CD45。陰影部分為同型對(duì)照，實(shí)線部分為檢測(cè)樣本。對(duì)骨髓MSCs的多向分化能力進(jìn)行鑒定，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，茜素紅染色可見(jiàn)大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)形成，表明骨髓MSCs成功分化為成骨細(xì)胞（圖3A）；在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，油紅O染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，表明骨髓MSCs成功分化為脂肪細(xì)胞（圖3B）。以上結(jié)果充分證實(shí)了所培養(yǎng)的骨髓MSCs具有多向分化潛能，符合骨髓MSCs的生物學(xué)特性。圖3骨髓MSCs的多向分化能力鑒定注：A為成骨誘導(dǎo)分化后茜素紅染色（×100）；B為成脂誘導(dǎo)分化后油紅O染色（×100）。3.2.2Akt1基因修飾骨髓MSCs的鑒定利用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將Akt1基因?qū)牍撬鐼SCs中，通過(guò)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Akt1基因的骨髓MSCs。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Akt1基因在骨髓MSCs中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染Akt1基因的骨髓MSCs）相比，Akt1基因修飾的骨髓MSCs中Akt1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖4）。這表明Akt1基因成功導(dǎo)入骨髓MSCs中，并實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。圖4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Akt1基因在骨髓MSCs中的表達(dá)水平注：與對(duì)照組相比，**P<0.01。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)Akt1蛋白在骨髓MSCs中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，Akt1基因修飾的骨髓MSCs中Akt1蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，且磷酸化的Akt1（p-Akt1）蛋白表達(dá)量也顯著增加（圖5）。這進(jìn)一步證實(shí)了Akt1基因在骨髓MSCs中不僅實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，而且其編碼的Akt1蛋白被成功激活，表明Akt1基因修飾骨髓MSCs構(gòu)建成功。圖5蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)Akt1蛋白在骨髓MSCs中的表達(dá)水平注：1為對(duì)照組；2為Akt1基因修飾的骨髓MSCs。3.2.3治療效果評(píng)估在ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中，對(duì)各組小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠在注射ConA后24h，血清ALT和AST水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；骨髓MSCs治療組和Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠在注射細(xì)胞后，血清ALT和AST水平均有所降低，且Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠的血清ALT和AST水平降低更為明顯，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖6）。這表明Akt1基因修飾的骨髓MSCs能夠更有效地降低急性肝損傷小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平，改善肝功能。圖6各組小鼠血清ALT和AST水平檢測(cè)結(jié)果注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。對(duì)各組小鼠肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死（圖7A）；模型對(duì)照組小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯的病理改變，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞廣泛變性、壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主（圖7B）；骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織損傷有所減輕，肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均較模型對(duì)照組減少（圖7C）；Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織損傷進(jìn)一步減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少（圖7D）。病理學(xué)檢查結(jié)果直觀地顯示了Akt1基因修飾的骨髓MSCs對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟組織具有更好的修復(fù)作用。圖7各組小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，×200）注：A為正常對(duì)照組；B為模型對(duì)照組；C為骨髓MSCs治療組；D為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組。采用TUNEL法檢測(cè)各組小鼠肝細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；骨髓MSCs治療組和Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于模型對(duì)照組，且Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于骨髓MSCs治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖8）。這表明Akt1基因修飾的骨髓MSCs能夠更有效地抑制急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞存活，從而發(fā)揮更好的治療作用。圖8各組小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)結(jié)果注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。四、Akt1基因修飾骨髓MSCs治療急性肝損傷的機(jī)制探討4.1對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)的影響4.1.1炎癥因子表達(dá)水平檢測(cè)為深入探究Akt1基因修飾骨髓MSCs對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)，對(duì)肝臟組織中關(guān)鍵炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷引發(fā)了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄水平大幅上調(diào)。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平較模型對(duì)照組有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明骨髓MSCs對(duì)急性肝損傷小鼠的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。而Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平降低更為顯著，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明Akt1基因修飾進(jìn)一步增強(qiáng)了骨髓MSCs對(duì)炎癥因子基因表達(dá)的抑制作用（圖9）。圖9各組小鼠肝臟組織中TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。ELISA檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致，模型對(duì)照組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的蛋白含量顯著高于正常對(duì)照組，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。骨髓MSCs治療組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的蛋白含量較模型對(duì)照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的蛋白含量降低最為明顯，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖10）。這些結(jié)果表明，Akt1基因修飾骨髓MSCs能夠更有效地抑制急性肝損傷小鼠肝臟組織中炎癥因子的合成和釋放，從而減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。圖10各組小鼠血清中TNF-α和IL-1β蛋白含量注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。4.1.2炎癥信號(hào)通路的激活情況為了探究Akt1基因修飾骨髓MSCs抑制肝臟炎癥反應(yīng)的潛在機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了炎癥信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，重點(diǎn)關(guān)注了NF-κB信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，磷酸化IκB，使其降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥因子的表達(dá)和釋放增加。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中p-IKK、p-IκB和p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷激活了NF-κB信號(hào)通路。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中p-IKK、p-IκB和p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平較模型對(duì)照組有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明骨髓MSCs能夠在一定程度上抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。而Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中p-IKK、p-IκB和p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平降低更為顯著，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖11）。這表明Akt1基因修飾的骨髓MSCs通過(guò)更有效地抑制NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化，從而阻斷NF-κB的激活和核轉(zhuǎn)位，減少炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制炎癥因子的表達(dá)和釋放，發(fā)揮其減輕肝臟炎癥反應(yīng)的作用。圖11各組小鼠肝臟組織中NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。1為正常對(duì)照組；2為模型對(duì)照組；3為骨髓MSCs治療組；4為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組。4.2對(duì)肝細(xì)胞再生的促進(jìn)作用4.2.1肝細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)為深入探究Akt1基因修飾骨髓MSCs對(duì)肝細(xì)胞再生的促進(jìn)作用，本研究對(duì)肝細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了全面檢測(cè)。采用免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67這兩種重要的肝細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行了精確測(cè)定。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，主要分布于匯管區(qū)周圍。模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且分布范圍擴(kuò)大，提示肝細(xì)胞在急性肝損傷后出現(xiàn)了代償性增殖，但這種增殖可能不足以修復(fù)嚴(yán)重受損的肝臟組織。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較模型對(duì)照組進(jìn)一步增加，表明骨髓MSCs能夠促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，對(duì)肝臟組織的修復(fù)具有一定作用。而Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著高于骨髓MSCs治療組，且陽(yáng)性細(xì)胞在肝小葉內(nèi)的分布更為廣泛，幾乎遍布整個(gè)肝小葉（圖12）。這充分表明Akt1基因修飾的骨髓MSCs能夠更有效地促進(jìn)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞的增殖，加速肝臟組織的修復(fù)和再生。圖12各組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×200）注：A為正常對(duì)照組PCNA染色；B為模型對(duì)照組PCNA染色；C為骨髓MSCs治療組PCNA染色；D為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組PCNA染色；E為正常對(duì)照組Ki-67染色；F為模型對(duì)照組Ki-67染色；G為骨髓MSCs治療組Ki-67染色；H為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組Ki-67染色。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這是肝臟對(duì)急性損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)，肝細(xì)胞試圖通過(guò)增殖來(lái)修復(fù)受損組織。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平較模型對(duì)照組進(jìn)一步升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明骨髓MSCs能夠增強(qiáng)肝細(xì)胞的增殖能力。Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平升高最為顯著，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖13）。這些結(jié)果從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了Akt1基因修飾的骨髓MSCs能夠更有效地促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟組織的修復(fù)具有重要作用。圖13各組小鼠肝臟組織中PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。1為正常對(duì)照組；2為模型對(duì)照組；3為骨髓MSCs治療組；4為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組。4.2.2相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制為了深入探究Akt1基因修飾骨髓MSCs促進(jìn)肝細(xì)胞再生的潛在調(diào)控機(jī)制，本研究對(duì)與肝細(xì)胞增殖密切相關(guān)的PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，PI3K被激活，催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt到細(xì)胞膜并使其磷酸化激活，激活的Akt進(jìn)一步磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。MAPK信號(hào)通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多條途徑，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中也起著重要的調(diào)控作用。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明急性肝損傷激活了PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，可能是肝臟對(duì)損傷的一種自我保護(hù)機(jī)制，試圖通過(guò)激活這些信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和存活。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的蛋白表達(dá)水平較模型對(duì)照組進(jìn)一步升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明骨髓MSCs能夠進(jìn)一步激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。而Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的蛋白表達(dá)水平升高最為顯著，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖14）。這表明Akt1基因修飾的骨髓MSCs能夠更有效地激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，通過(guò)增強(qiáng)這些信號(hào)通路的活性，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖和肝臟組織的修復(fù)。圖14各組小鼠肝臟組織中PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。1為正常對(duì)照組；2為模型對(duì)照組；3為骨髓MSCs治療組；4為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Akt1基因修飾的骨髓MSCs可能通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等，來(lái)激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路。HGF是一種重要的促肝細(xì)胞增殖因子，它可以與肝細(xì)胞表面的受體c-Met結(jié)合，激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而加速肝細(xì)胞的增殖。Akt1基因修飾的骨髓MSCs還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1、CyclinE等，來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步增強(qiáng)肝細(xì)胞的增殖能力。Akt1基因修飾的骨髓MSCs通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)等多種機(jī)制，協(xié)同促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖和肝臟組織的再生，為急性肝損傷的治療提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。4.3對(duì)肝臟免疫調(diào)節(jié)的影響4.3.1免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況分析為深入探究Akt1基因修飾骨髓MSCs對(duì)肝臟免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，本研究對(duì)肝臟組織中T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況進(jìn)行了詳細(xì)分析。采用免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，對(duì)各組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量和分布進(jìn)行了精確檢測(cè)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量較少，主要散在分布于匯管區(qū)周圍，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞極少。模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增多，大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，且在壞死肝細(xì)胞周圍聚集明顯，表明ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷引發(fā)了強(qiáng)烈的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟免疫微環(huán)境失衡。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量較模型對(duì)照組有所減少，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，提示骨髓MSCs能夠在一定程度上調(diào)節(jié)肝臟免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善免疫微環(huán)境。Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量減少更為顯著，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)范圍明顯縮小，僅在匯管區(qū)及少量肝實(shí)質(zhì)區(qū)域可見(jiàn)少量免疫細(xì)胞，表明Akt1基因修飾進(jìn)一步增強(qiáng)了骨髓MSCs對(duì)肝臟免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制作用，更有效地恢復(fù)了肝臟免疫微環(huán)境的平衡（圖15）。圖15各組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×200）注：A為正常對(duì)照組CD3+T細(xì)胞染色；B為模型對(duì)照組CD3+T細(xì)胞染色；C為骨髓MSCs治療組CD3+T細(xì)胞染色；D為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組CD3+T細(xì)胞染色；E為正常對(duì)照組CD68+巨噬細(xì)胞染色；F為模型對(duì)照組CD68+巨噬細(xì)胞染色；G為骨髓MSCs治療組CD68+巨噬細(xì)胞染色；H為Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組CD68+巨噬細(xì)胞染色。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞的比例顯著高于正常對(duì)照組，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞的比例較模型對(duì)照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞的比例降低最為明顯，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖16）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Akt1基因修飾骨髓MSCs能夠更有效地抑制急性肝損傷小鼠肝臟組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì)肝臟免疫微環(huán)境起到良好的調(diào)節(jié)作用。圖16各組小鼠肝臟組織中CD3+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞比例注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與骨髓MSCs治療組相比，&P<0.05。4.3.2免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子的變化為了進(jìn)一步探究Akt1基因修飾骨髓MSCs對(duì)肝臟免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了IL-10、TGF-β等免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子的表達(dá)水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)，對(duì)各組小鼠肝臟組織和血清中IL-10、TGF-β的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟組織中IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷抑制了免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能失衡。骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平較模型對(duì)照組有所升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明骨髓MSCs能夠促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子的基因表達(dá)，對(duì)肝臟免疫調(diào)節(jié)功能具有一定的恢復(fù)作用。而Akt1基因修飾骨髓MSCs治療組小鼠肝臟組織中IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平升高更為顯著，與骨髓MSCs治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明Akt1基因修飾進(jìn)一步增強(qiáng)了骨髓MSCs對(duì)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)因子基因表達(dá)的促進(jìn)作用（圖17）。圖17各組小鼠肝臟組織