HIV實驗室檢測操作規(guī)程及指導一、概述1.1HIV實驗室檢測的重要性HIV實驗室檢測是艾滋病防控的核心環(huán)節(jié)，其結(jié)果直接影響感染診斷、治療啟動、疫情監(jiān)測及預防干預的有效性。準確的檢測能早期發(fā)現(xiàn)感染者，降低傳播風險；規(guī)范的操作能避免假陽性/假陰性結(jié)果，保護受檢者權(quán)益。1.2基本原則HIV檢測需遵循以下核心原則：生物安全優(yōu)先：嚴格執(zhí)行《病原微生物實驗室生物安全管理條例》，防止樣本污染、人員暴露及交叉感染。質(zhì)量控制貫穿全程：通過室內(nèi)質(zhì)控（IQC）、室間質(zhì)評（EQA）及標準化操作（SOP）保證結(jié)果準確性。標準化與規(guī)范化：操作流程需符合《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準》（GB____）、《HIV檢測技術(shù)規(guī)范》（2020版）等國家指南。隱私保護：嚴格保密受檢者信息，避免信息泄露。二、檢測前準備2.1樣本采集HIV檢測樣本主要包括血液、唾液、尿液，需根據(jù)檢測目的選擇合適類型（見表1）。樣本類型適用場景采集要求靜脈全血常規(guī)篩查/確認試驗使用EDTA-K?抗凝管，采集2-5mL，避免溶血、凝固；采集后24小時內(nèi)分離血漿/血清。末梢血快速檢測（基層/現(xiàn)場）用一次性采血針采集指端血，滴入檢測卡指定區(qū)域，避免擠壓過度導致溶血。唾液無創(chuàng)篩查（如孕產(chǎn)婦）使用專用唾液采集器，讓受檢者將采集棉棒在口腔內(nèi)壁來回擦拭1分鐘，放入保存液中；避免食物/飲料殘留。尿液替代樣本（如兒童）采集中段尿5-10mL，使用無菌容器；避免尿液污染（如混入糞便、陰道分泌物）。注意：樣本采集前需確認受檢者信息（姓名、性別、年齡、身份證號后四位），并標注采集時間、樣本類型。2.2樣本運輸與接收2.2.1運輸要求溫度控制：全血/血漿樣本需2-8℃冷藏運輸（如使用冰袋）；唾液/尿液樣本可常溫運輸（≤30℃）。包裝規(guī)范：樣本放入密封袋（貼“生物危害”標識），再放入硬質(zhì)容器（如泡沫箱），避免震蕩。運輸時限：全血樣本需在采集后48小時內(nèi)送達實驗室；血漿/血清樣本可在-20℃保存1個月，-70℃保存3個月。2.2.2接收流程核對信息：檢查樣本標識（姓名、編號、樣本類型）與申請單是否一致；確認樣本未破損、無泄漏。檢查質(zhì)量：全血樣本需無溶血、凝固；唾液/尿液樣本需無渾濁、沉淀。登記記錄：將樣本信息錄入實驗室信息系統(tǒng)（LIS），包括采集時間、運輸時間、接收時間、樣本狀態(tài)。不合格樣本處理：若樣本存在溶血、凝固、標識不清等問題，需立即聯(lián)系采集機構(gòu)，要求重新采集；并記錄不合格原因及處理結(jié)果。2.3試劑與設備準備2.3.1試劑管理試劑選擇：使用經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準的HIV檢測試劑（如ELISA試劑盒、快速檢測卡），優(yōu)先選擇靈敏度≥99%、特異性≥98%的產(chǎn)品。試劑保存：ELISA試劑需2-8℃冷藏（避免凍結(jié)）；快速檢測試劑需常溫保存（≤30℃），避免陽光直射。試劑檢查：使用前核對試劑批號、有效期，確認試劑無變質(zhì)（如ELISA包被板有裂紋、酶結(jié)合物有沉淀）。2.3.2設備準備核心設備：酶標儀（波長準確性±2nm）、洗板機（每孔殘留液≤2μL）、離心機（轉(zhuǎn)速≥3000rpm）、生物安全柜（二級及以上）。設備檢查：檢測前啟動設備，確認性能正常（如酶標儀的空白吸光度≤0.1，洗板機的洗滌壓力穩(wěn)定）；校準證書需在有效期內(nèi)。2.4人員與環(huán)境準備人員要求：檢測人員需具備醫(yī)學檢驗專業(yè)背景，經(jīng)HIV檢測培訓并考核合格；操作前需穿戴個人防護裝備（PPE）：手套、口罩、實驗服、護目鏡（必要時）。環(huán)境要求：實驗室需劃分清潔區(qū)、半污染區(qū)、污染區(qū)；檢測前用含氯消毒液（500mg/L）擦拭臺面，紫外線照射空氣30分鐘。三、檢測中操作規(guī)程3.1篩查試驗篩查試驗是HIV檢測的第一步，目的是排除未感染者，常用方法包括ELISA、化學發(fā)光法（CLIA）、快速檢測法（RT）。3.1.1ELISA法（酶聯(lián)免疫吸附試驗）操作步驟：1.加樣：將待檢樣本、陽性對照、陰性對照各100μL加入包被板對應孔（避免交叉污染）。2.孵育：37℃恒溫箱孵育60分鐘（或按試劑說明書調(diào)整）。3.洗滌：用洗板機洗滌5次，每次浸泡30秒（確保孔內(nèi)無殘留液體）。4.加酶結(jié)合物：每孔加100μL酶標記抗體（如HRP標記的抗HIVIgG），37℃孵育30分鐘。5.再洗滌：重復步驟3。6.加底物：每孔加100μL底物液（如TMB），37℃避光孵育15分鐘。7.終止反應：每孔加50μL終止液（如H?SO?），輕輕震蕩混勻。8.讀值：酶標儀在450nm波長（參考波長630nm）讀取吸光度（OD值）。結(jié)果判斷：計算Cutoff值（CO）：CO=陰性對照平均OD值×2.1（或按試劑說明書）。結(jié)果判定：待檢樣本OD值≥CO為篩查陽性；OD值<CO為篩查陰性。注意：若陰性對照OD值異常（如>0.2），需重新檢測。3.1.2化學發(fā)光法（CLIA）操作步驟：1.樣本加載：將待檢樣本、質(zhì)控品加入反應杯，放入化學發(fā)光儀。2.自動檢測：儀器自動完成加樣、孵育（37℃，20分鐘）、洗滌、加發(fā)光底物（如魯米諾）等步驟。3.結(jié)果讀取：儀器直接輸出樣本的發(fā)光強度（RLU），并與Cutoff值比較。優(yōu)勢：自動化程度高，減少人為誤差；靈敏度優(yōu)于ELISA（可檢測早期感染）。3.1.3快速檢測法（RT）適用場景：基層實驗室、現(xiàn)場檢測（如VCT門診、孕產(chǎn)婦篩查）。操作步驟（以膠體金法為例）：1.加樣：將待檢樣本（末梢血/唾液/尿液）滴入檢測卡的加樣孔（按試劑說明書要求的量，如2-3滴）。2.反應：室溫（15-30℃）放置15-20分鐘（避免潮濕環(huán)境）。3.結(jié)果判斷：陽性：檢測線（T）與質(zhì)控線（C）均出現(xiàn)紅色條帶；陰性：僅質(zhì)控線（C）出現(xiàn)紅色條帶；無效：質(zhì)控線（C）未出現(xiàn)條帶（需重新檢測）。注意：快速檢測結(jié)果需由2名工作人員核對，避免誤判。3.2確認試驗篩查陽性的樣本需進行確認試驗，以明確感染狀態(tài)。常用方法為Westernblot（WB）和免疫熒光法（IFA）。3.2.1Westernblot（蛋白印跡法）操作步驟：1.樣本處理：提取待檢樣本中的HIV抗體，與硝酸纖維素膜上的HIV抗原（如gp160、gp120、gp41、p24）結(jié)合。2.孵育：加入酶標記的二抗（如HRP標記的羊抗人IgG），37℃孵育30分鐘。3.顯色：加入底物液（如DAB），待條帶出現(xiàn)后終止反應。結(jié)果判斷（符合GB____標準）：陽性：同時出現(xiàn)gp160/gp120、gp41、p24三條條帶；不確定：出現(xiàn)上述條帶中的1-2條（需隨訪3個月后重新檢測）；陰性：無條帶或僅出現(xiàn)無關(guān)條帶。3.2.2免疫熒光法（IFA）操作步驟：1.樣本固定：將待檢樣本滴加在載玻片上的HIV感染細胞（如H9細胞）上，37℃孵育30分鐘。2.洗滌：用PBS緩沖液洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體。3.加熒光二抗：滴加熒光標記的二抗（如FITC標記的羊抗人IgG），37℃孵育30分鐘。4.鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察，若細胞漿出現(xiàn)綠色熒光則為陽性。優(yōu)勢：可檢測早期感染（如急性HIV感染），但操作復雜，需專業(yè)人員。3.3室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）室內(nèi)質(zhì)控是保證檢測結(jié)果準確性的關(guān)鍵，需每批檢測必做。3.3.1質(zhì)控品選擇定值質(zhì)控品：選擇經(jīng)國家參考實驗室標定的HIV抗體質(zhì)控品（如高、中、低濃度）。自制質(zhì)控品：若無定值質(zhì)控品，可使用已知陽性/陰性樣本（需驗證穩(wěn)定性）。3.3.2操作流程1.加樣：將質(zhì)控品與待檢樣本同時加入檢測體系（如ELISA板）。2.檢測：按常規(guī)操作步驟進行檢測。3.結(jié)果判斷：陽性質(zhì)控品OD值需≥CO×2（或符合試劑說明書要求）；陰性質(zhì)控品OD值需<CO；若質(zhì)控結(jié)果異常，需立即查找原因（如試劑失效、操作錯誤），糾正后重新檢測。3.3.3失控處理立即停止檢測：封存待檢樣本、試劑及質(zhì)控品。查找原因：檢查試劑有效期、孵育溫度、洗板效果、加樣量等。糾正措施：更換試劑、校準設備、重新培訓操作人員。記錄與報告：填寫《室內(nèi)質(zhì)控失控記錄表》，說明失控原因、糾正措施及結(jié)果，并上報實驗室負責人。3.4常見問題處理3.4.1假陽性結(jié)果原因：樣本交叉污染、試劑不純、自身抗體（如類風濕因子）干擾、操作錯誤（如加樣過量）。處理：重新采集樣本（避免交叉污染）；使用另一種方法（如CLIA）復檢；若仍為陽性，需進行確認試驗。3.4.2假陰性結(jié)果原因：感染早期（抗體未產(chǎn)生）、樣本質(zhì)量差（如溶血、凝固）、試劑靈敏度低、操作錯誤（如孵育時間不足）。處理：詢問受檢者暴露史（如近期有高危行為），建議4-6周后復查；更換高靈敏度試劑（如第四代ELISA，可檢測P24抗原）；重新檢測（嚴格按操作步驟）。3.4.3操作錯誤常見錯誤：加樣量不準確、孵育時間過長/過短、洗滌不充分。預防：使用校準后的移液器（定期檢定）；嚴格按照試劑說明書設置孵育時間/溫度；洗板機定期維護（如更換噴頭）。四、檢測后處理4.1結(jié)果報告與解釋4.1.1報告格式HIV檢測報告需包含以下信息：受檢者信息：姓名、性別、年齡、樣本編號；檢測信息：檢測方法、試劑批號、檢測時間；結(jié)果：陽性/陰性/不確定（需注明確認試驗結(jié)果）；解釋：如“篩查陽性，需進一步做確認試驗”“確認陽性，建議到定點醫(yī)院治療”；實驗室信息：名稱、地址、聯(lián)系方式、檢測人員簽字、審核人員簽字。4.1.2結(jié)果解釋篩查陰性：未感染HIV（若有高危行為，需在窗口期后復查，窗口期為感染后2-6周）；篩查陽性：不能確診，需進行確認試驗；確認陽性：確診HIV感染（需及時通知受檢者，并建議啟動抗病毒治療）；不確定：需隨訪3個月后重新檢測（若仍為不確定，需結(jié)合臨床癥狀、CD4+T細胞計數(shù)等綜合判斷）。4.1.3報告發(fā)放紙質(zhì)報告：由實驗室負責人審核后，加蓋實驗室公章，發(fā)放給受檢者或其授權(quán)人；電子報告：通過LIS系統(tǒng)發(fā)送給受檢者（需加密，保護隱私）；緊急報告：確認陽性結(jié)果需在24小時內(nèi)通知受檢者，并填寫《HIV感染個案報告卡》上報當?shù)丶部刂行摹?.2樣本與廢棄物處理4.2.1樣本保存篩查陰性樣本：保存2周（如需復檢），后按醫(yī)療廢物處理；篩查陽性/確認陽性樣本：保存5年（如需溯源），保存條件為-20℃（血漿/血清）或-70℃（全血）；不確定樣本：保存至隨訪結(jié)束（如3個月后）。4.2.2廢棄物處理生物廢物：污染的樣本、試劑瓶、吸頭放入生物安全袋（貼“生物危害”標識），高壓滅菌（121℃，30分鐘）后處理；化學廢物：終止液、底物液等放入耐酸容器，加入氫氧化鈉中和后排放；銳器：采血針、注射器等放入銳器盒（滿3/4時封閉），由醫(yī)療廢物處置單位回收。4.3記錄與溯源4.3.1記錄內(nèi)容樣本信息：采集時間、類型、編號、受檢者信息；檢測信息：試劑批號、檢測方法、操作時間、操作人員；結(jié)果信息：OD值、Cutoff值、結(jié)果判斷、確認試驗結(jié)果；質(zhì)控信息：質(zhì)控品批號、OD值、結(jié)果判斷、失控處理記錄；其他：設備維護記錄、培訓記錄、室間質(zhì)評結(jié)果。4.3.2保存期限檢測記錄：保存5年（如需溯源，可延長至10年）；質(zhì)控記錄：保存5年；設備維護記錄：保存至設備報廢。4.3.3溯源管理若受檢者對結(jié)果有異議，需提供完整的檢測記錄（包括樣本信息、試劑信息、質(zhì)控結(jié)果、操作步驟），以便溯源；若出現(xiàn)重大質(zhì)量問題（如批量假陽性），需立即啟動溯源程序，查找原因（如試劑批次問題、操作流程問題）。4.4咨詢與轉(zhuǎn)診4.4.1檢測前咨詢告知受檢者檢測的目的、意義、流程及結(jié)果的局限性（如窗口期）；詢問受檢者的高危行為史（如性接觸、靜脈注射毒品、母嬰傳播），評估感染風險；簽署《HIV檢測知情同意書》（需明確告知受檢者有權(quán)拒絕檢測）。4.4.2檢測后咨詢陰性結(jié)果：告知受檢者未感染HIV，但需避免高危行為（如使用安全套、避免共用注射器）；若有高危行為，需在窗口期后復查；陽性結(jié)果：告知受檢者確診HIV感染，需盡快啟動抗病毒治療（ART），并介紹治療的好處（如降低傳播風險、延長壽命）；提供心理支持，避免受檢者產(chǎn)生絕望情緒；不確定結(jié)果：告知受檢者需隨訪3個月后重新檢測，期間需避免高危行為；轉(zhuǎn)診：將確診陽性的受檢者轉(zhuǎn)診至當?shù)匕滩《c醫(yī)院（如疾控中心、傳染病醫(yī)院），由專業(yè)醫(yī)生進行治療和管理。五、實驗室管理與持續(xù)改進5.1人員培訓與資質(zhì)入職培訓：新員工需接受HIV檢測技術(shù)培訓（如ELISA、Westernblot操作）、生物安全培訓（如個人防護、樣本處理）、法律法規(guī)培訓（如《艾滋病防治條例》），考核合格后方可上崗；定期培訓：現(xiàn)有員工需每年接受繼續(xù)教育（如參加國家級/省級HIV檢測培訓班、學習最新指南），更新知識和技能；資質(zhì)管理：檢測人員需取得《HIV檢測資格證書》（由省級疾控中心頒發(fā)），定期復核（每3年一次）。5.2設備維護與校準日常維護：每天檢測前檢查設備的性能（如酶標儀的波長準確性、洗板機的洗滌效果），填寫《設備日常維護記錄》；定期校準：酶標儀、洗板機、離心機等設備需每年由國家認可的校準機構(gòu)校準（如中國計量科學研究院），校準證書需在有效期內(nèi)；故障處理：若設備出現(xiàn)故障（如酶標儀無法讀值、洗板機漏水），需立即停止使用，聯(lián)系廠家維修，并填寫《設備故障處理記錄》；維修后需重新校準，確認性能正常后方可使用。5.3室間質(zhì)評與能力驗證參加要求：所有開展HIV檢測的實驗室需參加國家衛(wèi)健委組織的HIV檢測室間質(zhì)評（每年2次），以及省級疾控中心組織的質(zhì)評（每年4次）；結(jié)果處理：若質(zhì)評結(jié)果合格（如得分≥80分），可繼續(xù)開展檢測工作；若結(jié)果不合格（如得分<80分），需查找原因（如試劑選擇錯誤、操作不規(guī)范），采取糾正措施（如更換試劑、加強培訓），并重新參加質(zhì)評；能力驗證：定期參加國家參考實驗室組織的能力驗證（如HIV抗體檢測能力驗證），以證明實驗室的檢測能力符合國家要求。5.4流程優(yōu)化與風險評估流程review：定期（如每半年）review檢測流程（從樣本采集到結(jié)果報告），尋找可能的漏洞（如樣本接收環(huán)節(jié)遺漏信息、操作步驟冗余），采取改進