演講人：日期:細(xì)胞培養(yǎng)步驟講解CATALOGUE目錄01準(zhǔn)備工作02細(xì)胞復(fù)蘇03細(xì)胞接種04培養(yǎng)維護(hù)05細(xì)胞傳代06質(zhì)量控制01準(zhǔn)備工作培養(yǎng)基配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇根據(jù)細(xì)胞類型選擇適宜的培養(yǎng)基（如DMEM、RPMI-1640等），并補(bǔ)充必需成分如谷氨酰胺、丙酮酸鈉等，確保細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)支持。血清添加與優(yōu)化胎牛血清（FBS）是常用添加物，需篩選合適濃度（通常5%-20%），并進(jìn)行熱滅活處理以降低免疫原性，同時(shí)避免批次差異對(duì)細(xì)胞的影響。pH與滲透壓調(diào)節(jié)使用碳酸氫鈉或HEPES緩沖液維持培養(yǎng)基pH在7.2-7.4，滲透壓需匹配細(xì)胞內(nèi)環(huán)境（約290-310mOsm/kg），避免細(xì)胞應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)設(shè)備消毒高壓蒸汽滅菌玻璃器皿、金屬器械等耐高溫物品需在121℃、15psi條件下滅菌20分鐘，確保徹底殺滅微生物及芽孢。濾膜除菌技術(shù)培養(yǎng)基、胰酶等液體需通過(guò)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，去除細(xì)菌和真菌污染物，操作需在超凈臺(tái)內(nèi)完成?；瘜W(xué)消毒劑處理超凈臺(tái)表面及不耐熱器材可用75%乙醇或0.1%新潔爾滅擦拭，紫外線照射30分鐘以上以增強(qiáng)無(wú)菌效果。無(wú)菌操作環(huán)境設(shè)置超凈工作臺(tái)校準(zhǔn)定期檢測(cè)臺(tái)面氣流速度（通常0.3-0.5m/s）和高效過(guò)濾器完整性，確保達(dá)到ISO5級(jí)潔凈標(biāo)準(zhǔn)。個(gè)人防護(hù)規(guī)范操作者需穿戴無(wú)菌手套、口罩及實(shí)驗(yàn)服，手部用75%乙醇消毒，避免說(shuō)話或快速移動(dòng)以減少氣流擾動(dòng)。環(huán)境監(jiān)測(cè)與維護(hù)使用沉降菌平板或空氣采樣器定期監(jiān)測(cè)無(wú)菌等級(jí)，超凈臺(tái)內(nèi)禁止放置非必要物品以降低污染風(fēng)險(xiǎn)。02細(xì)胞復(fù)蘇解凍過(guò)程操作將凍存管從低溫環(huán)境中取出后，立即置于恒溫水浴中快速解凍，避免冰晶重結(jié)晶對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，同時(shí)嚴(yán)格控制水浴溫度以避免過(guò)熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性?？焖俳鈨黾夹g(shù)凍存液稀釋處理無(wú)菌操作規(guī)范解凍后需迅速加入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，降低凍存液中二甲基亞砜（DMSO）的濃度，減少其對(duì)細(xì)胞的化學(xué)毒性作用。全程在生物安全柜內(nèi)操作，使用酒精燈外焰滅菌凍存管開(kāi)口，避免環(huán)境中微生物污染影響細(xì)胞活性。離心與重懸步驟低速離心參數(shù)設(shè)置采用低速離心（如1000rpm）分離細(xì)胞與凍存液，離心時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，避免機(jī)械力損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)保留細(xì)胞活性。培養(yǎng)基重懸技巧細(xì)胞計(jì)數(shù)與活率檢測(cè)棄去上清液后，用新鮮預(yù)熱的完全培養(yǎng)基輕柔吹打細(xì)胞沉淀，避免產(chǎn)生氣泡或剪切力破壞細(xì)胞膜完整性。使用臺(tái)盼藍(lán)染色或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀評(píng)估細(xì)胞存活率，確保復(fù)蘇后細(xì)胞活率高于85%方可進(jìn)入后續(xù)培養(yǎng)流程。123初始培養(yǎng)條件首次換液時(shí)機(jī)復(fù)蘇后24小時(shí)內(nèi)需更換新鮮培養(yǎng)基，清除殘留的凍存液及細(xì)胞碎片，后續(xù)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度每48-72小時(shí)定期換液。氣體環(huán)境調(diào)控將培養(yǎng)皿置于含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中，維持穩(wěn)定的pH環(huán)境（7.2-7.4），并確保濕度達(dá)到95%以上防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。培養(yǎng)器皿選擇根據(jù)細(xì)胞類型選擇適宜的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，貼壁細(xì)胞優(yōu)先采用經(jīng)多聚賴氨酸包被的器皿以增強(qiáng)細(xì)胞貼附能力。03細(xì)胞接種細(xì)胞計(jì)數(shù)方法血球計(jì)數(shù)板法利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，需注意細(xì)胞懸液的均勻性和染色處理以提高準(zhǔn)確性。自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法通過(guò)光學(xué)或電阻抗原理快速測(cè)定細(xì)胞濃度和存活率，適用于高通量實(shí)驗(yàn)，減少人為誤差。臺(tái)盼藍(lán)染色法結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)染料區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，活細(xì)胞排斥染料呈無(wú)色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，用于評(píng)估細(xì)胞活力。接種密度確定細(xì)胞類型差異不同細(xì)胞系對(duì)接種密度要求各異，貼壁細(xì)胞通常需較高密度以促進(jìn)貼壁，懸浮細(xì)胞可適當(dāng)降低密度避免過(guò)度聚集。培養(yǎng)容器尺寸培養(yǎng)皿、多孔板等容器的表面積與體積比直接影響細(xì)胞分布，需根據(jù)容器規(guī)格調(diào)整接種量。實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠绊懺鲋硨?shí)驗(yàn)需較低初始密度以延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而藥物篩選實(shí)驗(yàn)可能需較高密度確保細(xì)胞存活率。培養(yǎng)容器準(zhǔn)備表面處理貼壁細(xì)胞需使用經(jīng)多聚賴氨酸或膠原包被的培養(yǎng)皿以增強(qiáng)細(xì)胞黏附性，懸浮細(xì)胞可直接使用未包處理容器。滅菌操作所有容器需經(jīng)高壓蒸汽或γ射線滅菌，避免微生物污染，操作時(shí)嚴(yán)格遵循無(wú)菌技術(shù)規(guī)范。培養(yǎng)基預(yù)平衡接種前將培養(yǎng)基加入容器并在培養(yǎng)箱中平衡溫度、pH及CO2濃度，減少對(duì)細(xì)胞的理化沖擊。04培養(yǎng)維護(hù)定期換液操作培養(yǎng)基更換頻率無(wú)菌操作規(guī)范殘留舊液處理特殊添加劑補(bǔ)充根據(jù)細(xì)胞類型和生長(zhǎng)速度確定換液周期，快速增殖的細(xì)胞通常需要每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并清除代謝廢物。換液過(guò)程需在生物安全柜中進(jìn)行，使用預(yù)熱的培養(yǎng)基和嚴(yán)格消毒的移液工具，避免引入微生物污染。吸除舊培養(yǎng)基時(shí)保留少量液體覆蓋細(xì)胞層，防止細(xì)胞干燥受損，尤其對(duì)于貼壁細(xì)胞更為關(guān)鍵。某些細(xì)胞系需在換液時(shí)添加生長(zhǎng)因子、抗生素或血清替代物，需按特定比例配制并記錄添加批次。生長(zhǎng)狀態(tài)觀察形態(tài)學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)每日通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，健康細(xì)胞應(yīng)具有特定形狀（如成纖維細(xì)胞呈梭形）、折光性良好且邊界清晰。密度監(jiān)測(cè)方法使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀定期檢測(cè)細(xì)胞濃度，維持最佳接種密度，避免過(guò)度融合導(dǎo)致接觸抑制。污染識(shí)別特征警惕培養(yǎng)基渾濁、pH異常變化或細(xì)胞形態(tài)變異等現(xiàn)象，這些可能指示細(xì)菌、真菌或支原體污染。生長(zhǎng)曲線繪制系統(tǒng)記錄各代次細(xì)胞的增殖速率，建立生長(zhǎng)曲線以評(píng)估培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性。環(huán)境參數(shù)監(jiān)測(cè)氣體環(huán)境控制維持培養(yǎng)箱內(nèi)5%二氧化碳濃度，使用紅外傳感器定期校準(zhǔn)，確保碳酸氫鹽緩沖體系pH穩(wěn)定在7.2-7.4范圍。01溫度波動(dòng)管理采用雙套溫度傳感系統(tǒng)監(jiān)控37℃恒溫環(huán)境，溫差超過(guò)±0.5℃時(shí)觸發(fā)報(bào)警并自動(dòng)啟動(dòng)備用加熱模塊。濕度維持措施培養(yǎng)箱內(nèi)放置無(wú)菌水盤(pán)使相對(duì)濕度保持在95%以上，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)導(dǎo)致滲透壓改變。設(shè)備日志審核每日記錄培養(yǎng)箱運(yùn)行參數(shù)包括氧氣濃度、門(mén)開(kāi)啟次數(shù)等，通過(guò)趨勢(shì)分析預(yù)判設(shè)備異常。02030405細(xì)胞傳代傳代時(shí)機(jī)判斷細(xì)胞密度監(jiān)測(cè)通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞匯合度，通常達(dá)到80%-90%時(shí)需傳代，避免過(guò)度生長(zhǎng)導(dǎo)致接觸抑制或老化。培養(yǎng)基消耗速度若培養(yǎng)基pH值迅速下降（顏色變黃）或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，表明細(xì)胞代謝活躍，需及時(shí)傳代。細(xì)胞形態(tài)變化當(dāng)細(xì)胞形態(tài)由規(guī)則多邊形變?yōu)槔L(zhǎng)或顆粒增多，可能提示增殖受限，需通過(guò)傳代恢復(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)。消化與分離技術(shù)酶消化法使用胰蛋白酶或膠原酶等消化液處理細(xì)胞，破壞細(xì)胞間連接蛋白，注意控制消化時(shí)間以避免細(xì)胞損傷。01機(jī)械分離法對(duì)敏感細(xì)胞可采用吹打或刮取等物理方法分離，但需操作輕柔以減少剪切力對(duì)細(xì)胞的傷害。02終止消化技巧加入含血清的培養(yǎng)基中和消化酶活性，離心后棄上清以徹底去除殘余酶類物質(zhì)。03接種新培養(yǎng)體系環(huán)境參數(shù)校準(zhǔn)將培養(yǎng)器置于37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，定期檢查CO2濃度和溫度穩(wěn)定性。03根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選用培養(yǎng)瓶、多孔板或培養(yǎng)皿，確保表面積與培養(yǎng)基體積比例適宜。02培養(yǎng)器皿選擇細(xì)胞計(jì)數(shù)與稀釋使用血球計(jì)數(shù)板或自動(dòng)計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞濃度，按目標(biāo)密度（如1×10^5個(gè)/mL）稀釋后接種。0106質(zhì)量控制細(xì)胞活力檢測(cè)臺(tái)盼藍(lán)染色法通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整而拒染，死細(xì)胞則被染成藍(lán)色，便于顯微鏡下計(jì)數(shù)計(jì)算存活率。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡及壞死細(xì)胞，精準(zhǔn)量化細(xì)胞存活狀態(tài)。MTT比色法利用MTT被活細(xì)胞線粒體還原酶還原為紫色甲瓚的原理，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，間接反映細(xì)胞增殖與代謝活性。污染防控措施無(wú)菌操作規(guī)范實(shí)驗(yàn)全程在生物安全柜中進(jìn)行，穿戴無(wú)菌手套及口罩，定期用75%乙醇擦拭超凈臺(tái)面及器械表面?？股厥褂貌呗栽谂囵B(yǎng)基中添加青霉素-鏈霉素雙抗組合，抑制常見(jiàn)細(xì)菌污染，但對(duì)支原體無(wú)效需配合專用清除劑。定期微生物檢測(cè)采用PCR法檢測(cè)支原體污染，或通過(guò)培養(yǎng)皿觀察真菌/細(xì)菌菌落，污染樣本需立即隔離并高壓滅菌處理。冷凍儲(chǔ)存方法使用細(xì)胞凍存液（含10%DMSO+90%胎牛血清）混懸