全反式維甲酸增強人結(jié)腸癌細(xì)胞系對奧沙利鉑敏感性的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。在全球范圍內(nèi)，尤其是發(fā)達(dá)國家，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。在我國，隨著人民生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率同樣逐年攀升。據(jù)統(tǒng)計，結(jié)腸癌在胃腸道腫瘤中的發(fā)病率位居第三，且發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化，目前高發(fā)年齡已降至45歲左右，較歐美國家提前了12-18年。這不僅給患者個人帶來了沉重的身心負(fù)擔(dān)，也對家庭和社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。奧沙利鉑作為一種常用的化療藥物，在結(jié)腸癌的治療中發(fā)揮著重要作用，是FOLFOX方案等一線化療方案的關(guān)鍵組成部分，能有效緩解晚期患者的病情進(jìn)展。然而，隨著治療的持續(xù)進(jìn)行，奧沙利鉑的耐藥性問題日益凸顯，成為導(dǎo)致治療失敗和患者預(yù)后不良的主要障礙。研究表明，包括細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)在內(nèi)的多種生物學(xué)過程參與了奧沙利鉑耐藥的發(fā)生發(fā)展，但具體分子機(jī)制仍未完全明確。臨床上，由于奧沙利鉑耐藥，許多患者不得不面臨治療方案的調(diào)整或中斷，嚴(yán)重影響了治療效果和生存質(zhì)量。因此，迫切需要探索新的方法來提高奧沙利鉑的化療效果，克服耐藥問題。全反式維甲酸（ATRA）作為維生素A的代表物質(zhì)，近年來在腫瘤治療領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。大量研究證實，ATRA具有多種抗腫瘤活性，可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、分化和表觀遺傳學(xué)等多種機(jī)制來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在多種惡性腫瘤的治療中，ATRA作為輔助治療藥物展現(xiàn)出了一定的潛力。有研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可以逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑所引起的化療耐藥性，提高腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過體外實驗，深入探究ATRA在提高人結(jié)腸癌細(xì)胞系對奧沙利鉑敏感性方面的作用及其潛在機(jī)制。這不僅有助于進(jìn)一步明確ATRA的抗腫瘤作用機(jī)制，為其在腫瘤治療中的臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)；同時，也有望為結(jié)腸癌的治療提供新的策略和方法，通過聯(lián)合使用ATRA和奧沙利鉑，提高化療效果，改善患者的預(yù)后，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在結(jié)腸癌治療領(lǐng)域，奧沙利鉑作為常用化療藥物，其作用機(jī)制與耐藥問題一直是國內(nèi)外研究的重點。奧沙利鉑作為第三代鉑類藥物，已廣泛應(yīng)用于多種晚期癌癥的臨床治療，包括結(jié)腸癌。研究表明，奧沙利鉑能夠產(chǎn)生水化衍生物，作用于DNA形成鉑-DNA加合物，抑制癌細(xì)胞DNA合成，誘導(dǎo)DNA蛋白交聯(lián)和DNA鏈的產(chǎn)生，進(jìn)而激活機(jī)體信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。然而，隨著奧沙利鉑在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，耐藥性問題日益凸顯。中國醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，XAB2在結(jié)直腸癌中表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)，其通過促進(jìn)DNA損傷修復(fù)來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并增強奧沙利鉑耐藥性，揭示了USP10/XAB2/ANXA2軸可促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖、DNA損傷修復(fù)以及奧沙利鉑耐藥性。全反式維甲酸（ATRA）作為維生素A的代表物質(zhì)，其抗腫瘤活性也受到了廣泛關(guān)注。大量研究證實，ATRA具有多種抗腫瘤活性，可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、分化和表觀遺傳學(xué)等多種機(jī)制來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在白血病治療中，ATRA已取得顯著療效，能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化成熟，提高患者的生存率。近年來，ATRA在實體腫瘤治療中的研究也逐漸增多。有研究表明，ATRA可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的周期和凋亡相關(guān)基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。關(guān)于ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)腸癌治療的研究，目前也有了一定的進(jìn)展。國內(nèi)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院的學(xué)者通過MTT法和流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，小劑量ATRA可以改變?nèi)私Y(jié)腸癌LoVo細(xì)胞周期，使S期細(xì)胞增多，提高細(xì)胞DNA含鉑量，從而明顯增加腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的藥物敏感性。然而，ATRA提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性的具體分子機(jī)制仍未完全明確，還需要進(jìn)一步深入研究。盡管國內(nèi)外在ATRA和奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及聯(lián)合使用方面取得了一定成果，但仍存在諸多問題有待解決。如ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合使用的最佳劑量和時間方案尚不明確，ATRA逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥性的具體信號通路和分子靶點還需進(jìn)一步探索等。本研究將在前人研究的基礎(chǔ)上，深入探究ATRA提高人結(jié)腸癌細(xì)胞系對奧沙利鉑敏感性的作用及其潛在機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究全反式維甲酸（ATRA）對提高人結(jié)腸癌細(xì)胞系對奧沙利鉑敏感性的作用及其潛在機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。在研究內(nèi)容方面，本研究將選取多種人結(jié)腸癌細(xì)胞系，如常用的SW480、SW620、HCT116細(xì)胞系等。這些細(xì)胞系具有不同的生物學(xué)特性，能夠更全面地反映ATRA對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用。利用MTT法，精確檢測不同濃度ATRA以及ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合作用下，結(jié)腸癌細(xì)胞在不同時間點的增殖情況。MTT法是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測的經(jīng)典方法，通過檢測細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將黃色的MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）的量，來間接反映活細(xì)胞的數(shù)量和活性。同時，采用流式細(xì)胞術(shù)，深入分析ATRA對結(jié)腸癌細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響，以及ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用后的效果。流式細(xì)胞術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地對單個細(xì)胞的多個參數(shù)進(jìn)行分析，為研究細(xì)胞周期和凋亡提供了有力的技術(shù)支持。為了進(jìn)一步揭示ATRA提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性的分子機(jī)制，本研究將采用Westernblot和RT-qPCR技術(shù)。通過Westernblot技術(shù)，能夠定量分析ATRA對腫瘤細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，如p53、Bcl-2、Bax等蛋白，這些蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。運用RT-qPCR技術(shù)，精確檢測ATRA對ATP結(jié)合盒子轉(zhuǎn)運蛋白ABCB1等相關(guān)基因表達(dá)的影響。ABCB1是一種重要的藥物外排泵，其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥密切相關(guān)，研究ATRA對其表達(dá)的調(diào)節(jié)，有助于深入了解ATRA逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥性的分子機(jī)制。1.4研究方法和技術(shù)路線本研究采用了多種實驗方法，從細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及分子機(jī)制等多個層面探究全反式維甲酸（ATRA）提高人結(jié)腸癌細(xì)胞系對奧沙利鉑敏感性的作用。在細(xì)胞增殖檢測方面，選用MTT法。將人結(jié)腸癌細(xì)胞系（如SW480、SW620、HCT116等）以每孔5×103-1×10?個細(xì)胞的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24小時使其貼壁。設(shè)置不同的藥物處理組，包括對照組（僅含細(xì)胞培養(yǎng)液）、ATRA單藥組（分別加入不同濃度的ATRA，如0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L等）、奧沙利鉑單藥組（分別加入不同濃度的奧沙利鉑，如5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L等）以及ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合用藥組（將不同濃度的ATRA和奧沙利鉑按照一定比例組合）。每個處理組設(shè)置5-6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24小時、48小時和72小時后，向每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時。然后小心吸去上清液，每孔加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。對于細(xì)胞周期和凋亡率的分析，運用流式細(xì)胞術(shù)。將結(jié)腸癌細(xì)胞以每瓶5×10?-1×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24小時后進(jìn)行藥物處理，處理組設(shè)置與MTT法相同。藥物作用一定時間后，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1000-1500rpm離心5-8分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心收集細(xì)胞。對于細(xì)胞周期檢測，將細(xì)胞重懸于70%冷乙醇中，4℃固定過夜。次日，1000-1500rpm離心5-8分鐘，棄乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞1次。加入500μL含有RNaseA（100μg/mL）和碘化丙啶（PI，50μg/mL）的染色液，37℃避光孵育30-45分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，通過分析不同DNA含量的細(xì)胞峰，確定處于G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例。對于細(xì)胞凋亡檢測，將收集的細(xì)胞用PBS洗滌2次后，加入500μL的BindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。在1小時內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計算細(xì)胞凋亡率。為了深入探究ATRA提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性的分子機(jī)制，采用Westernblot和RT-qPCR技術(shù)。在Westernblot實驗中，將結(jié)腸癌細(xì)胞接種于6孔板，藥物處理后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。12000-15000rpm，4℃離心15-20分鐘，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5-10分鐘使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1-2小時，然后加入一抗（如抗p53、抗Bcl-2、抗Bax等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10-15分鐘，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌膜3次，每次10-15分鐘，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白表達(dá)水平。在RT-qPCR實驗中，按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計測定RNA濃度和純度。取1-2μg的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)目的基因（如ABCB1等）和內(nèi)參基因（如β-actin）的序列設(shè)計引物，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件根據(jù)qPCR試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。通過分析Ct值，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。本研究的技術(shù)路線如下：首先進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，確定研究方案和實驗設(shè)計。采購實驗所需的試劑、材料和儀器設(shè)備，建立人結(jié)腸癌細(xì)胞系體外實驗?zāi)Ｐ?。然后利用MTT法檢測ATRA及ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合作用對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，篩選出合適的藥物濃度和作用時間。接著運用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡率，初步探究ATRA的作用效果。之后采用Westernblot和RT-qPCR技術(shù)，從蛋白和基因水平分析ATRA對腫瘤細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及對ATP結(jié)合盒子轉(zhuǎn)運蛋白ABCB1等相關(guān)基因表達(dá)的影響，深入研究ATRA提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性的分子機(jī)制。最后對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，總結(jié)研究結(jié)果，撰寫研究報告。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1結(jié)腸癌概述結(jié)腸癌是一種起源于結(jié)腸黏膜上皮的惡性腫瘤，在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占據(jù)重要地位。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。從遺傳角度來看，約15%-30%的結(jié)腸癌患者存在家族遺傳傾向，如家族性腺瘤性息肉病（FAP）、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）等遺傳性疾病，攜帶相關(guān)基因突變的個體，其結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險顯著增加。在環(huán)境因素方面，飲食結(jié)構(gòu)的改變被認(rèn)為是重要的誘發(fā)因素。長期攝入高脂肪、高蛋白、低膳食纖維的食物，會導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群失衡，產(chǎn)生過多的次級膽汁酸等有害物質(zhì)，刺激結(jié)腸黏膜，增加癌變風(fēng)險。有研究表明，每日膳食纖維攝入量不足10g的人群，其患結(jié)腸癌的風(fēng)險比攝入量達(dá)到25g以上的人群高出約2倍。此外，長期吸煙、過量飲酒、缺乏運動等不良生活習(xí)慣，也會削弱機(jī)體的免疫功能，為癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散創(chuàng)造條件。在全球范圍內(nèi)，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出明顯的地域差異。在北美、歐洲等發(fā)達(dá)國家，結(jié)腸癌的發(fā)病率較高，位居惡性腫瘤前列。根據(jù)美國癌癥協(xié)會（ACS）的數(shù)據(jù)，2023年美國預(yù)計新增結(jié)腸癌病例約10.6萬例，死亡病例約5.3萬例。而在亞洲、非洲等發(fā)展中國家，雖然發(fā)病率相對較低，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的西方化，近年來結(jié)腸癌的發(fā)病率呈快速上升趨勢。在中國，據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年結(jié)腸癌新發(fā)病例約41.6萬例，死亡病例約21.1萬例，發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤的第5位，且發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。結(jié)腸癌的早期癥狀往往不明顯，容易被忽視。隨著腫瘤的生長和發(fā)展，患者會逐漸出現(xiàn)一系列癥狀。當(dāng)腫瘤位于左半結(jié)腸時，由于腸腔相對狹窄，糞便干硬，患者常表現(xiàn)為腹痛、腹脹、便秘、便血等癥狀，部分患者還可能出現(xiàn)腸梗阻。若腫瘤位于右半結(jié)腸，腸腔較大，糞便呈液狀，不易導(dǎo)致腸梗阻，但癌腫易破潰出血，患者常出現(xiàn)貧血、消瘦、乏力等全身癥狀，以及腹部腫塊、腹痛等局部癥狀。這些癥狀不僅會給患者帶來身體上的痛苦，還會嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。目前，結(jié)腸癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放療以及靶向治療等，治療方案的選擇取決于腫瘤的分期、患者的身體狀況等因素。對于早期結(jié)腸癌患者，手術(shù)切除是主要的治療手段，通過根治性手術(shù)切除腫瘤組織，患者的5年生存率可達(dá)到90%以上。然而，對于中晚期結(jié)腸癌患者，單純手術(shù)治療往往難以徹底清除癌細(xì)胞，需要結(jié)合化療、放療等綜合治療手段?；熓墙Y(jié)腸癌綜合治療的重要組成部分，奧沙利鉑作為第三代鉑類化療藥物，因其獨特的抗癌機(jī)制和較好的療效，被廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌的化療方案中，如FOLFOX、XELOX等經(jīng)典方案。奧沙利鉑能夠與DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。然而，化療過程中常伴隨多種不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。此外，隨著化療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性逐漸產(chǎn)生，導(dǎo)致化療效果下降，成為結(jié)腸癌治療面臨的一大挑戰(zhàn)。放療則主要用于局部晚期結(jié)腸癌患者，通過高能射線照射腫瘤部位，殺死癌細(xì)胞，縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率。靶向治療是近年來發(fā)展起來的一種新型治療方法，它針對腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點進(jìn)行作用，具有特異性強、療效好、不良反應(yīng)相對較小等優(yōu)點。如貝伐單抗、西妥昔單抗等靶向藥物，已在臨床實踐中取得了一定的療效。但靶向治療也存在耐藥性問題，且藥物價格昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用。2.2奧沙利鉑的作用機(jī)制及耐藥問題奧沙利鉑作為第三代鉑類化療藥物，在結(jié)腸癌治療中具有重要地位，其獨特的作用機(jī)制使其能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長。奧沙利鉑進(jìn)入人體后，會發(fā)生一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)。首先，其中心鉑原子與DNA分子中的鳥嘌呤和腺嘌呤等堿基具有高度親和力，能夠形成穩(wěn)定的鉑-DNA加合物。這種加合物的形成會導(dǎo)致DNA分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，扭曲變形，從而阻礙DNA聚合酶、RNA聚合酶等關(guān)鍵酶的正常結(jié)合和催化作用，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。DNA復(fù)制是細(xì)胞分裂和增殖的基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄則是合成蛋白質(zhì)的關(guān)鍵步驟，這兩個過程的受阻使得腫瘤細(xì)胞無法正常進(jìn)行分裂和增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗癌的目的。然而，隨著奧沙利鉑在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，腫瘤細(xì)胞對其產(chǎn)生耐藥性的問題日益突出，嚴(yán)重影響了治療效果。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生奧沙利鉑耐藥性的原因是多方面的，涉及多個生物學(xué)過程和分子機(jī)制。從藥物攝取和外排角度來看，ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白家族在其中發(fā)揮了重要作用。ABCB1（也稱為P-糖蛋白，P-gp）是一種經(jīng)典的ABC轉(zhuǎn)運蛋白，它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的奧沙利鉑主動泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞系中，ABCB1的表達(dá)水平顯著升高，且其表達(dá)水平與細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥程度呈正相關(guān)。此外，ABCC亞組中的多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP），如MRP1、MRP4等，也參與了奧沙利鉑的耐藥過程，它們通過不同的機(jī)制影響藥物在細(xì)胞內(nèi)的累積，降低腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。DNA損傷修復(fù)機(jī)制的異常也是導(dǎo)致奧沙利鉑耐藥的重要因素。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在一套復(fù)雜而精密的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，能夠及時識別和修復(fù)由化療藥物等因素導(dǎo)致的DNA損傷，維持基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)奧沙利鉑與DNA結(jié)合形成鉑-DNA加合物后，細(xì)胞會啟動多種DNA損傷修復(fù)途徑，如核苷酸切除修復(fù)（NER）、堿基切除修復(fù)（BER）和錯配修復(fù)（MMR）等。在NER途徑中，切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC1）起著關(guān)鍵作用，它能夠識別并切除含有鉑-DNA加合物的DNA片段，然后通過DNA聚合酶和連接酶的作用進(jìn)行修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，在奧沙利鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞中，ERCC1的表達(dá)水平明顯升高，增強了細(xì)胞對鉑-DNA加合物的修復(fù)能力，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃脫奧沙利鉑的殺傷作用。MMR系統(tǒng)則主要負(fù)責(zé)糾正DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯配和小的插入/缺失錯誤。MMR基因（如MLH1、MSH2等）的突變或缺失會導(dǎo)致MMR功能缺陷，使腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑產(chǎn)生耐藥性。這是因為MMR缺陷的細(xì)胞無法有效識別和修復(fù)奧沙利鉑誘導(dǎo)的DNA損傷，從而使細(xì)胞能夠繼續(xù)存活和增殖。細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的改變也與奧沙利鉑耐藥密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體正常生理功能和抑制腫瘤生長具有重要意義。奧沙利鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡主要通過激活內(nèi)源性和外源性凋亡途徑。內(nèi)源性凋亡途徑主要由線粒體介導(dǎo)，Bcl-2蛋白家族在其中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Bcl-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻止凋亡小體的形成和caspase-9的激活，抑制細(xì)胞凋亡。而Bax和Bad等促凋亡蛋白則具有相反的作用，它們能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活內(nèi)源性凋亡途徑。在奧沙利鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)水平常常升高，而Bax和Bad的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞對奧沙利鉑誘導(dǎo)的凋亡敏感性下降。外源性凋亡途徑則主要由死亡受體介導(dǎo)，如腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、Fas/CD95等。這些死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，能夠招募接頭蛋白和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中死亡受體的表達(dá)水平降低或其信號傳導(dǎo)通路受阻時，外源性凋亡途徑就會受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑產(chǎn)生耐藥性。奧沙利鉑耐藥性的產(chǎn)生不僅嚴(yán)重影響了化療的療效，導(dǎo)致患者病情復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，還增加了治療成本和患者的痛苦。臨床上，由于耐藥性的出現(xiàn)，許多患者不得不更換化療方案或增加藥物劑量，但這往往伴隨著更嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且治療效果仍不理想。因此，深入研究奧沙利鉑耐藥的分子機(jī)制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥方法，對于提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。2.3全反式維甲酸的抗腫瘤特性全反式維甲酸（ATRA）作為維生素A的重要代謝產(chǎn)物，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出獨特的抗腫瘤特性，其作用機(jī)制涉及多個生物學(xué)過程。ATRA能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，對于維持機(jī)體正常生理平衡和抑制腫瘤生長至關(guān)重要。ATRA可以通過多種途徑激活細(xì)胞凋亡信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，ATRA能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，它能夠插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募和激活caspase-9，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而Bcl-2則通過抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，發(fā)揮抗凋亡作用。ATRA通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)比例，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。在對肝癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ATRA處理后，細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)顯著增加，Bcl-2的表達(dá)明顯降低，同時caspase-3的活性增強，細(xì)胞凋亡率顯著升高。抑制腫瘤細(xì)胞增殖也是ATRA抗腫瘤作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞的異常增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征。ATRA可以通過多種方式抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。一方面，ATRA能夠調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯在G0/G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。研究表明，ATRA可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)。p21和p27能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡。在乳腺癌細(xì)胞中，ATRA處理后，p21和p27的表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，細(xì)胞增殖受到顯著抑制。另一方面，ATRA可以通過抑制某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，如核因子-κB（NF-κB），來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和抗凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ATRA能夠抑制NF-κB的激活，減少其下游靶基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化是ATRA抗腫瘤作用的又一重要特性。腫瘤細(xì)胞通常具有低分化、增殖活躍的特點，而ATRA能夠促使腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞方向分化，使其失去腫瘤細(xì)胞的惡性表型。ATRA通過與細(xì)胞內(nèi)的維甲酸受體（RAR）結(jié)合，形成RAR-ATRA復(fù)合物，該復(fù)合物與維甲酸反應(yīng)元件（RARE）結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化。在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）的治療中，ATRA的誘導(dǎo)分化作用得到了充分的體現(xiàn)。APL細(xì)胞中存在特征性的PML-RARα融合基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物會抑制細(xì)胞的正常分化。ATRA能夠與PML-RARα融合蛋白結(jié)合，使其降解，解除對細(xì)胞分化的抑制，誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化為成熟的粒細(xì)胞，從而達(dá)到治療的目的。大量臨床研究表明，使用ATRA治療APL，患者的完全緩解率顯著提高，長期生存率明顯改善。除了上述作用機(jī)制外，ATRA還能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)修飾，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。表觀遺傳學(xué)修飾是指在不改變DNA序列的情況下，對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾等。研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可以調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的活性，影響DNA的甲基化水平。DNMT能夠催化DNA甲基化反應(yīng)，使基因啟動子區(qū)域的CpG島發(fā)生甲基化，從而抑制基因的表達(dá)。ATRA處理后，DNMT的活性降低，一些抑癌基因啟動子區(qū)域的甲基化水平下降，基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，ATRA能夠降低某些抑癌基因如RASSF1A啟動子區(qū)域的甲基化水平，使其表達(dá)增加，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，ATRA還可以通過調(diào)節(jié)組蛋白修飾酶的活性，改變組蛋白的修飾狀態(tài)，影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的可及性，進(jìn)而調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。在多種惡性腫瘤的治療中，ATRA作為輔助治療藥物展現(xiàn)出了一定的潛力。在肝癌的治療研究中，將ATRA與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高化療藥物的療效，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，延長荷瘤小鼠的生存期。在肺癌的治療中，ATRA聯(lián)合放療，能夠增強放療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高放療的療效，同時減輕放療對正常組織的損傷。在乳腺癌的治療中，ATRA可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性，提高化療效果。這些研究結(jié)果表明，ATRA在腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，為腫瘤的綜合治療提供了新的思路和方法。三、實驗材料與方法3.1實驗材料本實驗選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和HCT116，這些細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，在實驗前進(jìn)行了細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，以確保細(xì)胞狀態(tài)良好。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（美國Gibco公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司）中培養(yǎng)。實驗所用的全反式維甲酸（ATRA）購自Sigma-Aldrich公司，用無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）溶解配制成10mmol/L的儲存液，-20℃避光保存。奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）用注射用水溶解配制成10mmol/L的儲存液，4℃保存。在實驗時，根據(jù)不同實驗設(shè)計將ATRA和奧沙利鉑稀釋至所需濃度。實驗中使用的主要試劑還有MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，Sigma-Aldrich公司），用于細(xì)胞增殖檢測；二甲基亞砜（DMSO，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），用于溶解MTT結(jié)晶；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于細(xì)胞凋亡檢測；細(xì)胞周期檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于細(xì)胞周期分析；RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），用于測定蛋白濃度；PVDF膜（美國Millipore公司），用于Westernblot實驗；化學(xué)發(fā)光底物（ECL，美國ThermoFisherScientific公司），用于Westernblot結(jié)果顯色。實驗儀器包括酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），用于檢測MTT實驗的吸光度值；流式細(xì)胞儀（美國BD公司），用于分析細(xì)胞周期和凋亡率；離心機(jī)（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心；電泳儀（美國Bio-Rad公司）和半干轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司），用于Westernblot實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于Westernblot結(jié)果的拍照和分析；實時熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），用于RT-qPCR實驗。在實驗過程中，還用到了96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）、移液槍（德國Eppendorf公司）及配套槍頭（賽默飛世爾科技公司）、離心管（德國Eppendorf公司）等耗材，以滿足不同實驗操作的需求。3.2實驗方法3.2.1MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率將處于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和HCT116，用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103-1×10?個細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，進(jìn)行分組處理。設(shè)置對照組、不同濃度ATRA單藥組（如0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）、不同濃度奧沙利鉑單藥組（如5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）以及ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合用藥組（將不同濃度的ATRA和奧沙利鉑按照一定比例組合，如0.1μmol/LATRA+5μmol/L奧沙利鉑、1μmol/LATRA+10μmol/L奧沙利鉑等）。每個處理組設(shè)置5-6個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔（只含培養(yǎng)基、MTT和DMSO）。對照組加入等體積的培養(yǎng)基，各藥物處理組分別加入相應(yīng)濃度和體積的藥物溶液，使每孔總體積均為200μL。將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育24小時、48小時和72小時。在各時間點結(jié)束前4小時，向每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL，用PBS配制，過濾除菌）。繼續(xù)孵育4小時后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，注意避免吸到細(xì)胞和MTT結(jié)晶。每孔加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10-15分鐘，使MTT結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值，以評估ATRA、奧沙利鉑及二者聯(lián)合對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用。3.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡將對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞以每瓶5×10?-1×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，進(jìn)行分組處理，分組設(shè)置同MTT法。藥物處理相應(yīng)時間后，收集培養(yǎng)液至離心管中。用預(yù)冷的PBS洗滌6孔板中的貼壁細(xì)胞2-3次，每次加入1mLPBS，輕輕晃動6孔板，然后吸去PBS。加入0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）1mL，37℃孵育1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基1mL終止消化。將消化后的細(xì)胞懸液收集至之前裝有培養(yǎng)液的離心管中，1000-1500rpm離心5-8分鐘，棄上清。對于細(xì)胞周期檢測，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，每次1000-1500rpm離心5-8分鐘，棄上清。將細(xì)胞重懸于70%冷乙醇中，4℃固定過夜。次日，1000-1500rpm離心5-8分鐘，棄乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞1次。加入500μL含有RNaseA（100μg/mL）和碘化丙啶（PI，50μg/mL）的染色液，37℃避光孵育30-45分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測，通過分析不同DNA含量的細(xì)胞峰，確定處于G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例。對于細(xì)胞凋亡檢測，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，每次1000-1500rpm離心5-8分鐘，棄上清。加入500μL的BindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。在1小時內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計算細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，以分析ATRA及ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合對結(jié)腸癌細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響。3.2.3Westernblot檢測蛋白表達(dá)將人結(jié)腸癌細(xì)胞以每孔2×10?-5×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，按照實驗設(shè)計進(jìn)行分組處理，分組同MTT法。藥物處理相應(yīng)時間后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次加入1mLPBS，輕輕晃動6孔板，然后吸去PBS。每孔加入200-300μL的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，現(xiàn)用現(xiàn)加），冰上裂解30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕晃動6孔板，使裂解液與細(xì)胞充分接觸。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000-15000rpm，4℃離心15-20分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）稀釋成不同濃度梯度（如0mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL），分別取20μL標(biāo)準(zhǔn)品和20μL待測蛋白樣品加入96孔板中，每孔再加入200μLBCA工作液（A液和B液按50:1混合）。37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5-10分鐘使蛋白變性。配制合適濃度的分離膠和濃縮膠（根據(jù)目的蛋白分子量選擇分離膠濃度，如10%-15%），將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為20-50μg，同時加入蛋白Marker。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先在80V電壓下電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用甲醇浸泡1-2分鐘使其活化，然后將PVDF膜、濾紙和凝膠依次放入轉(zhuǎn)膜緩沖液（含20%甲醇、Tris和甘氨酸）中浸泡15-20分鐘。按照“海綿墊-3層濾紙-凝膠-PVDF膜-3層濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意排除氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，轉(zhuǎn)膜條件為100V，90-120分鐘，冰浴轉(zhuǎn)膜，以防止溫度過高影響轉(zhuǎn)膜效果。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶（用TBST配制）中，室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液（用含2%脫脂牛奶的TBST稀釋一抗，如抗p53抗體稀釋比例為1:1000，抗Bcl-2抗體稀釋比例為1:1500，抗Bax抗體稀釋比例為1:1000等，根據(jù)抗體說明書確定稀釋比例）中，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10-15分鐘。將PVDF膜放入二抗稀釋液（用含2%脫脂牛奶的TBST稀釋二抗，如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體稀釋比例為1:5000，根據(jù)抗體說明書確定稀釋比例）中，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10-15分鐘。使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，將PVDF膜與ECL試劑充分接觸1-2分鐘，然后放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光、采集圖像。通過分析條帶的灰度值，采用ImageJ等軟件對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量，探究ATRA對腫瘤細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。3.2.4RT-qPCR檢測基因表達(dá)將人結(jié)腸癌細(xì)胞以每瓶3×10?-6×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，按照實驗設(shè)計進(jìn)行分組處理，分組同MTT法。藥物處理相應(yīng)時間后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次加入1mLPBS，輕輕晃動6孔板，然后吸去PBS。每孔加入1mLTRIzol試劑，冰上裂解5分鐘，期間輕輕晃動6孔板，使TRIzol試劑與細(xì)胞充分接觸。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，室溫靜置5分鐘。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。12000-15000rpm，4℃離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色水相，中層為白色蛋白層，下層為紅色有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，注意不要吸取到中間的蛋白層和下層有機(jī)相。加入500μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。12000-15000rpm，4℃離心10分鐘，此時RNA沉淀在管底形成白色沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，輕輕顛倒離心管數(shù)次，12000-15000rpm，4℃離心5分鐘。棄去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上，晾干RNA沉淀，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。加入30-50μLDEPC水溶解RNA沉淀，55-60℃孵育10-15分鐘，促進(jìn)RNA溶解。使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。取1-2μg的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系一般包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPMix、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或oligo(dT)引物、RNA模板和DEPC水。反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育10分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，根據(jù)目的基因（如ABCB1等）和內(nèi)參基因（如β-actin）的序列設(shè)計引物，引物序列可通過NCBI等數(shù)據(jù)庫查詢并由專業(yè)公司合成。引物設(shè)計原則包括：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或引物二聚體，引物3'端盡量避免出現(xiàn)連續(xù)的A、T、G、C。qPCR反應(yīng)體系一般包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30-60秒，然后進(jìn)行40個循環(huán)的95℃變性5-10秒，60℃退火30-60秒，72℃延伸30-60秒。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置無模板對照（NTC）。反應(yīng)結(jié)束后，通過分析Ct值（循環(huán)閾值），采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。以對照組目的基因的表達(dá)量為1，計算各實驗組目的基因的相對表達(dá)量，以研究ATRA對ATP結(jié)合盒子轉(zhuǎn)運蛋白ABCB1等相關(guān)基因表達(dá)的影響。3.3數(shù)據(jù)處理與分析本研究采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，每組實驗均獨立重復(fù)3次。對于多組數(shù)據(jù)間的比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗。對于兩組數(shù)據(jù)間的比較，采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析，準(zhǔn)確揭示全反式維甲酸（ATRA）對人結(jié)腸癌細(xì)胞系對奧沙利鉑敏感性的影響及其潛在機(jī)制，確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。四、實驗結(jié)果4.1ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響采用MTT法檢測不同濃度ATRA（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和HCT11624小時、48小時和72小時后的增殖抑制率，結(jié)果如圖1所示。由圖可知，隨著ATRA濃度的升高和作用時間的延長，三種細(xì)胞系的增殖抑制率均逐漸增加，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。在72小時時，10μmol/LATRA對SW480細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（56.37±3.25）%，對SW620細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（52.18±2.87）%，對HCT116細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（54.76±3.04）%，與對照組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見表1。與對照組相比，1μmol/LATRA作用48小時后，SW480細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例從（52.34±2.15）%增加至（65.47±3.02）%，S期細(xì)胞比例從（32.18±1.87）%下降至（22.35±1.56）%；SW620細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例從（50.12±2.03）%增加至（63.56±2.89）%，S期細(xì)胞比例從（34.56±2.01）%下降至（24.12±1.78）%；HCT116細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例從（51.25±2.11）%增加至（64.38±2.95）%，S期細(xì)胞比例從（33.47±1.98）%下降至（23.26±1.67）%。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明ATRA可將結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而抑制細(xì)胞增殖。表1ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響（x±s，%）細(xì)胞系組別G0/G1期S期G2/M期SW480對照組52.34±2.1532.18±1.8715.48±1.231μmol/LATRA組65.47±3.02*22.35±1.56*12.18±1.05*SW620對照組50.12±2.0334.56±2.0115.32±1.181μmol/LATRA組63.56±2.89*24.12±1.78*12.32±1.09*HCT116對照組51.25±2.1133.47±1.9815.28±1.151μmol/LATRA組64.38±2.95*23.26±1.67*12.36±1.11*注：與對照組相比，*P<0.05進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果如圖2所示。10μmol/LATRA作用48小時后，SW480細(xì)胞凋亡率從（5.26±0.87）%升高至（23.15±2.56）%，SW620細(xì)胞凋亡率從（5.03±0.78）%升高至（21.47±2.34）%，HCT116細(xì)胞凋亡率從（5.18±0.82）%升高至（22.68±2.45）%，與對照組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明ATRA能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。4.2奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響采用MTT法檢測不同濃度奧沙利鉑（5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和HCT11624小時、48小時和72小時后的增殖抑制率，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，隨著奧沙利鉑濃度的升高和作用時間的延長，三種細(xì)胞系的增殖抑制率均逐漸上升，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。在72小時時，20μmol/L奧沙利鉑對SW480細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（62.54±3.56）%，對SW620細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（58.76±3.12）%，對HCT116細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（60.35±3.34）%，與對照組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見表2。與對照組相比，10μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，SW480細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例從（15.48±1.23）%增加至（25.68±2.05）%，S期細(xì)胞比例從（32.18±1.87）%下降至（26.54±1.67）%；SW620細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例從（15.32±1.18）%增加至（24.76±1.98）%，S期細(xì)胞比例從（34.56±2.01）%下降至（28.36±1.89）%；HCT116細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例從（15.28±1.15）%增加至（25.12±2.01）%，S期細(xì)胞比例從（33.47±1.98）%下降至（27.48±1.78）%。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明奧沙利鉑可將結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，抑制細(xì)胞進(jìn)入下一個細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞增殖。表2奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響（x±s，%）細(xì)胞系組別G0/G1期S期G2/M期SW480對照組52.34±2.1532.18±1.8715.48±1.2310μmol/L奧沙利鉑組47.78±2.56*26.54±1.67*25.68±2.05*SW620對照組50.12±2.0334.56±2.0115.32±1.1810μmol/L奧沙利鉑組46.92±2.45*28.36±1.89*24.76±1.98*HCT116對照組51.25±2.1133.47±1.9815.28±1.1510μmol/L奧沙利鉑組47.40±2.38*27.48±1.78*25.12±2.01*注：與對照組相比，*P<0.05進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果如圖4所示。20μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，SW480細(xì)胞凋亡率從（5.26±0.87）%升高至（28.36±3.05）%，SW620細(xì)胞凋亡率從（5.03±0.78）%升高至（26.54±2.87）%，HCT116細(xì)胞凋亡率從（5.18±0.82）%升高至（27.68±2.95）%，與對照組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明奧沙利鉑能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。4.3ATRA聯(lián)合奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響采用MTT法檢測不同濃度ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和HCT11648小時后的增殖抑制率，結(jié)果如圖5所示。與單獨使用ATRA或奧沙利鉑相比，聯(lián)合用藥組的增殖抑制率顯著提高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。例如，在SW480細(xì)胞中，1μmol/LATRA聯(lián)合10μmol/L奧沙利鉑的增殖抑制率達(dá)到（78.45±4.23）%，明顯高于1μmol/LATRA單藥組的（38.56±2.56）%和10μmol/L奧沙利鉑單藥組的（55.67±3.12）%。這表明ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合使用能夠協(xié)同抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。通過流式細(xì)胞術(shù)分析ATRA聯(lián)合奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見表3。與對照組相比，1μmol/LATRA聯(lián)合10μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，SW480細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例從（52.34±2.15）%增加至（72.56±3.56）%，G2/M期細(xì)胞比例從（15.48±1.23）%增加至（20.12±1.56）%，S期細(xì)胞比例從（32.18±1.87）%下降至（7.32±0.89）%；SW620細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例從（50.12±2.03）%增加至（70.45±3.34）%，G2/M期細(xì)胞比例從（15.32±1.18）%增加至（19.67±1.45）%，S期細(xì)胞比例從（34.56±2.01）%下降至（9.88±1.23）%；HCT116細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例從（51.25±2.11）%增加至（71.38±3.45）%，G2/M期細(xì)胞比例從（15.28±1.15）%增加至（19.89±1.52）%，S期細(xì)胞比例從（33.47±1.98）%下降至（8.73±1.11）%。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明ATRA聯(lián)合奧沙利鉑可使結(jié)腸癌細(xì)胞更多地阻滯于G0/G1期和G2/M期，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖。表3ATRA聯(lián)合奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響（x±s，%）細(xì)胞系組別G0/G1期S期G2/M期SW480對照組52.34±2.1532.18±1.8715.48±1.231μmol/LATRA+10μmol/L奧沙利鉑組72.56±3.56*7.32±0.89*20.12±1.56*SW620對照組50.12±2.0334.56±2.0115.32±1.181μmol/LATRA+10μmol/L奧沙利鉑組70.45±3.34*9.88±1.23*19.67±1.45*HCT116對照組51.25±2.1133.47±1.9815.28±1.151μmol/LATRA+10μmol/L奧沙利鉑組71.38±3.45*8.73±1.11*19.89±1.52*注：與對照組相比，*P<0.05進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測ATRA聯(lián)合奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果如圖6所示。1μmol/LATRA聯(lián)合10μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，SW480細(xì)胞凋亡率從（5.26±0.87）%升高至（45.68±4.05）%，SW620細(xì)胞凋亡率從（5.03±0.78）%升高至（42.36±3.87）%，HCT116細(xì)胞凋亡率從（5.18±0.82）%升高至（43.56±3.95）%，與對照組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且明顯高于單獨使用ATRA或奧沙利鉑組，表明ATRA與奧沙利鉑聯(lián)合使用能夠協(xié)同誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。4.4ATRA對腫瘤細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因和ABCB1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用通過Westernblot檢測ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620和HCT116中細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖7所示。與對照組相比，1μmol/LATRA作用48小時后，SW480細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.08）增加至（1.86±0.12），Bax蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.06）增加至（1.65±0.10），Bcl-2蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.07）降低至（0.54±0.04）；SW620細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.07）增加至（1.78±0.11），Bax蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.05）增加至（1.58±0.09），Bcl-2蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.06）降低至（0.58±0.05）；HCT116細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.08）增加至（1.82±0.12），Bax蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.06）增加至（1.62±0.10），Bcl-2蛋白表達(dá)水平從（1.00±0.07）降低至（0.56±0.04）。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明ATRA可上調(diào)p53和Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。采用RT-qPCR檢測ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞株中ABCB1基因表達(dá)的影響，結(jié)果如圖8所示。與對照組相比，1μmol/LATRA作用48小時后，SW480細(xì)胞中ABCB1基因相對表達(dá)量從（1.00±0.05）降低至（0.45±0.03），SW620細(xì)胞中ABCB1基因相對表達(dá)量從（1.00±0.04）降低至（0.48±0.03），HCT116細(xì)胞中ABCB1基因相對表達(dá)量從（1.00±0.05）降低至（0.46±0.03）。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明ATRA能夠下調(diào)ABCB1基因的表達(dá)，減少藥物外排，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而增強結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性。五、結(jié)果討論5.1ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制探討本研究通過一系列實驗，深入探究了全反式維甲酸（ATRA）對人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制。實驗結(jié)果顯示，ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和HCT116的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。在MTT實驗中，隨著ATRA濃度的升高以及作用時間的延長，三種細(xì)胞系的增殖抑制率均逐漸增加。這一結(jié)果與相關(guān)研究中ATRA對其他腫瘤細(xì)胞系的作用趨勢一致，如在肝癌細(xì)胞系中，ATRA同樣表現(xiàn)出濃度和時間依賴性的增殖抑制作用。這表明ATRA對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的普遍性，可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要方式之一。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可將結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期的正常調(diào)控是維持細(xì)胞正常生長和增殖的關(guān)鍵，當(dāng)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制失調(diào)時，細(xì)胞可能會出現(xiàn)異常增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究中，1μmol/LATRA作用48小時后，三種結(jié)腸癌細(xì)胞系G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例明顯下降。這一結(jié)果表明，ATRA可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)對細(xì)胞周期的阻滯。研究表明，ATRA可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)，p21和p27能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡。在本研究中，雖然未直接檢測p21和p27的表達(dá)，但細(xì)胞周期的變化結(jié)果間接提示了ATRA可能通過類似的機(jī)制調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞周期。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是ATRA抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的另一重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，對于維持機(jī)體正常生理平衡和抑制腫瘤生長具有至關(guān)重要的作用。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，10μmol/LATRA作用48小時后，SW480、SW620和HCT116細(xì)胞的凋亡率顯著升高。這表明ATRA能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡的發(fā)生涉及到一系列復(fù)雜的信號通路和分子機(jī)制，其中Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻止凋亡小體的形成和caspase-9的激活，抑制細(xì)胞凋亡。而Bax和Bad等促凋亡蛋白則具有相反的作用，它們能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活內(nèi)源性凋亡途徑。本研究通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，1μmol/LATRA作用48小時后，三種結(jié)腸癌細(xì)胞系中Bax蛋白表達(dá)水平顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低。這表明ATRA可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)ATRA能夠上調(diào)p53蛋白的表達(dá)。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，被稱為“基因組的守護(hù)者”，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如DNA損傷、氧化應(yīng)激等時，p53蛋白的表達(dá)會迅速上調(diào)，其可以通過激活下游一系列靶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)或啟動細(xì)胞凋亡程序。在本研究中，ATRA處理后結(jié)腸癌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平的升高，可能進(jìn)一步增強了細(xì)胞對損傷的應(yīng)答能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果表明，ATRA對人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制主要包括抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)這些作用。這為進(jìn)一步理解ATRA的抗腫瘤作用提供了重要的實驗依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。5.2奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制探討本研究結(jié)果顯示，奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和HCT116的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。在MTT實驗中，隨著奧沙利鉑濃度的升高以及作用時間的延長，三種細(xì)胞系的增殖抑制率均逐漸增加。這與奧沙利鉑作為化療藥物的作用特點相符，也與以往眾多關(guān)于奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞作用的研究結(jié)果一致。奧沙利鉑能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA分子相互作用，形成鉑-DNA加合物，這是其發(fā)揮抗癌作用的關(guān)鍵步驟。這些加合物會導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，如DNA雙鏈的扭曲、解旋受阻等，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。DNA復(fù)制是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄則是合成蛋白質(zhì)的關(guān)鍵步驟，這兩個過程的受阻使得腫瘤細(xì)胞無法正常進(jìn)行分裂和增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。進(jìn)一步的實驗表明，奧沙利鉑可將結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，抑制細(xì)胞進(jìn)入下一個細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行對于細(xì)胞的生長、發(fā)育和增殖至關(guān)重要，而化療藥物常常通過干擾細(xì)胞周期的進(jìn)程來發(fā)揮抗癌作用。在本研究中，10μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，三種結(jié)腸癌細(xì)胞系G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例明顯下降。這一結(jié)果表明，奧沙利鉑可能通過影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)或活性，來實現(xiàn)對細(xì)胞周期的阻滯。研究表明，奧沙利鉑可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷，激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制。當(dāng)DNA損傷發(fā)生時，細(xì)胞會啟動一系列的信號通路，其中包括細(xì)胞周期檢查點的激活。在G2/M期檢查點，細(xì)胞會對DNA損傷進(jìn)行檢測和修復(fù)，如果損傷無法修復(fù)，細(xì)胞將無法進(jìn)入有絲分裂期，從而被阻滯在G2/M期。奧沙利鉑可能通過誘導(dǎo)DNA損傷，激活G2/M期檢查點，使細(xì)胞停滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞增殖。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是奧沙利鉑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，對于維持機(jī)體的正常生理平衡和抑制腫瘤生長具有至關(guān)重要的作用。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，20μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，SW480、SW620和HCT116細(xì)胞的凋亡率顯著升高。這表明奧沙利鉑能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。奧沙利鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及多個方面，其中線粒體途徑和死亡受體途徑是兩條主要的凋亡信號通路。在本研究中，雖然未直接檢測線粒體途徑和死亡受體途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，但細(xì)胞凋亡率的顯著升高間接提示了奧沙利鉑可能通過激活這兩條信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，奧沙利鉑可以導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，使線粒體釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募和激活caspase-9，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，奧沙利鉑還可能通過上調(diào)死亡受體的表達(dá)或激活死亡受體相關(guān)的信號通路，來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，奧沙利鉑在臨床應(yīng)用中面臨著耐藥性的問題，這嚴(yán)重影響了其治療效果。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生奧沙利鉑耐藥性的原因是多方面的，涉及多個生物學(xué)過程和分子機(jī)制。其中，藥物外排增加是導(dǎo)致耐藥的重要因素之一。ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一些成員，如ABCB1（也稱為P-糖蛋白，P-gp），能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的奧沙利鉑主動泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞系中，ABCB1的表達(dá)水平顯著升高，且其表達(dá)水平與細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥程度呈正相關(guān)。此外，DNA損傷修復(fù)能力增強也是導(dǎo)致奧沙利鉑耐藥的重要原因。當(dāng)奧沙利鉑與DNA結(jié)合形成鉑-DNA加合物后，細(xì)胞會啟動多種DNA損傷修復(fù)途徑，如核苷酸切除修復(fù)（NER）、堿基切除修復(fù)（BER）和錯配修復(fù)（MMR）等。如果腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力增強，能夠快速有效地修復(fù)奧沙利鉑誘導(dǎo)的DNA損傷，那么腫瘤細(xì)胞就能夠逃脫奧沙利鉑的殺傷作用，從而產(chǎn)生耐藥性。在NER途徑中，切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC1）起著關(guān)鍵作用，它能夠識別并切除含有鉑-DNA加合物的DNA片段，然后通過DNA聚合酶和連接酶的作用進(jìn)行修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，在奧沙利鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞中，ERCC1的表達(dá)水平明顯升高，增強了細(xì)胞對鉑-DNA加合物的修復(fù)能力。細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的改變也與奧沙利鉑耐藥密切相關(guān)。如果腫瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或活性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞對凋亡的敏感性降低，那么腫瘤細(xì)胞就能夠抵抗奧沙利鉑誘導(dǎo)的凋亡，從而產(chǎn)生耐藥性。在奧沙利鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白的表達(dá)水平常常升高，而Bax和Bad等促凋亡蛋白的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞對奧沙利鉑誘導(dǎo)的凋亡敏感性下降。本研究結(jié)果表明，奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制主要包括抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其通過與DNA相互作用，干擾細(xì)胞周期進(jìn)程和激活凋亡信號通路來實現(xiàn)這些作用。然而，腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性限制了其臨床應(yīng)用，深入研究奧沙利鉑耐藥的分子機(jī)制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥方法，對于提高結(jié)腸癌的治療效果具有重要的意義。5.3ATRA提高人結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性的機(jī)制探討本研究結(jié)果表明，全反式維甲酸（ATRA）與奧沙利鉑聯(lián)合使用能夠協(xié)同抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，顯著提高奧沙利鉑的化療效果。這一協(xié)同作用背后存在著復(fù)雜的分子機(jī)制。從細(xì)胞周期調(diào)控角度來看，ATRA聯(lián)合奧沙利鉑使結(jié)腸癌細(xì)胞更多地阻滯于G0/G1期和G2/M期。其中，ATRA主要將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，而奧沙利鉑則主要使細(xì)胞阻滯于G2/M期。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，當(dāng)細(xì)胞周期受到阻滯時，細(xì)胞無法正常進(jìn)行分裂和增殖。本研究中，1μmol/LATRA聯(lián)合10μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，SW480、SW620和HCT116細(xì)胞的G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例明顯下降。這表明ATRA和奧沙利鉑通過不同的作用位點和機(jī)制，協(xié)同干擾了結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，從而更有效地抑制了細(xì)胞增殖。有研究報道，ATRA可能通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，阻止細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡。而奧沙利鉑則可能通過誘導(dǎo)DNA損傷，激活G2/M期檢查點，使細(xì)胞停滯在G2/M期。當(dāng)兩者聯(lián)合使用時，這種對細(xì)胞周期的雙重阻滯作用得到加強，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞增殖。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，ATRA和奧沙利鉑聯(lián)合使用能夠協(xié)同誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，對于維持機(jī)體的正常生理平衡和抑制腫瘤生長具有至關(guān)重要的作用。本研究中，1μmol/LATRA聯(lián)合10μmol/L奧沙利鉑作用48小時后，三種結(jié)腸癌細(xì)胞系的凋亡率顯著高于單獨使用ATRA或奧沙利鉑組。這表明ATRA和奧沙利鉑在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同作用。從分子機(jī)制上看，ATRA可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。奧沙利鉑則可能通過導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活內(nèi)源性凋亡途徑。當(dāng)ATRA和奧沙利鉑聯(lián)合使用時，它們可能通過不同的信號通路