15DetectionofEscherichiacoliO157:H7/NMinanimalbedding2021-01-25發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定I動(dòng)物墊料中大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢測(cè)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格GB/T33682基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能用于吸收動(dòng)物排泄物，使動(dòng)物保持舒適生活環(huán)境4設(shè)備和材料4.1設(shè)備和材料4.3均質(zhì)器。4.4振蕩器。4.6全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。4.7全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。4.8酶聯(lián)免疫分析儀。4.9二級(jí)生物安全柜。4.11生物顯微鏡。14.12微量移液器。4.15無(wú)菌培養(yǎng)皿：15mm×904.19無(wú)菌勺。4.21無(wú)菌接種環(huán)。5.7月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（5.12生化鑒定試劑盒。5.13革蘭氏陰性菌生化鑒定卡。5.14飛行質(zhì)譜儀靶板。2MUG-LST3應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。取樣過(guò)程遵循無(wú)菌操作程序，防止一切可能的外來(lái)對(duì)送檢樣品包裝內(nèi)不同部位樣品進(jìn)行隨機(jī)多點(diǎn)取樣至少250g，充分混勻后稱取25g顆粒狀或粉末狀墊料樣品，加入225mLmEC+n肉湯，充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，無(wú)菌操作將滅菌規(guī)格板（5cmi5cm）放在平面墊料表面，用浸有無(wú)菌稀釋液（磷酸緩沖液或生理鹽水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來(lái)回均勻涂抹整個(gè)方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去復(fù)取樣1～4個(gè)規(guī)格板面積，相應(yīng)地將棉拭子頭置入25mL～100mL的無(wú)菌稀釋液中，充分振搖制成樣品原液（1mL原液對(duì)應(yīng)的樣品面積為1cm2），取樣量見(jiàn)表1。取25mL樣品原液加入225mLmEC+n肉湯，充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～241234分別用接種環(huán)取增菌的mEC+n肉湯增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)CT-SMAC平板和一個(gè)大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24步判定典型和可疑菌落，大腸埃希氏菌O157在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征見(jiàn)表菌落為圓形、光滑、較小的無(wú)色菌落，中心呈4挑取純培養(yǎng)的菌落進(jìn)行大腸埃希氏菌O157生化鑒定，在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上分別挑取5～10個(gè)可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時(shí)接種MUG-LST肉湯，并用大腸埃希氏菌株(ATCC在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察（MUG陽(yáng)性的大腸埃希氏菌株應(yīng)有熒光產(chǎn)生，MUG陰性的應(yīng)無(wú)熒光產(chǎn)生），H7因子血清不凝集者，應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續(xù)傳代3次。若動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果為陰性，則確定為無(wú)動(dòng)力菌株。綜合生化鑒定結(jié)果、輔助鑒定結(jié)果和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25g（cm2）動(dòng)9生物安全措施檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少305A.1培養(yǎng)基制備及質(zhì)量保證A.2.1成分NaCLA.2.2制法除新生霉素外，所有成分溶解在水中，加熱煮沸，在20℃~25℃下調(diào)節(jié)pH至6.9±0.1，分裝。于121℃高壓滅菌15min，備用。制備濃度為20mg/mL的新生霉素儲(chǔ)備溶液，過(guò)濾法除菌。待培養(yǎng)基溫度冷至50℃以下時(shí)，按1000mL培養(yǎng)基內(nèi)加1mL新生霉素儲(chǔ)備液，使最A(yù).3改良山梨醇麥康凱(CT-SMAC)瓊脂A.3.1山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂A.3.1.1成分A.3.1.2制法除瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅外，所有成分溶解在蒸餾水中，加熱煮沸，在20℃~25℃下調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,加入瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅,煮沸溶解，分裝A.3.2亞碲酸鉀溶液A.3.2.1成分6gA.3.2.2制法A.3.3頭孢克肟(Cefixime)溶液A.3.3.1成分A.3.3.2制法1年。解凍后的頭孢克肟溶液不應(yīng)再凍存，且在2℃~8℃下有效期14d。取1000mL滅菌融化并冷卻至46℃±1℃的山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂，加入1mL亞碲酸鉀溶液和10mL頭孢克肟溶液，使亞碲酸鉀濃度達(dá)到2.5mg/L，頭A.4三糖鐵瓊脂(TSI)A.4.1成分硫酸亞鐵銨[(NH4)2Fe(SO4)2A.4.2制法除酚紅和瓊脂外,將其他成分加于400mL蒸餾水中，煮沸溶解，在20℃~25℃下調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2。即使用，在2℃~8℃條件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。A.5.1成分7A.5.2制法A.6半固體瓊脂A.6.1成分A.6.2制法將各成分溶解于蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝小試管，于121℃高壓A.7.1成分0.1g4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(A.7.2制法將各成分溶解于蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，于20℃~25℃下調(diào)節(jié)pH至6.8±0倒管的試管中，每管10mL，于121℃高壓滅菌A.8氧化酶試劑A.8.1蛋白胨水A.8.1.1成分N，N'-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽8A.8.1.2制法A.8.2試驗(yàn)方法A.9革蘭氏染色液A.9.1結(jié)晶紫染色液A.9.1.1成分A.9.1.2制法A.9.2革蘭氏碘液A.9.2.1成分碘A.9.2