第十章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)演示文稿第一頁，共六十二頁。第十章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)第二頁，共六十二頁。內(nèi)容PCR的概念及技術(shù)的創(chuàng)建PCR的基本原理及特點(diǎn)PCR的反應(yīng)體系和條件優(yōu)化PCR產(chǎn)物分析PCR常用技術(shù)和應(yīng)用第三頁，共六十二頁。KaryBMullis

(1944-)

1983年發(fā)明了PCR技術(shù)

1993年度獲得諾貝爾化學(xué)獎第四頁，共六十二頁。第五頁，共六十二頁。DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：templateDNA（genomicDNA

），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，

DNA聚合酶，連接酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37℃

反應(yīng)過程：起始（模板DNA解鏈、形成引發(fā)體）、延長、終止（三階段）產(chǎn)物：模板DNA（基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA，cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer，dNTPsDNApolymerasebuffer，三種變化的溫度（94，50-70，72℃），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三階段，多循環(huán)）目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍第六頁，共六十二頁。PCR技術(shù)的基本原理屬于無細(xì)胞的分子克隆，在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。第七頁，共六十二頁。Denaturing95?CAnnealingTm-5?CExtension72?CPCR的原理第八頁，共六十二頁。PCR的過程（1）第一步

變性（denature）94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步

復(fù)性（anneal）50-60oC下1分鐘，引物與模板復(fù)性。①引物的濃度高，②引物的鏈短。第九頁，共六十二頁。94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步

變性（denature）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重復(fù)（repeat）第十頁，共六十二頁。PCR反應(yīng)條件變性95℃5min變性95℃1min退火55℃1min延伸72℃1min延伸72℃1min35cycles變性95℃延伸72℃退火Tm-5℃第十一頁，共六十二頁。PCR

PrincipletemplatedenaturatationPrimerannealingPrimerextension第十二頁，共六十二頁。PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性靈敏度高指數(shù)增長，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡便、快速2～4小時完成擴(kuò)增對標(biāo)本的純度要求低不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。第十三頁，共六十二頁。第十四頁，共六十二頁。PCR儀第十五頁，共六十二頁。PCR反應(yīng)第十六頁，共六十二頁。標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul第十七頁，共六十二頁。自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。（1）TaqDNA聚合酶

PCR體系組成TaqDNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復(fù)高溫變性要求。①

熱穩(wěn)定性第十八頁，共六十二頁。最適溫度：

72-78oC延伸速度：

約1000nt/min酶分子最長延伸長度：6.7kb②

最適溫度高③

Taq酶的功能與缺點(diǎn)具有5’

3’聚合酶活性和5’

3’外切酶活性，但沒有3’

5’外切酶活性。合成超過600bp長度的DNA就有可能出現(xiàn)錯配，用于克隆基因時必須測序。第十九頁，共六十二頁。金屬離子敏感（尤其是Mg2+）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為時，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。④

TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。第二十頁，共六十二頁。與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補(bǔ)（

5‘端相同）的短DNA。（2）引物（primer)①位置3’

3’

第二十一頁，共六十二頁。即2.75

1011bp的基因組中有一次完全與19個核苷酸的序列相同的機(jī)會（或機(jī)會是約2×10-11）。②引物的長度理論計算：419=2.75

1011。一般引物設(shè)計為長15-30bp。第二十二頁，共六十二頁。③引物的堿基序列5’端根據(jù)需要可設(shè)計成某個內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必須與模板正確配對，5’端可以不配對。templateprimer第二十三頁，共六十二頁。盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力④引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列.

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T發(fā)卡結(jié)構(gòu)1）2）第二十四頁，共六十二頁。3）避免形成引物二聚體（dimer）兩個引物之間不能有兩個以上的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer第二十五頁，共六十二頁。⑤引物的Tm值Tm=（G+C)

4+(A+T)

2當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時，復(fù)性溫度低于55oC。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5oC。手工計算：一般估計：第二十六頁，共六十二頁。⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.2

mol/L。⑦簡并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。第二十七頁，共六十二頁。設(shè)計多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計現(xiàn)在多用專業(yè)軟件⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer6.0等第二十八頁，共六十二頁。dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性分解dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)小量分裝，-20℃冰凍保存，多次凍融會使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性（3）dNTP第二十九頁，共六十二頁。（4）模板DNA但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。②

模板的量：不能太多，100

l反應(yīng)體系中100ng足夠。①

純度：PCR對模板DNA的純度要求不高。第三十頁，共六十二頁。Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，dNTP濃度200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低

TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少（5）Mg2+第三十一頁，共六十二頁。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）第三十二頁，共六十二頁。1、溫度

變性溫度：94-97℃退火溫度：低于引物Tm5℃左右，一般55-60℃溫度過高：降低擴(kuò)增效率；溫度過低：增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度：72℃，此時Taq酶具有較高的酶促活性第三十三頁，共六十二頁。2、時間

第一次變性應(yīng)給予足夠時間（5-7分鐘）每一個步驟所需時間取決于擴(kuò)增片段的長度，一般為復(fù)性時間：30～60sec

延伸時間：1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min3-4Kb的DNA片段，延伸時間3-4min10Kb的DNA片段，延伸時間15min第三十四頁，共六十二頁。3、循環(huán)次數(shù)

重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25～35個循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的平臺效應(yīng)：理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴(kuò)增25-25個循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺，此時擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長第三十五頁，共六十二頁。PCR反應(yīng)曲線第三十六頁，共六十二頁。PCR產(chǎn)物分析

AnalysisofPCRproductsGelanalysis(瓊脂糖凝膠電泳/聚丙烯酰胺凝膠電泳):PCR產(chǎn)物電泳，EB（溴乙錠）染色，紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。第三十七頁，共六十二頁。Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、電泳分離。產(chǎn)物的鑒定，基因分型，研究變異性。第三十八頁，共六十二頁。Hybridization：

(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridization第三十九頁，共六十二頁。Sequenceanalysis：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。第四十頁，共六十二頁。常用PCR技術(shù)原位PCR(insituPCR)多重PCR（multiplexPCR）長距離PCR(Long-rangePCR)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）熒光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）巢式PCR（nestingPCR）-4條引物第四十一頁，共六十二頁。原位ＰＣＲ（InsituPCR）原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InsituPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列第四十二頁，共六十二頁。

原位PCR的作用

利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。第四十三頁，共六十二頁。多重PCR（MultiplexPCR復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。第四十四頁，共六十二頁。電泳引物12341234第四十五頁，共六十二頁。RT-PCR（reversetranscription-PCR）Temin,H.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，1975諾貝爾獎技術(shù)關(guān)鍵：利用逆轉(zhuǎn)錄酶，把mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第四十六頁，共六十二頁。RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶第四十七頁，共六十二頁。PCR-RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

限制性片段長度多態(tài)性1.分析已知突變。2.突變堿基涉及酶切位點(diǎn)的變化。PCR----酶切------電泳第四十八頁，共六十二頁。PCR-RFLP5’CCACGG3’3’GGTGCC5’*5’CCATGG3’3’

GGTACC5’*ResistancetoNcoIDigestionSusceptibletoNcoIDigestion第四十九頁，共六十二頁。HomozygousMutantHomozygousWild-typeHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP第五十頁，共六十二頁。SSCPPCRPCRATCGWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutant第五十一頁，共六十二頁。DenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAmoleculesconformationdependsontheirsequenceRunonaNon-denaturinggelandlookformobilitydifferencesWildMutantSSCP第五十二頁，共六十二頁。點(diǎn)突變位于酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：限制性酶切片段分析法不在酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)

致病基因上的未知點(diǎn)突變：PCR-SSCP（單核苷酸多態(tài)性，SNP）第五十三頁，共六十二頁。實(shí)時熒光定量PCR(Real-timePCR)常規(guī)定量PCR技術(shù)：

—對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量

—重復(fù)性差

—半定量實(shí)時定量PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量

第五十四頁，共六十二頁。實(shí)時熒光定量PCR原理在PC