醫(yī)院核酸檢測操作流程規(guī)范一、引言核酸檢測是病原微生物（如新型冠狀病毒、流感病毒等）感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在傳染病防控、臨床診療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。規(guī)范的操作流程是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、降低交叉感染風(fēng)險、保障醫(yī)患安全的核心環(huán)節(jié)。本文依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）、《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》（最新版）等文件要求，結(jié)合醫(yī)院實(shí)際工作場景，梳理核酸檢測全流程規(guī)范，旨在為臨床實(shí)驗(yàn)室及一線工作人員提供可操作的指導(dǎo)。二、核酸檢測全流程規(guī)范核酸檢測流程涵蓋檢測前預(yù)處理、樣本采集、樣本轉(zhuǎn)運(yùn)、實(shí)驗(yàn)室接收與錄入、核酸提取、擴(kuò)增與檢測、結(jié)果報告、廢棄物處理八大環(huán)節(jié)，各環(huán)節(jié)需嚴(yán)格遵循生物安全要求及操作標(biāo)準(zhǔn)。（一）檢測前預(yù)處理1.患者信息核對采集前需確認(rèn)患者身份（姓名、性別、年齡、身份證號等），核對檢測申請單信息（檢測項(xiàng)目、采樣部位、臨床診斷等），確保信息一致。告知患者采樣注意事項(xiàng)（如采樣前30分鐘避免吸煙、飲酒、嚼口香糖，避免劇烈咳嗽），取得患者配合。2.物資與環(huán)境準(zhǔn)備采樣物資：無菌拭子（咽拭子/鼻拭子）、病毒保存液（含胍鹽或其他滅活成分）、采樣管（貼有唯一標(biāo)識二維碼）、消毒用品（75%乙醇、免洗手消毒液）、防護(hù)裝備（N95口罩、護(hù)目鏡/面屏、一次性手套、防護(hù)服、鞋套）。環(huán)境要求：采樣點(diǎn)需劃分清潔區(qū)、緩沖區(qū)、采樣區(qū)，通風(fēng)良好；采樣區(qū)每小時消毒1次（含氯消毒液擦拭物體表面，空氣消毒機(jī)消毒）。（二）樣本采集樣本采集是核酸檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。常用采樣部位為咽拭子（首選）、鼻拭子（適用于咽拭子采集困難者）。1.咽拭子采集操作規(guī)范采集者防護(hù)：穿防護(hù)服、戴N95口罩、護(hù)目鏡、一次性手套（雙層）、鞋套，操作前手消毒。患者配合：患者取坐位，頭部微仰，張口發(fā)“啊”音，充分暴露咽后壁。采集方法：（1）用無菌咽拭子繞過舌根，擦拭兩側(cè)腭弓（扁桃體所在部位）、咽后壁及扁桃體表面，每個部位往返擦拭3次（避免接觸舌頭、牙齒、牙齦）。（2）將拭子放入含3~5ml病毒保存液的采樣管中，折斷拭子桿（留取拭子頭于管內(nèi)），旋緊管蓋。注意事項(xiàng)：采集動作輕柔，避免損傷黏膜引起出血；若患者咳嗽，暫停操作，待其緩解后繼續(xù)；同一患者避免重復(fù)使用拭子。2.鼻拭子采集操作規(guī)范采集者防護(hù)：同咽拭子采集?；颊吲浜希夯颊呷∽?，頭部微仰，保持鼻腔放松。采集方法：（1）用無菌鼻拭子沿鼻中隔與下鼻甲之間的腔道（避免接觸鼻中隔）緩慢插入，深度約為鼻尖至耳垂距離的1/2~2/3（成人約4~5cm，兒童約2~3cm）。（2）拭子到達(dá)深度后，順時針旋轉(zhuǎn)3圈（約10秒），然后緩慢退出。（3）將拭子放入病毒保存液中，處理方式同咽拭子。注意事項(xiàng)：插入時避免用力過猛，防止損傷鼻腔黏膜；若患者有鼻出血史，優(yōu)先選擇咽拭子。（三）樣本轉(zhuǎn)運(yùn)1.轉(zhuǎn)運(yùn)包裝采樣管需放入密封袋（生物安全袋），袋外貼標(biāo)識（患者信息、采樣時間、采樣部位）；密封袋放入符合UN2814標(biāo)準(zhǔn)的生物安全轉(zhuǎn)運(yùn)箱（內(nèi)放冰袋，保持4℃以下）。轉(zhuǎn)運(yùn)箱需加鎖，由專人負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)。2.轉(zhuǎn)運(yùn)時限與路線樣本采集后2小時內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室（偏遠(yuǎn)地區(qū)不超過24小時）；轉(zhuǎn)運(yùn)過程中避免劇烈震蕩。轉(zhuǎn)運(yùn)路線需避開人群密集區(qū)，優(yōu)先選擇專用通道。3.交接記錄轉(zhuǎn)運(yùn)人員與實(shí)驗(yàn)室接收人員核對樣本信息（數(shù)量、標(biāo)識、保存條件），簽署交接記錄（包括轉(zhuǎn)運(yùn)時間、接收時間、雙方姓名）。（四）實(shí)驗(yàn)室接收與錄入1.樣本接收實(shí)驗(yàn)室設(shè)專人接收樣本，檢查密封袋完整性、采樣管標(biāo)識清晰度、保存液量（不少于1ml）、轉(zhuǎn)運(yùn)溫度（4℃以下）。不符合要求的樣本（如密封袋破損、標(biāo)識不清、保存液不足）需拒收，聯(lián)系采樣點(diǎn)重新采集。2.信息錄入將樣本信息（患者姓名、身份證號、采樣時間、采樣部位、檢測項(xiàng)目）錄入實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIS），生成唯一檢測編號。錄入后核對信息，確保與采樣申請單一致。（五）核酸提取核酸提取是去除樣本中抑制物、純化核酸的關(guān)鍵步驟，常用方法為磁珠法（自動化）或柱提法（半自動化）。1.試劑與設(shè)備準(zhǔn)備試劑：核酸提取試劑盒（需在有效期內(nèi)，儲存條件符合要求）、無水乙醇（柱提法用）。設(shè)備：核酸提取儀、離心機(jī)、移液器（校準(zhǔn)合格）。2.操作規(guī)范樣本滅活（若使用非滅活保存液）：將采樣管放入56℃水浴箱，滅活30分鐘（避免RNA降解）。加樣：用移液器吸取200μl樣本（或按試劑盒說明書）加入提取板，同時加入陽性對照（已知陽性樣本）、陰性對照（生理鹽水）、空白對照（提取試劑）。提?。喊凑仗崛x操作流程運(yùn)行（磁珠法需加入磁珠、裂解液、洗滌液；柱提法需過柱、洗滌、洗脫），最終洗脫核酸（體積通常為50~100μl）。3.質(zhì)量控制每批提取需帶陽性對照（確保提取效率）、陰性對照（監(jiān)測污染）、空白對照（監(jiān)測試劑污染）；若對照結(jié)果異常，需重新提取。（六）擴(kuò)增與檢測擴(kuò)增與檢測采用實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，需在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室（PCR實(shí)驗(yàn)室）的擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。1.PCR反應(yīng)體系配制試劑：PCR擴(kuò)增試劑盒（含引物探針、酶混合液、反應(yīng)緩沖液），需在冰上配制。操作：按照試劑盒說明書，將酶混合液、引物探針、核酸模板（提取后的樣本）加入反應(yīng)管，總體系通常為25~50μl（模板量10~20μl）。注意事項(xiàng)：配制過程中避免交叉污染（使用帶濾芯移液器頭，每樣本更換槍頭）；陽性對照、陰性對照、空白對照需同時配制。2.擴(kuò)增反應(yīng)將反應(yīng)管放入PCR儀，設(shè)置擴(kuò)增程序（通常為：95℃預(yù)變性3~5分鐘；95℃變性15~30秒，55~60℃退火/延伸30~60秒，共40個循環(huán)）。擴(kuò)增過程中避免打開PCR儀蓋，防止氣溶膠污染。3.結(jié)果判讀根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定閾值（通常為基線以上3~5倍標(biāo)準(zhǔn)差），讀取Ct值（循環(huán)閾值）。陽性結(jié)果：目標(biāo)基因（如新型冠狀病毒ORF1ab、N基因）Ct值均<38，且曲線呈典型S型；單基因陽性需重新提取樣本復(fù)核，復(fù)核陽性方可報告。陰性結(jié)果：目標(biāo)基因Ct值≥38，或無擴(kuò)增曲線。無效結(jié)果：陽性對照未擴(kuò)增、陰性對照擴(kuò)增、空白對照擴(kuò)增，需重新檢測。（七）結(jié)果報告1.報告內(nèi)容患者信息（姓名、性別、年齡、身份證號）、檢測編號、采樣時間、接收時間、檢測時間、檢測項(xiàng)目、采樣部位、結(jié)果（陽性/陰性/無效）、檢測方法、實(shí)驗(yàn)室名稱、檢測者簽名、審核者簽名。2.報告時限常規(guī)樣本：采集后24小時內(nèi)出具報告（急診樣本≤6小時）。陽性結(jié)果：立即復(fù)核（1小時內(nèi)完成），復(fù)核陽性后30分鐘內(nèi)上報醫(yī)院感染管理科及當(dāng)?shù)丶部刂行?，同時通知患者隔離。3.報告發(fā)放電子報告通過醫(yī)院公眾號、LIS系統(tǒng)發(fā)布；紙質(zhì)報告由患者或家屬憑身份證領(lǐng)?。ㄐ韬藢ι矸荩?。（八）廢棄物處理1.感染性廢物采樣拭子、采樣管、密封袋、PCR反應(yīng)管等：放入雙層黃色醫(yī)療垃圾袋（標(biāo)識“感染性廢物”），扎口后用含氯消毒液（1000mg/L）噴灑表面，送醫(yī)院醫(yī)療廢物暫存點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室耗材（移液器頭、手套、防護(hù)服）：放入黃色垃圾袋，按上述方法處理。2.化學(xué)廢物核酸提取試劑盒中的廢液、乙醇等：倒入化學(xué)廢物收集桶（標(biāo)識“化學(xué)廢物”），由有資質(zhì)的單位回收處理。3.環(huán)境消毒采樣區(qū)、實(shí)驗(yàn)室臺面：用含氯消毒液（500mg/L）擦拭，每日下班前消毒1次。PCR儀、提取儀：用75%乙醇擦拭表面，每周深度消毒1次（用含氯消毒液浸泡配件）。三、質(zhì)量控制與持續(xù)改進(jìn)1.人員資質(zhì)檢測人員需取得《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)人員上崗證》，定期參加培訓(xùn)（每年不少于12學(xué)時），考核合格后方可上崗。2.試劑與設(shè)備管理試劑需從合法渠道采購，驗(yàn)收時檢查有效期、批號、儲存條件；設(shè)備需定期校準(zhǔn)（PCR儀每年1次，移液器每6個月1次），做好維護(hù)記錄。3.室內(nèi)質(zhì)控每批檢測需帶弱陽性對照（Ct值30~35）、強(qiáng)陽性對照（Ct值20~25）、陰性對照，確保質(zhì)控結(jié)果在可接受范圍內(nèi)（如弱陽性對照Ct值波動≤2）。4.室間質(zhì)評參加國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗(yàn)中心（NCCL）或省級臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)評，成績合格（≥80分）；若成績不合格，需分析原因并整改。5.流程優(yōu)化定期召開質(zhì)量分析會，針對檢測中出現(xiàn)的問題（如樣本污染、結(jié)果異常）進(jìn)行根因分析，優(yōu)化操作流程（如增加樣本滅活步驟、改進(jìn)PCR儀通風(fēng)系統(tǒng)）。四、注意事項(xiàng)1.生物安全采樣人員需嚴(yán)格遵守三級防護(hù)要求，操作后立即手消毒（用免洗手消毒液搓揉15秒）；實(shí)驗(yàn)室工作人員需穿防護(hù)服、戴N95口罩、護(hù)目鏡，進(jìn)入擴(kuò)增區(qū)需更換手套。避免樣本交叉污染：采樣管需單獨(dú)放置，實(shí)驗(yàn)室加樣時使用帶濾芯槍頭，PCR反應(yīng)管需加蓋。2.患者溝通向患者解釋核酸檢測的目的、流程及注意事項(xiàng)，緩解其緊張情緒；陽性患者需告知隔離要求及后續(xù)診療流程。3.信息安全患者信息需嚴(yán)格保密，不得泄露；LIS系統(tǒng)需設(shè)置權(quán)限，只有授權(quán)人員可查看、修改信息。五、結(jié)語醫(yī)院核酸檢測操作流程的規(guī)范化是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、保障醫(yī)患安全的核心。臨床實(shí)驗(yàn)室需嚴(yán)格遵循相關(guān)法律法規(guī)及技術(shù)指南，加強(qiáng)質(zhì)量控制，持續(xù)優(yōu)化流程，提高檢測效率。一線工作人員需強(qiáng)化培訓(xùn)，規(guī)范操作，確保每一